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Biology

Imagerie du trafic intracellulaire de l'APP avec la GFP photoactivable

Published: October 17, 2015 doi: 10.3791/53153
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Physiology and Pharmacology, Robarts Research Institute, Western University, 2Department of Clinical Neurological Sciences, Western University

Summary

Bien que le transport des protéines de la surface cellulaire est relativement facilement étudiée en visualisant le trafic des protéines intracellulaires est beaucoup plus difficile. Ici, nous utilisons des constructions incorporant GFP photoactivable et démontrons une méthode pour suivre avec précision la protéine précurseur de l'amyloïde à partir de l'appareil de Golgi à compartiments en aval et de suivre son jeu.

Abstract

Bêta-amyloïde (Aß) est le constituant majeur des plaques séniles trouvés dans les cerveaux de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Aß est dérivé du clivage séquentiel de la protéine précurseur amyloïde (APP) par β-sécrétase et y. Malgré l'importance de Aß à AD pathologie, la localisation subcellulaire de ces clivages ne sont pas bien établie. Travaillent dans notre laboratoire et d'autres impliquent le système endosomal / lysosomale dans la transformation d'APP après internalisation de la surface de la cellule. Cependant, le trafic intracellulaire de l'APP est relativement peu étudié.

Bien protéines de surface cellulaire sont amendable à de nombreuses techniques de marquage, il n'y a pas de méthodes simples pour suivre le trafic des protéines membranaires de l'appareil de Golgi. À cette fin, nous avons créé des constructions d'APP qui ont été marqués avec des photo-activable GFP (paGFP) à l'extrémité C-terminale. Après synthèse, paGFP a une faible fluorescence basale, mais il peut être stimulé avec 413 nm lumière to produire une forte fluorescence verte, stable. En utilisant l'appareil de Golgi marqueur Galactosyl transférase couplé à Cyan Fluorescent Protein (GalT-PCP) comme une cible, nous sommes en mesure de précision photoactiver APP dans le réseau trans-Golgi. Photo-activé APP-paGFP peut alors être suivie comme il trafique à compartiments aval identifiés par fluorescence protéines marquées marqueurs compartiment pour l'endosome précoce (Rab5), l'endosome tardif (Rab9) et le lysosome (LAMP1). En outre, l'utilisation d'inhibiteurs de la transformation d'APP, y compris la chloroquine ou la γ-sécrétase inhibiteur L685, 458, nous sommes en mesure de réaliser des expériences pulse-chase d'examiner le traitement de l'APP dans des cellules individuelles.

Nous trouvons qu'une grande partie de l'APP se déplace rapidement vers le lysosome sans apparaissant à la surface de la cellule, et est ensuite éliminé du lysosome par clivages sécrétase. Cette technique démontre l'utilité de paGFP pour suivre le trafic et le traitement des protéines intracellulaires from le Golgi à compartiments aval.

Introduction

La caractéristique de la maladie d'Alzheimer (MA) est la présence de plaques séniles et les dégénérescences neurofibrillaires (NFT) de dans le cerveau. Le constituant majeur des plaques séniles est β-amyloïde (Aß). Aß est dérivé de son précurseur; protéine précurseur de l'amyloïde (APP) 1. Le clivage de l'APP amyloïdogène commence avec élimination de l'ectodomaine de l'APP par β-sécrétase 2. Le 99 résidus fragment terminal carboxyle restant (FCT) peut être clivée par γ-secrétase pour produire Aß 3-7. Bien que de nombreuses expériences ont démontré le clivage de l'APP surface de la cellule après l'internalisation de la surface de la cellule dans le système endosomique / lysosomique, un certain nombre d'études récentes ont suggéré que le trafic intracellulaire de l'APP est également important dans la régulation de son traitement 8-11.

Il y a eu un certain nombre de tentatives de moduler les niveaux d'Aß avec des inhibiteurs de y-sécrétase et d'Aß immunotherapies. Cependant, de récents essais cliniques avec ces thérapies ont montré aucun avantage, et, dans certains cas, a causé un préjudice 12. Une stratégie inexploité pour moduler la production d'Aß est de modifier la localisation sub-cellulaire de l'APP et de l'interaction γ-sécrétase. L'appareil de Golgi, la membrane plasmique et les endosomes, lysosomes / ont tous été proposés comme lieux possibles de γ-clivage de l'APP. Recherche dans notre laboratoire suggèrent que l'APP et la γ-sécrétase sont des protéines résidentes de la membrane lysosomale 13. En outre, nous avons constaté que la lysosomales γ-sécrétase a un pH optimal acide 13. En outre, l'alcalinisation du système endosomique / lysosomique par la chloroquine ou de NH 4 Cl, on a démontré à diminuer la production de Aß 14. y-sécrétase inhibition ou KO ou Presenilin conduit à l'accumulation APP-FFC dans le lysosome 15-17. En outre, perturbant APP endocytose abaisse la production Aß 18-20.

Malgré l'importance de l'appareil de Golgi comme une station de tri pour les protéines et les protéines recyclés à partir du système endosomal / lysosomale naissantes, le trafic intracellulaire de l'APP n'a pas été étudié en détail 21. Des travaux récents ont montré que l'APP peut être recyclé dans le réseau trans-Golgi (TGN) via une interaction avec le complexe de rétromère. Régulation négative du complexe rétromère diminue la production d'Aß 8,22-24. Cependant, la sortie de l'APP de l'appareil de Golgi n'a pas été bien étudiée.

En suivant l'endocytose des protéines de surface cellulaire, tels que le récepteur de la transferrine, sont facilement marqué et suivi, suivant le trafic des protéines intracellulaires est plus difficile. En fait, peu de protéines ont eu leur trafic intracellulaire imagé. L'avènement des étiquettes protéiques fluorescents, tels que les photo-activable-GFP (paGFP), a fourni de nouveaux outils pour étudier le trafic intracellulaire. Photo-activable-GFP est une forme de GFP qui est presque invisible après la synthèse, mais développe verte (GFP) une forte fluorescence après avoir été activé par la lumière laser de 413 nm, et ce signal est stable pendant des jours 25,26. Constructions utilisant paGFP ont été utilisées pour démontrer la traite intralysosomale de la protéine lysosomale protéine de la membrane 1 (LAMP1) 25, la livraison de la surface cellulaire de la de la stomatite vésiculaire Virus Glycoprotein (VSVG, un marqueur de la voie de sécrétion) 27, et le chiffre d'affaires des peroxysomes 28 et 29 autophagosomes.

Afin de visualiser le tri des APP à partir du TGN dans les cellules vivantes, nous avons conçu plasmide exprimant les derniers 112 acides aminés de APP couplés à photo-activable (paGFP) sur l'extrémité C-terminale (ci-après paGFP-ßAPP) 30. Nous avons également procédé ces expériences avec pleine longueur APP et obtenu des résultats similaires; la construction de ßAPP est utilisé ici car il fournit des images plus lumineuses. Nous avons ensuite photo-activation et# 946; APP-paGFP seulement dans le TGN, identifié par le TGN marqueur galactosyltransférase (GalT). Bien que l'APP a été étiqueté avec paGFP de visualiser le transport axonal rapide de l'APP et de la clairance de la région périnucléaire, ceci est la première démonstration de l'APP traite d'un compartiment soigneusement définis pour une autre 11,31,32. Ici, nous démontrons précise photo-activation dans le TGN et la sortie de l'APP en compartiments aval et ensuite clivage et la clairance de 30 lysosomes. Le photo-activation précise à l'intérieur de l'appareil de Golgi est largement applicable à d'autres systèmes protéiques.

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Protocol

1. Cellule de placage et transfection

  1. Dans une hotte de culture cellulaire, plaque ~ 300.000 à ~ 500.000 SN56 cellules (une sorte cadeaux du Dr Jane Rylett) sur une boîte de 35 mm confocale à fond de verre et couvrir avec les médias pré-transfection (milieu Eagle modifié de Dulbecco, DMEM, complétée par 10% de FBS).
  2. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% à proliférer.
    Remarque: Les cellules doivent être d'environ 50% -70% de confluence avant transfection.
  3. Dans une hotte de culture de cellules, les cellules transfecter avec des plasmides exprimant une protéine fluorescente marqués marqueur TGN (Galactosyl transférase couplé à Cyan Fluorescent Protein, GalT-PCP), une protéine fluorescente étiqueté compartiment marqueur (ici, lysosome associated membrane protein 1, LAMP1, marqués avec mRFP), et la protéine d'intérêt marqués avec paGFP (ßAPP-paGFP). (Ces constructions ont déjà été décrits 30)
  4. Incuber les cellules avec un réactif de transfection et l'ADN plasmidique fou 24 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Utiliser un rapport de ~ 2 pg d'ADN de 5 pi d'agent de transfection (par exemple, Lipofectamine 2000) à meilleur équilibre de la cytotoxicité et l'efficacité de transfection. Peuvent avoir besoin d'être optimisé pour différentes concentrations réelles plasmides. Dans les expériences décrites ici, utiliser 1 ug / plat confocale de ßAPP-paGFP, 0,3 pg / plat confocale de LAMP1-mRFP, et 0,2 ug / plat confocale de Galt-PCP.
    Remarque: La quantité de plasmide utilisé dépendra de l'efficacité de transfection.
  5. Pour les lignes de cellules neuronales: Après l'étape 1.4, dans une hotte de culture cellulaire, retirer les supports pré-transfection et différencier les cellules SN56 dans 2 ml DMEM supplémenté avec 0,1% de pénicilline / streptomycine avec 1 mM dibutyryl AMP cyclique (dbcAMP) pendant 24 heures.

2. Stade Microscope Préparation

  1. Préchauffer la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 ° C. Warm-up platine du microscope avant Imaging à 37 ° C.
  2. Laver les cellules deux fois avec du PBS, enlever le support de différenciation et le remplacer par 2 ml de HBSS à 37 ° C. La place des cellules sur la platine du microscope chauffé à 37 ° C.
    Note: Les cellules sont viables pour environ 1,5-2 h dans HBSS.
  3. Laisser 5-10 min à la température de la plaque confocal à équilibrer avec la platine du microscope.

3. Photo-activation de ROI plus de l'appareil de Golgi

  1. Avec l'oculaire du microscope, trouver des cellules transfectées avec GalT-PCP, LAMP1-mRFP et ßAPP-paGFP.
    1. Utilisez une lentille à immersion d'huile avec un fort grossissement (c.-à-63X ou 100X). Pour une confirmation visuelle de la fluorescence, utiliser un filtre fixé capable de visualiser FITC (pour PCP et la fluorescence de GFP) et la rhodamine (pour mRFP fluorescence).
  2. Réglez la tranche confocale pour chaque canal à 1 um. Prenez une image basse résolution.
  3. Crop à l'image que la cellule d'intérêt.
  4. En utilisant le bouton de réglage, régler manuellementle plan focal au milieu de la cellule. Ceci est généralement la partie de la cellule dans laquelle le noyau est le plus grand.
  5. Dessinez 3-5 Régions circulaires de Loisirs (ROI) dans le TGN (GalT-PCP fluorescence).
    1. Pour dessiner ROI (par exemple dans le programme Zeiss LSM), sélectionnez le bouton «Modifier ROI 'dans la console de commande.
    2. Sélectionnez le bouton circulaire de ROI.
    3. Cliquez et faites glisser sur GalT-PCP régions positifs de la cellule.
      Note: Les paquets photo-blanchiment pour de nombreux microscopes ont cette capacité.
  6. Prenez une image de la cellule avec le ROI superposée. Enregistrer une copie des ROI pour référence ultérieure.
    1. Pour sauver le ROI à l'image, sélectionnez le bouton "Macro".
    2. Appuyez sur le bouton 'Load' pour lancer le 'CopyRoisToOverlay »(Chemin du fichier: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
      Remarque: Un microscope confocal équipé de 475 à 525 nm (PCP) passe-bande (BP), un 500-530 nm BP (GFP),et un 560 nm longue passe (LP) jeux de filtres sont nécessaires. Un laser à argon à 458 nm et émission à 488 nm et un laser HeNe de 540 nm émission est également nécessaire.
  7. Mise en place du microscope pour un cours de temps de l'eau de Javel.
    1. Régler la diode laser (25 mW 405 nm laser) pour une puissance maximale.
      Attention: la photo-activation excessive pourrait conduire à la photo-toxicité ou de dommages aux membranes cellulaires. Utilisez des lunettes de protection pour éviter d'endommager la rétine.
    2. Mise en place du microscope pour l'imagerie de 120 cycles.
      Remarque: Un cycle d'imagerie se compose de blanchiment dans le ROI et l'imagerie de la cellule entière. Ceci est un cours de temps de l'eau de Javel.
    3. Réglez le microscope pour blanchir (photo-activation), seul le ROI pour les 20-30 itérations après chaque image. Le temps de l'image et de l'eau de Javel une image peut varier. Définir un temps de retard entre les images de sorte que chaque cycle est d'environ 30 secondes.
      Remarque: La partie de l'imagerie de chaque cycle dure environ 15-30 secondes, selon la taille de l'image. Le blanchiment pour chaque ROI est d'environ 50 ms. Blanchiment de tous les 4 ROI pour 20 itérations aura 4 sec à la fin de chaque cycle de Javel / d'image.
  8. Commencez le cours du temps de l'eau de Javel.
  9. Éteignez le blanchiment après 15 min (30 cycles de l'imagerie et de blanchiment), mais continuer à prendre des images de la cellule.
    Note: Temps de 0 à 15 min est la période «d'impulsion».
  10. Continuer la capture d'images pendant 45 min (sans blanchiment), à suivre le jeu de la ßAPP-paGFP.
    Note: Temps de 15 à 45 min est la période 'Chase'.
  11. En utilisant la méthode d'analyse décrite à l'étape 6, co-localiser la protéine d'intérêt (ici, ßAPP-paGFP) avec le compartiment d'intérêt (ici, LAMP1-mRFP) en faisant surfaces à chaque canal.

4. Déterminer le compartiment aval

  1. Pour déterminer si les lysosomes (dans ces expériences) sont le dernier compartiment, ajouter des inhibiteurs de protease de membrane perméable à provoquer protéines d'accumuler dans le lysosome.
    1. Pour ßAPP, utiliser 0,5 uM L685, 458 (inhibiteur de γ-secrétase spécifique) pendant la nuit ou 100 uM chloroquine (désacidifiante lysosomes) pendant 30 min avant l'imagerie.
  2. Trouver cellules et photoactiver comme dans l'étape 3.1 à 3.8.
  3. L'image de la cellule pour un 45-minutes supplémentaires (sans photo-activation) pour déterminer où ßAPP-paGFP accumule en l'absence de clivage.
  4. Analyser la distribution de la protéine vers les lysosomes (ou autre compartiment aval) et de dégagement ultérieur selon le procédé décrit dans l'étape 6.

5. assurer l'exactitude de photo-activation dans l'appareil de Golgi

  1. HBSS Warm-up à 37 ° C.
  2. Préparer une solution à 2 ml, pour chaque plaque confocale à imager, de 66 uM nocodazole (traitement) ou le DMSO (témoin) dans HBSS.
    1. Pour une plaque confocale, une pipette 2 ml de 37 ° C HBSS et ajouter 7,96 pi de nocodazole d'un nocodazole Stock 16.60 mm.
    2. Comme un contrôle de sortelution, la pipette 2 ml de HBSS 37 ° C dans un tube de 2 ml et ajouter 7,96 ul de DMSO.
  3. Incuber les cellules dans HBSS avec nocodazole ou le DMSO pendant 5 min avant l'imagerie.
  4. Trouver cellules comme dans l'étape 3.1.
  5. Avant photoactivation, préparer le microscope pour prendre un Z-pile après la période photo-activation.
    1. Cliquez sur le bouton «Z Stack '. Démarrez le balayage XY à l'aide rapide.
    2. Ajuster le plan focal avec le réglage du microscope bouton vers le haut de la cellule. Mark Première 'Appuyez sur pour régler la première position dans la pile.
    3. Ajuster le plan focal avec le réglage du microscope bouton vers le bas (le plus proche du verre) de la cellule. Appuyez sur 'Mark Last' de mettre la dernière position dans la pile.
    4. Dans le panneau de la pile de Z, appuyez sur le bouton «Z sectionnement '. Réglez le «Interval» à 1 pm.
      Remarque: Pour une meilleure résolution spatiale empiler un intervalle de pile plus petite, mais plus d'images devrontêtre prises en allongeant la période d'imagerie pour la pile.
  6. Blanchir les cellules, comme décrit à l'étape 3/7 à 3/8. Photo-activation et de l'image à partir de 0 min à 15 min (30 images).
  7. Arrêtez imagerie après 30 images. Immédiatement enregistrer une image de la vidéo.
    Attention: Certains microscopes peuvent remplacer première vidéo si elle est pas sauvegardé avant de commencer une deuxième séquence d'imagerie.
  8. Après l'enregistrement de la vidéo, d'acquérir immédiatement un Z-pile, en utilisant les paramètres de l'étape 5.5.
  9. Co-localiser ßAPP-paGFP Galt-PCP (ou un autre marqueur de Golgi), comme décrit à l'étape 6.
    Remarque: PCP photoblanchiment rapidement et peuvent ne pas être à la fin de la période de formation d'image. Colocalisation peut ne pas être possible avec GalT-PCP. Si colocalisation est nécessaire, utiliser mRFP pour marquer GalT.

6. vésicules de filtrage et de colocalisation

  1. Utilisez un programme d'analyse (par exemple Imaris) pour rendre les surfaces du compartiment (par exemple LAMP1-RDRF) et une protéine ointérêt de f (ex-ßAPP paGFP).
  2. Entrez dans la section 'Surpass »du programme d'analyse en cliquant sur le bouton Surpass sur la barre de menu du haut.
  3. Sélectionnez le bouton de l'assistant de surface au sommet de la plus panneau de gauche (5 e bouton à partir de la gauche).
  4. Sélectionnez un canal pour filtrer vésicules (c.-à-ßAPP paGFP fluorescence, protéine d'intérêt).
  5. Effectuer soustraction de fond en soumettant le diamètre de la plus grande vésicule dans le domaine de l'assistant et cliquez sur Suivant. Le programme d'analyse sélectionne automatiquement - basé sur un seuil dérivé de la plus grande vésicule dans le domaine - un domaine dans le canal d'intérêt.
    1. Ajuster manuellement le seuil de fond pour affiner la sélection si nécessaire.
  6. Au bas de l'écran de sélection de seuil, vérifiez l'option 'objets touchants Split pour séparer les surfaces combinée.
    Remarque: Si de nombreuses vésicules sont étroitement regroupés pourGuéter, le programme d'analyse volonté de regrouper ces objets sous une surface.
    1. Choisissez 10-15 vésicules représentatifs et calculer le diamètre de la vésicule moyenne et entrez le résultat dans l'assistant.
  7. Affiner les points de semences sélectionnées en augmentant ou diminuant le seuil sur la «qualité» (intensité du canal au milieu de chaque spot).
    Remarque: Les surfaces de la chaîne d'intérêt seront créés. Affinement des surfaces sélectionnées peut être effectuée à ce stade. Vésicules de seuil sur la base du nombre de pixels dans chaque vésicule.
  8. Masquer le canal original avec cette surface. Pour masquer, sélectionnez l'onglet 4 de la gauche dans l'assistant de création de surface (de crayon).
  9. Sélectionnez 'Masque All'. Un nouveau canal avec les vésicules d'intérêt sera créé.
    Remarque: Durant le processus de masque, une option pour dupliquer le canal original est offert. Sélectionnez cette option si les données d'origine a besoin d'être sauvé.
  10. Répétez sPTE 6.1 à 6.7 pour le canal non filtré (c.-à-LAMP1 mRFP, compartiment).
  11. À la barre d'outils supérieure, sélectionnez l'outil de colocalisation.
    1. Dans le panneau supérieur, comme les histogrammes des canaux à colocalisés apparaissent, sélectionner les canaux masqués créés récemment.
    2. Sélectionnez toutes les données disponibles. Il ya pixels sombres qui sont parfois présents après analyse. Ne sélectionnez pas ces pixels dans l'histogramme, ils vont fausser les résultats.
    3. Dans le panneau extrême droite, sélectionnez «Build Coloc Manche». Cela crée une nouvelle chaîne contenant uniquement les pixels colocalisés. Les données seront dans le même panneau sous le bouton «Statistiques Channel. Les données peuvent être exportées dans un fichier CSV.
    4. Utilisez la statistique 'Pourcentage de matériel colocalisé'. Cette option tient compte de l'intensité des pixels et la taille de l'objet.

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Representative Results

Les résultats typiques montrent ßAPP laissant le TGN et apparaît à la circulation rapidement à LAMP1 (figure 1a et b). Au cours de la période photo-activation, les vésicules peuvent être vus au départ l'appareil de Golgi destiné à des lysosomes (figure 1b). Sans traitement inhibiteur, paGFP fluorescence sera visible dans les lysosomes alors qu'il est photo-activation dans le TGN. Après l'arrêt de photoactivation, la ßAPP-paGFP est rapidement éliminé du lysosome (comparer Figure 1a à 1b). Le traitement avec le nocodazole conduit à l'accumulation de l'APP à l'intérieur de la GalT-PCP compartiments marqué et empêche le trafic vers les lysosomes (figure 1c).

La mutation suédoise de l'APP (APPsw) augmente le taux de β-clivage par 10 fois 34. Avec clivage rapide de βAPPsw-paGFP, la fluorescence paGFP apparaît comme un signal de fluorescence diffuse dans le cytosol. On peut supposer que cette is le résultat du clivage de la ßAPP rapide par γ-sécrétase libérant la paGFP C-terminal dans le cytoplasme à (figure 2). En présence de l'inhibiteur de γ-sécrétase, ßAPP accumule dans les lysosomes.

Après la livraison de la ßAPP vers le lysosome, la fluorescence de paGFP est rapidement éliminé. Le temps de séjour de courte pourrait être le résultat de la traite du lysosome à un autre compartiment. A l'inverse, serait prévu par clivage de la ßAPP γ-sécrétase pour conduire à la diffusion de paGFP fluorescence de la membrane lysosomale (figure 3a). La fluorescence diffuse est plus difficile à détecter par microscopie confocale. Pour déterminer si la ßAPP est livré à un autre compartiment ou effacé, SN56 cellules ont été traitées avec un inhibiteur spécifique contre la γ-secrétase (L685, 458) ou un agent alcalinisant (chloroquine). L'addition de soit L685, 458 ou de la chloroquine a entraîné une accumulation APP dans le lysosome ( rong> Figure 3b et c).

Il est communément admis que l'APP est livré à la surface cellulaire avant d'être endocytose et traitées dans les endosomes et lysosomes 35. Cependant, dans nos cellules non traitées, de surface cellulaire ßAPP ne pouvait pas être détecté par microscopie confocale. Photo-activé ßAPP ne peut être concentrée dans une région spécifique de la membrane plasmique. Au lieu de cela, il peut y avoir une fluorescence diffuse à travers la grande surface de la membrane plasmique. Fait intéressant, un traitement inhibiteur de γ-sécrétase conduit à la ßAPP-paGFP détectable à la surface cellulaire (figure 3b). γ-sécrétase inhibiteur de traitement peut acheminer plus ßAPP à la surface cellulaire, en plus de l'inhibition de la fonction enzymatique. Par conséquent, la grande surface de la membrane de plasma se propage paGFP sur une plus grande surface et rend la détection difficile, bien que la protéine est la traite au compartiment.

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Figure 1. Imagerie le trafic de l'APP vers les lysosomes. SN56 cellules ont été transfectées avec LAMP1-mRFP, GalT-PCP, et ßAPP-paGFP. A) La cellule a été précisément photo-activés dans ROI placé sur l'appareil de Golgi (ROI notée par des cercles blancs ). La cellule était alternativement photo-activé et imagée pendant 15 min pour déterminer ßAPP-paGFP traite. Encart montre le trafic dans la zone périnucléaire de Golgi vers les lysosomes. Pixels de Co-localisé apparaissent en jaune. B) La traite d'une vésicule contenant ßAPP-paGFP vers le lysosome. Désignent des pixels jaunes et LAMP1-ßAPP paGFP colocalisation. C) SN56 cellules ont été traitées avec le nocodazole imagerie avant pour empêcher la ßAPP-paGFP sortie du TGN. Une image représentative tirée de la fin de la période photo-activation. Dans le panneau de droite, un Z-pile de la même cellule prise immédiatement après la photo-activation. Th e-GalT PCP a été fausse couleur rouge pour améliorer la visualisation des colocalisés GalT-PCP et ßAPP-paGFP. Les pixels jaunes indiquent colocalisation entre GalT-PCP et ßAPP-paGFP. Les barres d'échelle représentent 5 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. La traite des cellules βAPPsw-paGFP. SN56 ont été transfectées avec LAMP1-mRFP, GalT-PCP et βAPPsw-paGFP (ßAPP avec la mutation suédoise familiale). La mutation suédoise augmente le taux que l'APP est clivé. Les cellules ont été alternativement au sein de l'appareil de Golgi photo-activé et imagée. Une fluorescence diffuse peut être vue après paGFP est détachée de la membrane lysosomale de diffuser dans le cytoplasme. La barre d'échelle représente 5 um.53 / 53153fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Détermination de l'organite terminal. SN56 cellules ont été transfectées avec LAMP1-mRFP, GalT-PCP et ßAPP-paGFP. Après photo-activation, les cellules ont été suivis pendant 45 min supplémentaires. Les deux plus à gauche des panneaux indiquent les cellules avant photoactivation (plus à gauche) et 15 min après photoactivation (au milieu). Le panneau sur la droite indique APP fluorescence après 45 min de l'imagerie totale dans un b) inhibiteur de γ-secrétase) non traité, traité, ou c) chloroquine traité. Pointes de flèches pointent vers APP co-localisée avec LAMP1 après 45 min de l'imagerie. Les barres d'échelle représentent 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de eest la figure.

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Discussion

Cette technique décrit la photo-activation précise des protéines membranaires marqués avec paGFP dans le TGN pour visualiser le trafic et clivage subséquent. Alors que paGFP a été créée il ya une décennie 25, ceci est le premier exemple de photo-activation précise à suivre le trafic des protéines naissantes à compartiments aval. Des études antérieures utilisant APP-paGFP constructions photo-activé une région péri-nucléaire de la cellule, qui a été considéré comme l'appareil de Golgi 11. Toutefois, comme il ressort de nos micrographies, les lysosomes, les endosomes précoces et les endosomes tardifs peuvent également être trouvés dans cette région (figure 1 et la référence 30). Ces expériences ont été menées avec succès dans des cellules HEK293, des cellules COS7, des cellules neuronales, SN56 SH-SY5Y, et les neurones de souris, bien que l'efficacité de transfection des neurones de souris est faible. Des expériences similaires ont été effectuées en utilisant des constructions pleines longueur d'APP et des constructions raccourcies, qui incluent le 112 derniers acidesLes acides de l'APP, avec les sites de ß- et γ-clivage, fusionné à paGFP. Les constructions plus courts sont plus faciles à transfecter et fournir un signal de fluorescence plus élevée, et ceux-ci sont représentés sur les figures annexées. Nos constructions raccourcies manquent également de l'ectodomaine N-terminale, qui a clivages indéfinis et des signaux de tri 38. Malgré ces signaux de N-terminal et clivages, nous constatons que notre construction raccourcie a localisation similaire et la traite comme une pleine longueur APP-paGFP 30, 33.

En raison des nombreux organites dans la zone péri-nucléaire de la cellule, tous les efforts ont été déployés pour assurer l'exactitude de la photo-activation. Au cours de la période de formation d'image, la cellule et l'appareil de Golgi se déplacer. Par conséquent, les photo-activation ROI doivent être soigneusement surveillés pendant la période photo-activation et ajustées pour rester sur le dessus de l'appareil de Golgi. Microscopie confocale sont sensibles à de petits changements dans les températures. Par exemple, AC ou de chauffage évents sur la microscope pourrait se traduire par un changement du plan de formation d'image.

Afin de maintenir la cohérence entre les expériences, nous avons fixé un délai entre chaque cycle / imagerie photo-activation. Il faut du temps pour blanchir les ROI et l'image de la cellule. Selon la taille de la cellule et le nombre de ROI, le temps de blanchir et de prendre une image peut varier. Afin de maintenir la cohérence d'image en image, définir un délai de temps entre les images si chaque image, y compris le blanchiment, il faut environ 30 secondes. Résolution temporelle accrue peut être obtenue en utilisant des systèmes de détection qui emploient un formateur de faisceau (par exemple LSM5 détecteur Live). Ces microscopes pouvez l'image à 120 images / seconde sans perte de résolution.

Pour confirmer l'exactitude de la photo-activation, il est impératif d'effectuer un contrôle nocodazole. En bloquant le transport de l'appareil de Golgi lors de la photo-activation, ce qui garantit que paGFP est pas activé de manière significative dans les autres compartiments.PCP photo-blanchiment rapidement avec répétées imagerie et de blanchiment et peuvent faire colocalisation avec GalT-PCP difficile. Si la majeure partie de paGFP fluorescence reste dans la zone de Golgi, ceci peut également indiquer précis photo-activation. Alternativement, GalT peut être étiqueté avec mRFP, qui est plus stable que photo-PCP dans ces expériences.

L'amélioration de l'activation à l'intérieur de l'appareil de Golgi peut également être réalisée avec un microscope multi-photons. Bien que le plan d'imagerie confocale dans ces expériences est typiquement une tranche 1 pm, le laser pour l'imagerie et la photo-activation va passer à travers la cellule entière. Un laser multi-photons pourrait être utilisé pour ces expériences, et peut améliorer la précision dans les trois dimensions 35. Cependant, comme l'a démontré ici, une diode laser classique 405 nm est suffisante pour activer précision photo-ßAPP-paGFP dans le TGN.

Comme témoin, nous avons effectué des expériences similaires pour VSVG-paGFP fluorescence. VSVG-paGFP, qui estconstitutivement délivrée à la surface des cellules 27,37, a été visualisée être livré à certaines sous-régions de la membrane de plasma 30. Cela assure que le transport vers des compartiments intracellulaires est pas déclenchée par la sur-expression ou de la présence de l'étiquette paGFP.

Fluorescence paGFP diffuse peut être difficile à localiser par microscopie confocale. Dans notre expérience, l'APP est rapidement clivé et semble avoir une courte durée de vie comme une protéine pleine longueur à la membrane lysosomale. Ce problème est exacerbé par la mutation FAD suédoise qui accélère le taux de APP clivage 34. Pour employer la technique pour des protéines clivées rapidement, un inhibiteur est crucial pour déterminer le dernier compartiment aval. L'inhibition de la γ-secrétase par L685, 458 ou de la chloroquine conduire à une accumulation significative de l'APP dans les lysosomes; même avec la mutation suédoise.

Si trop d'inhibiteur est utilisé, cela pourrait conduire à ac intracellulairecumul de la ßAPP-paGFP, et peut conduire à des inclusions protéiques. PaGFP accumulé dans les inclusions résultats dans des inclusions de paGFP fluorescents dans la cellule avant l'expérience a commencé (nos observations non publiées, IE traitement pendant la nuit avec 40 uM chloroquine). Une concentration d'inhibiteur qui empêche le clivage de la protéine d'intérêt, mais ne conduit pas à la formation d'inclusion doit être utilisé. Over-transfection de cellules avec paGFP peut également causer des inclusions évidentes de paGFP, qui fluo, sans photo-activation. Nouvellement paGFP photo-activé sera préférentiellement le trafic vers ces inclusions et d'interférer avec l'interprétation des résultats. Lorsque la recherche de cellules à l'image, éviter des cellules avec des inclusions de paGFP évidentes. Dans notre expérience avec ßAPP-paGFP, il ya une fluorescence verte très faible dans les cellules qui expriment ßAPP-paGFP au niveau approprié. Cette faible fluorescence ne peut habituellement pas être imagé et ne peut être vu à travers l'oculaire.

(c.-à membrane plasmique) grande structure de la membrane peut être difficile à détecter. Cela peut être parce que le signal fluorescent, étant répartie sur une grande surface, on dilue ou que le profil de la membrane en coupe transversale est inférieure à la résolution du microscope confocal. Il peut être possible de contourner ce problème en utilisant l'imagerie par un microscope à épifluorescence. Cependant, cela permettra de réduire de manière significative la résolution spatiale de la technique.

Un avantage de cette technique est son applicabilité à d'autres protéines membranaires. Bien que cette technique dépend de la surexpression de plusieurs protéines, il apparaît que le trafic de la protéine ne soit pas perturbé ouvertement, comme cela a été démontré avec VSVG paGFP-et-ßAPP paGFP 30. En plus du lysosome, d'autres marqueurs du système endosomique / lysosomique ont également été utilisés avec succès. Ceux-ci comprennent Rab5-mRFP pour la fin précoceOSOME et Rab9-mchFP (cerise fluorescent protein) pour l'endosome tardif. Cette technique de microscopie puissante peut être étendue à suivre le trafic d'autres protéines de la TGN. Il pourrait également être appliqué à suivre le trafic entre les compartiments discrets fournis marqueurs des compartiments bien définis sont disponibles.

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Disclosures

Les auteurs ont aucun intérêt ou de conflits d'intérêts financiers concurrents.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dishes  Matek P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
Hanks Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-092
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Penicilin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
dibutyrl cyclic AMP Sigma  D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Heated Microscopy stage insert P PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope  Carl Zeiss with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens Carl Zeiss
L685, 458  EMD Millipore 565771 dissolved in DMSO
cholorquine  Sigma C6628  dissolved in water
Nocodazole Sigma M1404 dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide  Sigma 472301
Imaris  Bitplane with colocalization package 

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References

  1. Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
  2. Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
  3. De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
  4. Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
  5. Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
  7. Pawar, A. P., et al. Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
  8. Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
  9. Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
  10. Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
  11. Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
  12. Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
  13. Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
  14. Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
  15. Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
  16. Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
  17. Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
  18. Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
  19. Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
  20. Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
  21. Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
  22. Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
  23. Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
  24. Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
  25. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  26. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
  27. Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
  28. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
  29. Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
  30. Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
  31. Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
  32. Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
  33. Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
  34. Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
  35. Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
  36. Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
  37. Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
  38. Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).

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Biologie cellulaire numéro 104 la protéine précurseur amyloïde Photo-activable GFP Golgi lysosomes le trafic intracellulaire la maladie d'Alzheimer β-amyloïde la microscopie des cellules vivantes
Imagerie du trafic intracellulaire de l'APP avec la GFP photoactivable
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Tam, J. H. K., Pasternak, S. H.… More

Tam, J. H. K., Pasternak, S. H. Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP. J. Vis. Exp. (104), e53153, doi:10.3791/53153 (2015).

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