Summary
Comet assay måler DNA-brud, fremkaldt af forskellige faktorer. Hvis holdes konstant faktorer (undtagen oxidativ stress) forårsager DNA-skader, mængden af DNA-skader er en god indirekte parameter for oxidativ stress. Målet med denne protokol er at bruge komet assay til indirekte måling af oxidativ stress.
Abstract
Højere eukaryote organismer ikke kan leve uden ilt; endnu, paradoksalt nok, kan ilt være skadeligt for dem. Den ilt molekyle er kemisk forholdsvis indifferent, fordi den har to uparrede elektroner i forskellige pi * anti-bonding orbitaler. Disse to elektroner har parallelle spin, hvilket betyder at de roterer i samme retning omkring deres egne akser. Derfor er oxygen molekylet ikke er meget reaktiv. Aktivering af oxygen kan ske ved to forskellige mekanismer; enten gennem reduktion via en elektron ad gangen (monovalent reduktion) eller ved absorption af tilstrækkelig energi til at vende spin af en af de uparrede elektroner. Dette resulterer i produktion af reaktive oxidative species (ROS). Der er en række måder, hvorpå det menneskelige legeme eliminerer ROS i dets fysiologiske tilstand. Hvis ROS produktionen overstiger reparationen kapacitet, oxidative stress resultater og skader forskellige molekyler. Der er mange forskellige metoder, som oxidativ stress kan være migasured. Dette håndskrift fokuserer på en af metoderne navngivne celle gelelektroforese, også kendt som "komet assay", som tillader måling af DNA-brud. Hvis holdes konstante alle faktorer, der vides at forårsage DNA-skader, bortset oxidativ stress, mængden af DNA-skade målt ved komet assay er en god parameter for oxidativ stress. Princippet er enkelt og er afhængig af, at DNA-molekyler er negativt ladede. Et intakt DNA-molekyle har en så stor størrelse, at den ikke migrerer under elektroforese. DNA-brud, men hvis foreliggende resultat i mindre fragmenter, som bevæger sig i det elektriske felt mod anoden. Mindre fragmenter vandrer hurtigere. Som fragmenterne har forskellige størrelser det endelige resultat af elektroforese er ikke en særskilt linje, men snarere et kontinuum med form som en komet. Systemet tillader en kvantificering af den resulterende "komet" og dermed af DNA pauser i cellen.
Introduction
Comet assay blev først udviklet af svenske forskere Ostling og Johanson 1. DNA er en negativt ladet molekyle. Under elektroforese, mindre, beskadigede DNA-fragmenter rejse hurtigere mod et positivt ladet anode 2. Jo mindre DNA-fragmenter, til den hurtigere deres migrering til anoden danne en typisk "komet" med et "hoved" sammensat af intakt, ubeskadiget DNA og en "hale", der består af beskadigede DNA-fragmenter 3. Beskadiget DNA kan repareres ved forskellige mekanismer i legemet 4, som holder generering af DNA-brud rimeligt afbalanceret 5. Hvis imidlertid balancen går ind for DNA-brud, kan pauserne ophobes og i sidste ende vil bidrage til udviklingen af en sygdom.
Vores DNA lider ca. 0.000165% skader på et givet tidspunkt 6. Enkeltstrengede DNA-brud refererer til en defekt på en af de to strenge af DNA dobbelt helixhenviser dobbeltstrengede DNA-brud opstår, når begge strenge af DNA dobbelt helix er beskadiget. Der er forskellige faktorer, der kan øge mængden af DNA-brud på et givet tidspunkt, såsom alder af cellen, cigaretrøg, forskellige lægemidler eller oxidativt stress 7-9. Hvis holdes konstante alle faktorer, der fører til forbedrede DNA-brud, derefter kvantificering af DNA-brud ved hjælp af komet assay er en god indirekte parameter for oxidativ stress.
Fremgangsmåden til komet assay anvendes i stigende grad i dag i medicin herunder oftalmologi. En grund til dette er, at oxidativt stress er mere og mere anerkendt som en patogenetisk mekanisme for forskellige sygdomme 8-11 og comet assay er en fremgangsmåde, hvormed oxidativt stress kan indirekte kvantificeres.
Protocol
Undersøgelser af komet assay udført på University of Basel, blev Institut for Oftalmologi godkendt af den lokale etiske udvalg af Basel
1. Fremstilling af reagenser
- Forbered Dulbeccos phosphatbufret saltvand (PBS) (Ca ++, Mg ++ fri) opløsning ved tilsætning af PBS (1 I pakke) og 990 ml dH2O til medierne. Justere pH til 7,4. Opbevares ved stuetemperatur.
- Forberede lyserende opløsning: Til fremstilling 1.000 ml tilsættes 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) og 10 mM Trizma base (1,2 g) i dH 2 O.
- Forbered elektroforese buffer (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) ved tilsætning af 30 ml 10 M NaOH og 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs til 1500 ml dH2O og bland godt. Det totale volumen afhænger gelboksen kapacitet. Inden anvendelse måle pH i bufferen for at sikre en pH-værdi på> 13.
- Forbered neutralisering puffer indeholdende 0,4 M Tris (48,5 g sat til ~ 800 ml dH2O, justere pH til 7,5), koncentreret (& #62; 10 M HCI) i 1000 ml med dH 2 O. Opløsningen opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered farvningsopløsning. Til Ethidiumbromid (EtBr, 10x Stock, 20 pg / ml) tilsættes 10 mg EtBr i 50 ml dH2O og opbevares ved stuetemperatur. For 1x Lager - bland 1 ml med 9 ml dH 2 O. Forsigtig! Håndtag EtBr med tilstrækkelig forsigtighed, da det er et kendt carcinogen.
2. Isolering af leukocytter
- Opnå blodprøver humane (20 ml) med antikoagulerende såsom heparin med venøse punktur.
- Adskille lymfocytter ved anvendelse af en densitetsgradient celleseparator såsom Histopaque.
- Kort beskrevet fortyndes blod i forholdet 1: 1 med PBS eller RPMI (uden FBS) og lag over 600 pi celleseparator væske.
- Centrifuger 1.800 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Aspireres »buffy" coat i 3-5 ml PBS / RPMI og centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter til pelletering lymfocytterne.
- Hent lymfocytter fra lige over grænsen mellem PBS (RPMI) Og celleseparator væske ved hjælp af en pipette. Fjern leukocyt bands fra grænsefladen mellem plasma og celleseparatoren flydende lag af hvert rør og anbring i en 50 ml rør.
- Bring det samlede volumen til 50 ml med kold Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM). Vask cellesuspensionen tre gange med DMEM ved 300 xg i 10 min.
- Tælle det samlede antal celler ved anvendelse af et hæmocytometer. Suspendere cellerne i PBS og aliquote i mikrocentrifugerør ved 10 7 celler / rør.
- Pipetter 0,4 ml af celler i en 5 ml plast engangs rør. Tilsæt 1,2 ml 1% lav-geldannende temperatur agarose ved 40 ° C. Bland og hurtigt og pipetteres 1,2 ml cellesuspension på agarose-dækkede overflade af et præ-coated objektglas. Undgå at producere bobler.
- Tillad agarose til gel i ca. 2 min. Være i overensstemmelse med den tid og temperatur, der anvendes til gelering, og sikre, at agarose er helt indstillet, før nedsænkning i lyseopløsning. Efter fuldt set, dykke ind lyseringsopløsning på ~ 4 ºC.
3. Lysis og elektroforese
BEMÆRK: Den beskrevne procedure er for elektroforese under pH> 13 alkaliske betingelser.
- Efter mindst 2 timer ved ~ 4 ºC, fjerne forsigtigt glider fra lyseringsopløsning. Sted slides side om side på den vandrette gelboksen nær den ene ende, skyde dem så tæt sammen som muligt.
- Fyld buffer reservoirer med frisklavet pH> 13 elektroforese buffer indtil væskeniveauet fuldstændig dækker dias (undgå bobler over agarose).
- Lad objektglas sidde i alkalisk buffer i 20 min for at tillade afvikling af DNA og ekspression af alkali-labil skader.
- Tænd strømforsyningen til 25 volt (~ 0,75 V / cm) og justere den nuværende til 300 milliampere ved at hæve eller sænke buffer niveau. Elektroforese objektglassene i 30 minutter.
- Sluk for strømmen. Løft forsigtigt dias fra bufferen og pblonder på et dræn bakke. Dråbevis coate objektglassene med neutralisering Buffer. Tillad objektglassene til at sidde i mindst 5 min. Drain objektglas og gentag to gange mere.
- Farv dias med 80 pi 1x ethidiumbromid (EtBr) og henstår i 5 min, og derefter dyppe i afkølet destilleret vand for at fjerne overskydende pletten. Derefter placere et dækglas over dias og gemme dem med det samme. Store glider i en måned ved stuetemperatur under tørre forhold.
BEMÆRK: Andre DNA pletter (f.eks SYBR-grønt), kan også anvendes. Forsigtig! bære beskyttelseshandsker, da de fleste farvestoffer er mutagene.
4. Kvantificering af DNA-brud
- At visualisere DNA-skader, observere EtBr-farvede DNA dias under en 40X objektiv fluorescerende mikroskop.
- Vurdere DNA-skader kvantitativt i cellerne ved at måle længden af DNA migration og procentdelen af migrerede DNA (figur 1A). Kvantificere DNA-skader (figur 1B) ved bag- øjeblik og Olive-moment. Definitioner af Tail-Moment og Olive -Moment har tidligere fået 8-10.
BEMÆRK: Det er vores erfaring, det er nok til at holde fast ved en af parametrene. Cellerne fotograferet ved at indstille automatiseret værktøj, der scanner over mikroskop slide og fotografier celler. Kvantificering af DNA-brud kan gøres ved billedanalyse softwarepakker. Der er flere forskellige software pakker, der er skræddersyet til at tage billedet af cellerne og kvantificere DNA-skader. Vi anbefaler at bruge den samme software-pakke hele eksperimentet. Den laborant identificerer den intakte celle eller komet at blive scoret på computeren og klikker med musen på det. Den komet eller intakt celle er derefter automatisk scoret.
Representative Results
Skønt fremgangsmåden til comet assay gør reproducerbare resultater kan det være påvirket af en række faktorer. En af disse faktorer er, om ikke leukocytterne kryokonserveres inden lyse og gel-elektroforese, eller om dette trin udføres på frisk fremstillede leukocytter. Figur 2 viser, at gruppe 2, hvor leukocytter blev kryokonserveret inden lyse og gelelektroforese SS- DNA pauser var betydeligt højere, end i gruppe 1, hvor lyse og gel -electrophoresis blev udført på frisklavede celler.
Assayet kan også anvendes til indirekte vurdere systemisk oxidativ stress. Tabel 1 viser de beskrivende statistik for bag- øjeblik og oliven øjeblik i rygere og raske forsøgspersoner. Dataene viser, at rygning halv pakke cigaretter dagligt mere end fordobler ssDNA pauser i de cirkulerende leukocytter 9.
Figur 1. (A) viser de mikroskop anvendes under komet assay analyse. (B) Δ afbilder en typisk "komet" med en lys hoved og hale (beskadiget mindre DNA-fragmenter). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. ssDNA pauser var signifikant højere, når leukocytter blev kryokonserveret (gruppe 2), end når frisklavet leukocytter blev anvendt inden lyse og gel-elektroforese.
Discussion
Svenske forskere Ostling og Johanson var de første i deres område at bruge komet assay til at kvantificere DNA-skader i celler 1. De neutrale betingelser, at de to forskere anvendte imidlertid kun tilladt påvisning af dobbeltstrengede DNA-brud. Singh et al. Senere tilpasset analysen til brug under alkaliske betingelser, der producerede en følsom version, der kunne vurdere dobbelt- og enkeltstrengede DNA pauser og afsløre alkali-labile sites 12. Siden sin oprindelige udvikling, har analysen blevet ændret på forskellige trin for at gøre den egnet til at vurdere typer af DNA-skader i forskellige celletyper 13-15.
Som med alle teknikker, er det vigtigt at betale streng opmærksomhed på tekniske detaljer for at opnå nøjagtige resultater 16. Baseret på vores erfaringer, er de bedste resultater opnås, hvis hvert metodologisk trin-fra forberedelse løsning på komet kvantificering-udføres af ekspert laboratorie technicians. Brugen af friske og korrekt forberedt medier, passende pipettering teknikker, præcis timing og (som tidligere nævnt i resultatafsnittet) anvendelsen af frisklavet leukocytter er afgørende for, lyse og gelelektroforese for at opnå nøjagtige resultater 17.
Alle de enkelte trin i denne analyse er lige så vigtige for at opnå pålidelige resultater. 16. Generelt bedste resultater opnås, hvis hvert eneste metodiske skridt fra forberedelse løsning till komet kvantificering udføres af ekspert lab technicians.Important synes brugen af friske og korrekt forberedte medier , passende pipetteringstrin teknikker, præcis timing og som allerede nævnt i resultatafsnittet brugen af frisklavet leukocytter til lyse og gel-elektroforese for at opnå tilfredsstillende resultater fra analysen 17.
Som gør andre metoder, kometen assay teknikken har sin AdvanTages og ulemper. Bliver en følsom metode, assayet er sårbar over for faktorer (fx UV-lys), som kunne forøge DNA-brud og dermed indvirke resultater. Enhver faktor, der kan forbedre oxidativt stress, bortset fra at der er ved at blive undersøgt, bør undgås. Stressfaktorer kan øge niveauet af oxidativt stress ikke kun i leukocytter, men også i alle andre blodprodukter medier og lymfocytter. Som tidligere nævnt er der mange forskellige og mere direkte måder at måle oxidativ stress 18,19. Comet assay er en af mange metoder, som har visse fordele. Disse omfatter dets relative lave omkostninger, det lille antal celler, der kræves (<10.000 celler) og dermed de små prøver af blod, der kræves per patient, den relative korte tidsrum, der kræves til at kvantificere DNA-skader i celler (ca. 3 dage), dens følsomhed og dens udbredte anvendelse til æsler DNA-skader i forskellige celletyper. I fortiden vælger vi at arbejde med leukocytter, da vi havde erfaring med dettecelle-type og det var gældende for det særlige undersøgelse planlagt. En anden fordel ved comet assay er, at det kan anvendes til at detektere forskellige typer og niveauer af DNA-skader og kan således anvendes i forskellige andre områder af undersøgelser foruden oxidativt stress såsom DNA-reparation undersøgelser, supplering forsøg eller genotoksiske studier.
Oxidativt stress er nu anerkendt som spiller en afgørende rolle i patogenesen af flere sygdomme. Comet assay-fremgangsmåde, mens en af mange måder at måle oxidativ stress 18,19, er relativt enkel, alsidig og billig. Når mestrer, kan denne metode anvendes i alle områder inden for medicin, hvor oxidativt stress spiller rolle 8-10,20,21.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke listen over farligt affald Stiftung i Triesen Liechtenstein, for økonomisk støtte vores forskning i oxidativt stress.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
| Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
| Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
| Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
| Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
| Trizma Base | Spectrochem | ||
| Materials required for gel electrophoresis | |||
| Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
| Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
| Methanol - Qualigens | |||
| Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
| Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
| Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
| Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides | |||
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. Electromagnetic fields and DNA damage. Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).
- Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity. Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).
- Bartsch, H., Nair, J. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair. Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).
- Martin, L. J. DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).
- Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure. Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).
- Mozaffarieh, M., et al. Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients. Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).
- Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes. Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).
- Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration. Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).
- Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women. Reprod Sci. , (2014).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells). Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).
- Gaivão, I., Sierra, L. M. Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives. Front Genet. 5, 304 (2014).
- Zhang, J., et al. DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients. Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).
- Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity. Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).
- Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial. Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).
- Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group. Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).
- Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress. BioMed Res Int. , 157-547 (2013).
- Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus. Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).
- Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station. Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).
- Cabarkapa, A., et al. Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes. Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).
