Introduction
Bevægelse kontrol er en central funktion i centralnervesystemet (CNS). Motricity er den vigtigste målelige produktion af CNS-funktion og den vigtigste mulighed for enkeltpersoner at interagere med den ydre verden. Forstå principperne for motorisk funktion og de mekanismer, der ligger til grund for indlæring af en opgave motor er i øjeblikket en af de store udfordringer i neurovidenskab. Blev fundet ved erhvervelse af en ny motor opgave morfologiske, fysiologiske og molekylære forandringer. For eksempel, formen og antallet af synapser ændring i respons på faglært motor træning 1-5, og funktionelle ændringer i den synaptiske maskiner blev observeret efter motorisk læring. Synaptiske reaktioner var højere i de forbindelser af forben-repræsenterer region af uddannede motoriske hjernebark sammenlignet med utrænede halvkugle af det samme dyr eller svar fra utrænede dyr 6,7. Elektrofysiologiske observationer også foreslå, at langsigtet (LTP) og lang-term depression (LTD) ligesom mekanismer finde sted i løbet indlæring af en ny motor dygtighed, og at udvalget af synaptisk operation, som er defineret mellem de begrænsende grænser LTP og LTD mætning, er modificeret 8. Desuden er det blevet vist, at aktiviteten markører og plasticitet fremmer molekyler såsom c-fos, GAP-43, eller BDNF men også plasticitet hæmmende molekyler såsom Nogo-A display regulatoriske roller for læring-relaterede neuronal plasticitet 9-16.
Disse fremskridt i retning af en bedre forståelse af de mekanismer, der ligger til grund motorisk læring kunne kun opnås ved brug af adfærdsmæssige paradigmer, der tillader præcis kontrol med erhvervelse af en ny motor dygtighed, f.eks faglært forben vidtrækkende. Kun en velstruktureret adfærdsmæssige opgave gør det muligt at overvåge og fange korrelative ændringer, som opstår ved indlæring og udførelse af de respektive opgaver. Her visuelt demonstrere en modificeret version af den faglærte forbensingle-pellet nå opgave i rotter tilpasset fra Buitrago et al. 17 Den præsenterede paradigme tillader analyse af erhvervelse bevægelighed inden en daglig træning (inden-session), der repræsenterer den hurtige læring komponent og primær erhvervelse samt dygtige motorisk læring over flere sessioner (mellem-session), der repræsenterer den langsomme læring komponent og vedligeholdelse af den lærde opgave 18. Vigtigere er det, denne adfærdsmæssige paradigme øger sværhedsgrad og kompleksitet motorik opgave på grund af to funktioner: For det første er de rotter trænet til at vende omkring deres akse efter hvert greb og dermed at justere deres krop før næste pellet rækkevidde og forny kroppen orientering, forhindrer konstant udførelse bevægelse fra samme vinkel. Sekund, hentes pellets fra en vertikal stilling anbringes foran buret. På grund af den lille diameter af post, kan pellets let blive indledt kræver en præcis forståelse for vellykket hentning og preventing simpelt træk i pelleten mod dyret.
En sådan kompleks adfærdsmæssige test giver dybere indsigt i de mekanismer, der ligger til grund motorisk læring. Sammenlignet med mus, rotter er overlegne i deres ydeevne af komplekse adfærdsmæssige opgaver og dermed bedre egnet til komplekse paradigmer som præsenteret i denne undersøgelse. I betragtning af de stigende genetiske muligheder til rådighed for rotter 19,20, kombinationen af præcise og velkontrollerede adfærdsmæssige testmetoder med genetiske manipulationer, billedbehandling og fysiologiske teknikker udgør en kraftfuld værktøjskasse til bedre at forstå neurobiologiske grundlag for motorisk indlæring og hukommelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Veterinærkontor Canton Zürich, Schweiz.
1. Animalske Håndtering og Tilvænning
- Animal Handling
Bemærk: 5 døgn før starten af eksperimentet, udføre trin 1.1.1 dagligt.- For adfærdsmæssige eksperimenter vænne dyrene til forsøgslederen. Har dagligt håndterer sessioner der varer 10-15 min per dyr. Rengør boksen efter hver dyrets session.
- I første omgang, skal du placere forsøgslederen hånd i et bur tillader dyret at udforske og lugte til at blive fortrolig med forsøgslederen.
- Dernæst forsigtigt løfte dyret med forsøgslederen hånd på en sikker måde ved at tage fat rottens krop mellem front- og bagpoterne tillader yderligere kendskab.
- Hvert dyr vejes dagligt for at opnå en baseline kropsvægt før mad afsavn.
- Apparatur Tilvænning og Food Familiarization
- Hvert dyr vejes dagligt for at opnå en baseline kropsvægt før mad afsavn.
- Start mad rotter 3 dage før starten af pre-træning på en standard laboratorium kost fratage. Giv rotter 0,05 g mad pr 1 g legemsvægt per dag (fx en rotte vejer 200 g, start med 10 g mad). Sørg kropsvægt ikke falde mere end 10% om dagen ved at overvåge kropsvægt dagligt.
- Hvis der afholdes flere dyr i et bur, kan dominante rotter spise mere end mindre dominerende dem. Hvis legemsvægt af et dyr falder, fodre dyr individuelt i stedet for gruppen fodring. Giv vand ad libitum.
- At sætte rotten med greb apparat placere dyret ind i uddannelsen boks (Figur 1). Have sukker pellets placeret i uddannelse boksen i nærheden af den spalteåbning at sætte dyret med foderpiller. Udfør denne step 10-15 min dagligt i 3 dage.
2. Pre-træning og Motor Skill Læring
- Pre-træning
- En dag efter tilvænning, placere dyret ind i uddannelsen boksen og placere pellet nøje til slidsen åbning, så det kan nås med dyrets tunge. Udeluk dyr, der henter piller med deres forben under pre-træning
Bemærk: I denne fase, pellet hentning med tungen er afgørende og sædvanligvis dyrets foretrukne metode. Pellets bør under ingen omstændigheder gribes med forben indtil den første dag i motorisk færdighed at lære at tillade tilstrækkelig overvågning af den lærde nå opgaven. Pellet hentning med forelimb under pre-uddannelse er en udelukkelse kriterium, og i de fleste tilfælde ikke er observeret. - Undervise rotte til at enten køre til bagsiden af buret og vende tilbage til spalteåbning eller træde tilbage og dreje om sin egen akse for at modtage den næste foderpellet medtungen. Give tid til dyret at udforske buret, løber bagud og vende tilbage til spalteåbning. Hvis dyret ikke korrekt udføre opgaven, bruge en pincet til at forsigtigt bankes i slutningen bagsiden af buret og fange dyrets opmærksomhed. Når dyret er på bagsiden, bankes let på buret foran til at guide dyret til slidsen åbning.
Bemærk: Når dyret når en defineret standard værdi (f.eks 50 succesfulde pellet søgninger med tungen i mindre end 15 min), dyret er berettiget til motorens dygtighed learning fase. På dag 1 og 2 af præ-uddannelse, kan allerede skelnes elever fra ikke-elever. Ikke-elever kan udelukkes fra undersøgelsen på dette trin. Dette mindsker sandsynligheden for at have et stort antal ikke-lærende under motorisk læring trin (2.2). - Under pre-træning, mad fratage rotter på en standard laboratorium kost. Giv vand ad libitum. Overvåg kropsvægt dagligt gennem hele undersøgelsen. Gøreikke bruge samme rum til at træne han- og hunrotter. Sikre et miljø rolig og støjfri for dyret.
- En dag efter tilvænning, placere dyret ind i uddannelsen boksen og placere pellet nøje til slidsen åbning, så det kan nås med dyrets tunge. Udeluk dyr, der henter piller med deres forben under pre-træning
- Bestemmelse af Preference Paw og Motor Skill Læring
- Under det første møde i motorik læring, udskifte slide foran vinduet med et indlæg. Placer sukker pellet omkring 1,5 cm væk fra vinduet på posten, så dyret ikke kan nå pillen med sin Tunge, men kun hente den ved en præcis forben nå og gribe bevægelse.
- At håndhæve pellet hentning af forben, bruge en pincet til forsigtigt bringe pelleten tæt på dyrets mund og tilbagetrække pellet mens dyret forsøger forbruget med tungen. Udføre denne opgave gentagne gange, indtil dyret strækker ud forben og griber en pille.
- Placer stillingen centrale til vinduesåbningen. For at bestemme pote præference, omhyggeligt observere de første 10 forsøg på træning dag 1. Mere end 70% af Reaching forsøg (dvs. 7 ud af 10) skal udføres med samme forben. Hvis dette ikke opnås, fortsætte med en anden runde af 10 forsøg, indtil tærsklen på 70% er nået.
- Efter pote præference beslutsomhed, flytte posten mod foretrukne forben og tilpasse centralt på grænsen af vinduet åbning. Foretrukne pote oprettede midler stolpen forskydes i strid med den respektive pote til at tillade en optimal vinkel for at nå (figur 1B, C).
- Klassificere en retssag, der defineres som en ny pille præsenteret for dyret, så vellykket (nå, greb, hente og spise pillen), dråbe (nå, gribe og miste pellet under hentning) eller undlader (banke pellet stolpen). Bemærk ned hver retssag i dit ark og analysere de data, efter eksperimentet.
- Udfør en daglig session består af et defineret antal forsøg (f.eks 150) eller en maksimal tid (fx 1 time) for hvert dyr.
- Undersøg præcision og finjusteringaf bevægelsen ved hjælp af første forsøg analyse. Et første forsøg er defineret ved at gribe af pelleten i en enkelt monolitisk bevægelse uden afbrydelse, tøven eller gentagelse af individuelle komponenter bevægelse. Observere omhyggeligt hvert greb af rotten.
- Hvis rotten tøver eller trækker sig tilbage i løbet af en rækkevidde eller forsøger flere forsøg til korrekt forstå pillen, bemærk den respektive rettergang som succes, men ikke første forsøg. Hvis dyret med succes griber pillen i en enkelt monolitisk rækkevidde, notere det respektive retssag så vellykket første forsøg i en separat kolonne i din ark.
- Under motorik læring, mad fratage rotter på en standard laboratorium kost. Giv vand ad libitum. Overvåg kropsvægt dagligt gennem hele undersøgelsen.
- Under det første møde i motorik læring, udskifte slide foran vinduet med et indlæg. Placer sukker pellet omkring 1,5 cm væk fra vinduet på posten, så dyret ikke kan nå pillen med sin Tunge, men kun hente den ved en præcis forben nå og gribe bevægelse.
- For adfærdsmæssige eksperimenter vænne dyrene til forsøgslederen. Har dagligt håndterer sessioner der varer 10-15 min per dyr. Rengør boksen efter hver dyrets session.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket motor dygtighed købet kun opnås gennem fast praksis. Trods nøje overvejelse af alle aspekter, nogle rotter undlader at lære opgaven (figur 2). Disse "ikke-elevernes enten mangler motivation resulterer i få eller fraværende forsøg på pellet hentning fra starten af forsøget eller generelt mister interessen i at nå de pellets, der fører til stadighed mislykkede forsøg. Derimod nogle dyr viser aggressiv og over-motiveret adfærd resulterer i overilet og skyndte gribe forsøg, der fører til svigt. En tredje gruppe af mislykkede elever er de dyr, der starter med høj succesrate og ikke gør væsentlig forbedring, der fører til stagnere eller endog faldet læring kurver.
Vellykket motorik læring består af to faser: En hurtig læring komponent repræsenterer den primære erhvervelse normalt observeret inden den første dag i motorisk træning (inden-samling;
At analysere resultater i hver daglig session (inden-session analyse), dividere det samlede antal forsøg i 25 forsøg beholdere (f.eks 6 spande til 150 forsøg). Efter eksperimentet, beregning af den procentuelle forstået held pellets for hver bin ved at dividere antallet af succeser i den respektive bin med det samlede antal af forsøg med den respektive dag.
Det bør overvejes, at motorik erhvervelse kan variere mellem de enkelte dyr. Forskellige rotter har brug for forskellige antal dage at nå plateauet niveau. Således individuelle kurver læring er sædvanligly ikke så glat som den gennemsnitlige indlæringskurve.
Et andet udtryk for en vellykket motorisk læring er analysen af finjusteres motorisk læring. For at vurdere dette aspekt, vi målte antallet af pellets fattet i første forsøg under et monolitisk bevægelse uden tøven eller afbrydelse i forhold til alle held målte pellets (figur 5).
Eksemplerne i Figur 2 - 5 viser de læringskurver af 150 forstået pellets / dag i løbet af 6 dage. Dag 1 refererer til den første dag i motorisk læring.
Figur 1: Design af rotte uddannelse boks (A) Uddannelsen boks med deres respektive dimensioner.. For at undgå hentning af pellets, der blev tabt inde i boksen, er jorden af uddannelsen kammer lavet af metalstænger , Hvorigennem tabt falder piller. (B) Luk visning af slidsen åbning og stillingen. Bemærk placeringen af stillingen på linie centrale til slidsen åbning. (C) Eksempel på en rotte held gribe en pellet gennem spalten åbning. Bemærk den skiftede stillingen position og den resulterende vinkel mod dyrets foretrukne forben (i dette tilfælde til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Eksempel på et dyr, der ikke udviser succesrige erhvervelse af motoren dygtighed i løbet af 6 dage det succesrate stagnerer ca. 20% med nogen forbedring i yderligere uddannelse.
annonce / 53010 / 53010fig3.jpg "/>
Figur 3: Inden dages analyse af det samme eksempel som vist i figur 4. succesrate er opdelt i 6 placeringer af 25 pellets illustrerer forbedringen i motorisk læring gennem en enkelt daglig session. Bemærk den indledende succes hastighed i de første 25 forsøg med de første 2 dage i sammenligning med den gennemsnitlige succesrate for de respektive dage i figur 4 og den generelle forbedring i dag 1 og 2 i sammenligning med figur 4.
Figur 4:. Eksempel på et dyr med en typisk, vellykket indlæringskurve løbet på 6 dage Procentdelen af gribes held pellets (succesrate) stiger i de første 3 dage og når et plateau i løbet af de resterende dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det i denne undersøgelse paradigme er tilpasset fra Buitrago et al 18 og adskiller sig fra den klassiske single pellet nå paradigme 17 hovedsageligt i to aspekter.:
Først studerer inden-session forbedring tillader analyse af den lærde opgave inden for en enkelt dag, som kan give et andet niveau af oplysninger, såsom undersøgelse af hurtige læring komponent i forhold til den langsomme læring komponent repræsenteret ved de gennemsnitlige daglige værdier (se figur 3 og 4). Sekund, den adfærdsmæssige paradigme præsenteres her øger sværhedsgrad og kompleksitet motoriske opgave. Dyret er tvunget til at justere sin krop og nå orientering forud for hver pellet hentning. Dette forhindrer enkle gentagne udførelse bevægelse fra samme vinkel og kræver grundige rumlig orientering. Endvidere hentes pellets af en tynd lodret stilling, der er placeret foran the bur og matcher diameteren af pelleten således kræver en præcis forståelse for vellykket hentning og forebyggelse enkel trækning af pelleten mod dyret.
Et vigtigt skridt er undervisning dyret til at køre til bagsiden af buret og vende tilbage til spalteåbning under forbehandlingen træning. Antyde rotte til den ønskede placering ved hjælp af en pincet og forsigtigt at banke på buret bagpanel hjælpemidler dyret at forstå opgaven. Eksperimentatoren skal bruge dette værktøj omhyggeligt som overtapping producerer for meget støj og irriterer dyret. Når rotten er vendt tilbage til forsiden af buret, placere flere sukker pellets ved spalteåbning for dyret at vænne med smag, lugt og placering af pelleten. En anden afgørende skridt er pellet hentning med forben på den første dag af motorisk læring. Dyret ofte fortsætter forsøg på at hente pillen med tungen som lært i løbet af pre-træning. Ved hjælp af en pincet til forsigtigt bringe the pellet tæt på dyrets mund og tilbagetrækning af pelleten, mens dyr forsøg forbruget med tungen håndhæver rotte til at strække ud musens forben for vellykket pellet hentning. Målet er at gøre det muligt for dyret at forstå pellet fra tangen ved hjælp af forben og hente sukker pellet til dens udmunding. Når dette er opnået, kan piller placeres ved stolpen og pote præference bestemmelse kan evalueres. Disse to trin er de mest afgørende dele af hele eksperimentet og kræver en omhyggelig tilgang til dyret samt eksperimentatorens tålmodighed.
Det er vigtigt at bemærke, at forskelle i læring eksisterer mellem individuelle dyr og mellem køn (mænd lære langsommere end hunnerne 18) og stammer (ifølge vores observation, Sprague-Dawley rotter anvendt i denne undersøgelse og Long-Evans rotter viser overlegen læring i forhold til fx Lewis-rotter). Således, for at opfylde den udfordrende krævermenter af opgaven, kan succesrater kræve ændringer af paradigmet afhængigt af køn og stamme. For at holde variansen lave, ikke blande stammer og køn i en eksperimenterende serie.
Velstruktureret og kontrollerbare adfærdsmæssige paradigmer er af afgørende betydning for studier, der undersøger cellulære korrelater underliggende mekanismer af patologisk og fysiologisk adfærd. De mere komplekse adfærdsmæssige opgaver at rotter er i stand til at lære repræsenterer en vigtig fordel af rotter over mus. De igangværende fremskridt i teknologier til genetiske manipulationer i rotter vil tillade i den nærmeste fremtid til at udføre eksperimenter i rotter, der var indtil videre kun muligt i mus 19-21. I kombination med nye billeddiagnostiske teknologier og teknikker muliggør målrettet manipulation af neuronale kredsløb, kan adfærdsmæssige paradigmer i rotter åbne nye veje mod forståelsen af fysiologiske og patologiske principper for nervesystemets funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra den schweiziske National Science Foundation (Grant 31003A-149315-1 til MES og Grant IZK0Z3-150809 til AZ), til AZ Heidi Demetriades Foundation, at MES Det Europæiske Forskningsråd (Nogorise «) og Christopher og Dana Reeve Foundation (CDRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Training box | Self Made | ||
| Pedestal | Self Made | ||
| Sugar pellets | TSE Systems Intl. Group | 45 mg dustless precision pellets | |
| Sprague Dawley rats | 5-6 week old males | ||
| Laptop computer | Hewlett Packard | ||
| Stop Watch | |||
| Forceps | Fine Science Tools (FST) | ||
| Excel | Microsoft | ||
| Prism | GraphPad | ||
| Weighing scale | |||
| Counter |
References
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Fu, M., Zuo, Y.
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Yu, X., Zuo, Y.
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290, 533-536 (2000).
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Hess, G., Donoghue, J. P. Strengthening of horizontal cortical connections following skill learning. Nature neuroscience. 1, 230-234 (1998).
- Rioult-Pedotti, M. S., Donoghue, J. P., Dunaevsky, A.
- Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66, 198-204 (2010).
- Ghiani, C. A., Ying, Z., de Vellis, J., Gomez-Pinilla, F. Exercise decreases myelin-associated glycoprotein expression in the spinal cord and positively modulates neuronal growth. Glia. 55, 966-975 (2007).
- Josephson, A., et al. Activity-induced and developmental downregulation of the Nogo receptor. Cell and tissue research. 311, 333-342 (2003).
- Karlen, A., et al. Nogo receptor 1 regulates formation of lasting memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20476-20481 (2009).
- Kleim, J. A., Lussnig, E., Schwarz, E. R., Comery, T. A., Greenough, W. T. Synaptogenesis and Fos expression in the motor cortex of the adult rat after motor skill learning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 4529-4535 (1996).
- Mironova, Y. A., Giger, R. J. Where no synapses go: gatekeepers of circuit remodeling and synaptic strength. Trends in neurosciences. 14, 7-23 (2013).
- Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. Neuroscience. 14, 7-23 (2013).
- Zemmar, A., et al. Neutralization of Nogo-A enhances synaptic plasticity in the rodent motor cortex and improves motor learning in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 8685-8698 (2014).
- Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural brain research. 41, 49-59 (1990).
- Buitrago, M. M., Ringer, T., Schulz, J. B., Dichgans, J., Luft, A. R. Characterization of motor skill and instrumental learning time scales in a skilled reaching task in rat. Behavioural brain research. 155, 249-256 (2004).
- Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Tews, B., et al. Synthetic microRNA-mediated downregulation of Nogo-A in transgenic rats reveals its role as regulator of synaptic plasticity and cognitive function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 681-683 (2013).
