Introduction
ניוון מקולרי (AMD) הקשורות לגיל הוא אחד הגורמים המובילים לעיוורון באנשים מעל גיל 50 1-3. AMD יכול להיות מסווג לשתי צורות: מכולה ("יבש") AMD וneovascular ("רטוב") AMD. לשעבר מתאפיין בניוון גיאוגרפי של אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE), choriocapillaris, וקולטניים אור, ואילו האחרונים מאופיין בפלישה של כלי חריגים מדמה העין לתוך שכבות רשתית החיצוניות גורמים לדליפה, דימום, וסיסטיק, וסופו של דבר מוביל לעיוורון 1,2. של שתי צורות, AMD neovascular מהווה את רוב הפסד 1 חזון. למרבה המזל, יש טופס זה אפשרויות ניהול רבות יעילות תרופתיות, ואילו עמיתו מכולה שלה כרגע אין מוכח טיפולים רפואיים 3. יתר על כן, בגלל צורת neovascular כבר בקלות מחדש נכנעה במודל חיה, זה כבר יותר נרחב נגיש לבסיסימחקר MD לחקור את המנגנונים פתולוגיים הבסיסיים כדי לפתח טיפולים חדשניים 4.
מודל החיה הראשון של neovascularization choroidal הניסיוני (CNV) פותח על ידי אל ריאן ואח. בפרימטים לא אנושיים 5. קרע זה מודל מושרה של הקרום של ברוך באמצעות photocoagulation לייזר, מה שגרם לתגובה דלקתית מקומית וכתוצאה מכך אנגיוגנזה דומה לזה שראה בAMD neovascular. ההתקדמות ההיסטופתולוגיים של האינדוקציה הודעה לייזר-אנגיוגנזה נמצאה לחקות neovascular AMD, אשר אישר את תקפות המודל 6. פרימטים לא אנושיים להציע את האנטומיה דומה ביותר לבני אדם, אך למרבה הצער, הם יקרים כדי לשמור, לא ניתן בקלות מניפולציות גנטית, ויש לי כמובן זמן איטי של התקדמות המחלה 7. Contrastingly, מודלים של מכרסמים הם הרבה יותר יעיל וחסכוני לשמירה, ניתן להשפיע גנטי בקלות יחסית, ויש לי הרבה יותר מהר couRSE של התקדמות מחלה (יכולים להיות שנערכו ניסויים בסולם של שבועות זמן מול חודשים). ניסויים אלה צריכים להתנהל רק במכרסמים פיגמנט כקשה מאוד לדמיין בבעלי החיים לבקן.
מודל CNV מושרה לייזר עכבר, פותח לראשונה על ידי קבוצת Campochiaro בסוף שנתי ה -90 10, גדל להיות מודל החיה הדומיננטי ברוב המחקרים שנעשה לאחרונה 11-16. בשל פתוגנזה המורכבת ועדיין לא ברורה של CNV, מודל הלייזר יושם בכל ההיבטים של מחקר רטוב AMD החל חקר המנגנונים המולקולריים הנהיגה אנגיוגנזה להערכת שיטות טיפול חדשות לשימוש בבני אדם בעתיד. לדוגמא, סקוראי et al. ואספינוסה-Heidmann et al. השתמש במודל הלייזר כדי לחקור את ההשפעה של מקרופאגים על הפיתוח של CNV באמצעות עכברים מהונדסים וטיפולים תרופתיים דלדול 15, 16. גיאני et al. וHoerster et al. טומוגרפיה אופטית קוהרנטיות משומשת (אוקטובר) לתמונת CNV במאמץ לאפיין את ההתקדמות של CNV ולהשוות את הממצאים היסטופתולוגיות לממצאים ראו בהדמית אוקטובר 12,17 מושרה לייזר. לבסוף, מחקרים שכלל הזרקת זגוגית של תרופות אנטי-angiogenic שימשו כדרישות קדם לניסויים בבני אדם והיו חיוניים בפיתוח הדור הראשון של תרופות אנטי-VEGF המשמשות בניהול neovascular היום 10,18,19 AMD.
מודלים חלופיים לCNV הניסיוני לנצל שיטות ניתוחיות לגרום CNV. הליך זה כרוך הזרקת חומרים פרו-angiogenic (למשל וקטורים ויראליים רקומביננטי ביתר VEGF, הזרקת subretinal של תאי הרשתית ו / או חרוזי פוליסטירן) לחקות את ביטוי VEGF המוגבר ראה בAMD neovascular, במטרה לגרום לאנגיוגנזה 8,20. עם זאת, שיטה זו מניבה שכיחות נמוכה יותר של אופן דרסטי neovascularization; מחקרים אלה הראו כי CNV בעכברי C57 / BL6 מתרחש ב- 31% מזריקות לעומת 70% שיעור ההצלחה ~ ראה בשיטת photocoagulation הלייזר באותו הזן של עכברים 8,14. מסיבות אלה, ובהתחשב ביתרונות של שימוש במכרסמים לעומת פרימטים לא אנושיים, מודל העכבר של CNV מושרה לייזר הפך מודל החיה הסטנדרטי של CNV לניסויי מחקר AMD neovascular ביותר 8.
עין העכבר היא רקמה זעירה, עדינה לעבוד איתו. תמרון של העין כדי להמחיש את הרשתית הוא קשה ודורש הרבה תרגול עד השליטה מושגת. משימה זו היא מסובכת על ידי העובדה שהוא חייב להיות למד עם דומיננטי והיד הלא דומיננטית. יתר על כן, לאחר התנועות העדינות הנדרשות כדי להמחיש את הרשתית כבר למדו, התיאום בין שני הידיים ודוושת רגל הפעלת הלייזר הם חשובים. במאמר זה, אנו מבקשים לזקק את האתגרים של למידה כל המניפולציות הפיזיות מעורבות בproc CNV מושרה הלייזרedure למדריך שיעזור למפעילים להשיג הצלחה מהירה עם המודל הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מטופלים כל בעלי החיים בהתאם למדריך של הטיפול והשימוש בחי מעבדה 2,013 Edition, האגודה למחקר בחזון ורפואת עיניים (ארוו) דוח לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון, וכפי שאושר על ידי בעלי החיים המוסדיים טיפול ושימוש הוועדה לאוניברסיטת נורת'ווסטרן.
הערה: ההליך הבא יכול להיעשות לגמרי עם מפעיל אחד; עם זאת, הוא הרבה נערך בצורה יעילה יותר עם שני מפעילים עם המשימות לפצל בהתאם.
1. הכינו תחנת לייזר וטרום-לייזר
- מקם את הלייזר ומנורת סדק שבו זה יכול להיות נגיש בקלות. הפעל לייזר ומוגדר מראש נקבע פרמטרים (למשל 75 גודל מיקרומטר נקודה, 100 כוח mW, 100 משך אלפיות שני).
זהירות: ודא מפעיל לובש כל סימני ציוד לבעלי החיים ובטיחות לייזר מגן אישי ובטיחות לייזר רלוונטית מוצגים מחוץ לחדר ההליך.- לפני השימוש בכל חיות ניסוי, למצוא פרמטרים אידיאליים באמצעות כיול, עכבר הלא ניסיוני. פרמטרים לייזר יהיו תלויים בליזר משמש. פרמטרים אידיאליים מוגדרים על ידי הגדרת כוח הלייזר הנמוכה ביותר שאופן עקבי גורמת היווצרות "בועה" כשהתמקד כראוי. ראה וידאו לדוגמא של נגע עם היווצרות "בועה" נכונה.
- הכן את התחנה מראש הלייזר כך שהרדמה, בעלי חיים חמים, מגבוני רקמות, וכל טיפות העיניים (Tropicamide, Tetracaine, ודמעות מלאכותיות) בקלות בהישג יד למפעיל.
- ודא חיה שחמה הוא מראש מחומם לטמפרטורה לתקן (37 ° C) לפני הזרקת חומר הרדמה לעכבר ראשון כדי להימנע מהיפותרמיה המושרית הרדמה.
- הנח שלב עכבר על חם כך שהוא יכול לשמור על חום ולהישאר חם פעם הליך לייזר מתחיל.
2. עכבר הרדמה והכנה טרום-לייזר
- לפני להזריקing הרדמה, לבדוק את העין macroscopically על מנת להבטיח שאין לה עיוותים או הפרעות שלהפחית בהירות קרנית (למשל קטרקט).
- לשקול עכבר.
- שיא משקל, מין, ומספר תעודת זהות של בעלי החיים.
- שימוש במשקל, לחשב את הכמות מתאימה של הרדמה לשימוש המבוסס על הנחיות שניתנו על ידי מוסד (100 מ"ג / קילוגרם קטמין הידרוכלוריד למשל, 10 מ"ג / קילוגרם xylazine או 250 מ"ג / קילוגרם tribromoethanol; לעכבר 20 גרם להזריק 0.20 מיליליטר xylazine / קוקטייל קטמין או 0.25 מיליליטר של tribromoethanol). יש טבלה של מינונים מחושבים מראש למשקל במרווחים של 1 גרם במטרה לצמצם טעויות מתמטיות.
- עורף עכבר ולהזריק חומר הרדמה המבוססים על חישובי intraperitoneally בשלב 2.4.
- הנח את העכבר על בעלי חיים חמים ולהמתין עד עכבר הוא מורדם לחלוטין על ידי בדיקת רפלקס הדוושה באמצעות קמצוץ הבוהן (כ 3-5 דקות).
- להפשיל רקמה לנגב ולהגן על אזור האף של העכבר כדי למנוע aspiratיון של גליל-מנוזל. עכבר מתגלגל על הצד שלה ומניח את ירידה (כ -30 μl) של hydrochloride tetracaine לכל עין להרדמה מקומית. חכה 2 דקות לפתרון ייכנס לתוקף.
- חזור על שלב 2.7 עם ירידה של Tropicamide האקטואלי אחת להתרחבות אישונים. לחלופין, להשתמש hydrochloride phenylephrine (2.5%) להתרחבות.
- חכה 2 דקות לפתרונות לתוקף; לשמור על בעלי חיים על חם בזמן הזה.
- לאחר הזמן מתאים שחלף, המקום במהירות העכבר על הבמה העכבר ולמקם את הבמה על שאר סנטר של מנורת סדק.
- הפעל מנורת סדק לבהירות האור הנמוכה ביותר ולבדוק את מידת התרחבות אישונים. אם התלמיד אינו מספק מורחב (כ 2.5-3 מ"מ), לחזור לעכבר חיה חמה ולחכות. לחלופין, לנהל עוד טיפה של Tropicamide. ברגע שהעין היא מספיק מורחבת, המשך להליך לייזר.
3. לייזר נוהל
הערה: ודא p האחרersons בחדר ללבוש משקפי מגן כאשר ממנורת סדק עין-חתיכה-מוגן לייזר
- התאם את המיקום של עכבר על עכבר השלבים, כך שהוא ממוקם באופן אידיאלי להדמיה של עצב ראייה (ראה 3.1.2).
- כוון את העכבר למחזיק בה כך שזה טמון במאוזן, מאונך לשסף את מנורת קרן, עם הראש בצד אחד וזנב בקצה השני. מיקום אידיאלי עכבר יגרום להדמיה עצב ראייה הרבה יותר קלה ברגע שהכיסוי להחליק מיושם.
- מעט להפוך את העכבר כך שהוא בזווית של ° ~ 170 עם הראש קרוב יותר למפעיל לייזר.
- ודא העכבר כי הוא קרוב ככל האפשר לשסף את המנורה, אך עדיין במצב שבו הוא יציב ובו ידו של המפעיל תהיה מספיק מקום למניפולציה עדינה.
- לאחר העכבר ממוקם באופן אידיאלי, למקם ירידה של פתרון דמעה מלאכותי אחד על coverslip זכוכית x 25 מ"מ 25 מ"מ.
- מניחים טיפה אחת של פתרון דמעה מלאכותי על מול של העכברעין osite - יבטיח עין זה התייבשות והיווצרות קטרקט עיכוב עזרה.
- החזק פינת coverslip בין אצבעות אגודל ומצביע; עמדה כך שהזכוכית נדחקה בין טיפים של שני האצבעות.
- בעדינות לעטוף שלוש אצבעות שנותרו סביב גופו של בעל החיים לתמיכה וייצוב יד. מיקום יד כדי שcoverslip הזכוכית ניתן להציב בקלות בעין של העכבר.
- הקפד שפרק כף היד הוא התייצב על משטח יציב כדי להפחית יד רעד.
- ברגע שמצב יציב מתקבל, לחץ בזהירות coverslip זכוכית (עם ירידה של דמעה מלאכותית עדיין דבקה) על העין של העכבר.
- ודא coverslip ממוקם כניצב ככל האפשר לקרן הלייזר על מנת למנוע פיזור קרן לייזר או השתקפות. Coverslip פועל כעדשת מגע כדי לשטח את הקרנית.
- להסתכל דרך מנורת סדק ועם יד חופשית לעבור להתמקד UNTניתן דמיין רשתית il. הרשתית תהיה בצבע בהיר-צהוב / אדום בהתאם למיקום דמיין, כלי ברורים, אדומים יהיו גלויים.
- לאט ובזהירות לתפעל את הראש עכבר ו / או coverslip עד לדמיין את עצב הראייה. עצב הראייה יהיה בצבע צהוב עם כלי מרובים קורנים ממנו.
- ברגע שהמפעיל אישר הדמיה של עצב ראייה, להפעיל לייזר מתמקד קרן.
- ברגע שקרן לייזר הופעלה, לתמרן לייזר מתמקד קרן למיקום רצוי (כ קוטר דיסק 1 מעצב הראייה).
- קרן לייזר להתמקד על הרשתית של העין קרקעית העין. מיקוד נכון מושגת על ידי בעל קרן לייזר החדה והברורה ביותר. אם מכוון את האלומה נראה סגלגל או מחוץ לפוקוס, פוקוס לעבור מנורת סדק או coverslip זכוכית מחדש את העמדה.
- ברגע שהקרן מכוונת היא על הרשתית ממוקדת, ליזום ממשל לייזר באמצעות הדק הרגל של הלייזר.
- הקפד להימנע כלי רשתית כדי למנוע התוך עיני שהואmorrhage.
- צפה להופעתו של בועה מייד לאחר מתן לייזר. קווי המתאר של יריית הלייזר צריך להיות ברורים ולא מעורפלים בכל דרך.
- אם ירה הלייזר אינו גורם להיווצרות בועה, או אזור של השפעה נראה מעורפל (מראה מעונן עם גבול מעגלי מעורפל לעומת גבול ברור ומוגדר בצורה חדה של השפעה מוצלחת), או אם דימום נראה לאחר מתן לייזר, לא כוללים נגעים אלה לניתוח בעתיד.
- חזור על שלבים 3.10-3.12 לכל העמדות הרצויות CNV (בדרך כלל בגיל 3, 6, 9, ו -12 עמדות שעה סביב עצב ראייה). אם זירוזי לייזר מוחלים על כ אותו מרחק מעצב ראייה, ולמקד לא צריך להיות הכרחי. עם זאת, בשל העקמומיות החזקה של העין העכבר ווריאציות קטנות שעשויות להתקיים ברשתית, ממקד מחדש את הקרן עשויה להיות נחוץ בין ממשלי לייזר ברציפות.
- שיא במחברת המיקום ותוצאה של דוארממשל לייזר אח ירייה ותוצאה (מוצלח, מעורפל, דימום, וכו '.) של כל ירייה מנוהלת לעין. הקפד למקם את הלייזר במצב המתנה כאשר אינו בשימוש.
- חזור על 3.1-3.14 לעין אחרת של העכבר, במידת הצורך, תוך שימוש ביד הנגדית לייצוב וcoverslip חדש.
- אחרי הכל יריות הלייזר הרצוי מנוהלות, לכבות את הלייזר ומנורת סדק.
- בטל עכבר coverslip ומניחים על חם להתאוששות מן ההרדמה. Macroscopically לבדוק עין לכל פגיעה ומניח ירידה של פתרון דמעה מלאכותי כדי לשמור על עין התייבשות ואפשרות למנוע התפתחות קטרקט בעתיד. ברגע שהעכבר מתאושש מהרדמה, לחזור לכלוב.
| Avertin | Avertin | Avertin | XYL / KET | XYL / KET | |
| עכבר משקל (גרם) | מנה (מ"ג / קילוגרם) | מנה הרדמה (מיליליטר) | מנה (מ"ג / קילוגרם) | מנה הרדמה (מיליליטר) | |
| 15 | 250 | 20 | .1875 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.15 |
| 16 | 250 | 20 | 0.2 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.16 |
| 17 | 250 | 20 | .2125 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.17 |
| 18 | 250 | 20 | 0.225 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.18 |
| 19 | 250 | 20 | .2375 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.19 |
| 20 | 250 | 20 | 0.25 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.2 |
| 21 | 250 | 20 | .2625 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.21 |
| 22 | 250 | 20 | 0.275 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.22 |
| 23 | 250 | 20 | .2875 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.23 |
| 24 | 250 | 20 | 0.3 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.24 |
| 25 | 250 | 20 | .3125 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.25 |
| 26 | 250 | 20 | 0.325 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.26 |
| 27 | 250 | .3375 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.27 | |
| 28 | 250 | 20 | 0.35 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.28 |
| 29 | 250 | 20 | .3625 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.29 |
| 30 | 250 | 20 | 0.375 | 100 מ"ג / קילוגרם קטמין; 10 מ"ג / קילוגרם xylazine | 0.3 |
טבלת 1: תרשים XyIKet מינון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כימות של נגעי CNV יכולה להתבצע באמצעות ניתוח של choroids רכוב השטוח באמצעות מכתים immunofluorescence לתייג כלי CNV. שתי שיטות הנפוצות ביותר המועסקות של הכנת רקמה הן תיוג FITC-dextran, נעשה באמצעות זלוף מייד לפני הקרבת בעלי חיים, או חיסוני מכתים שלאחר המוות עם סמן תא אנדותל. שתי שיטות אלה תוארו בעבר בפירוט 13,14,21; איורים 1 ו -2 דוגמאות מופע של כל אחד, בהתאמה. לאחר רכישת confocal תמונה מיקרוסקופית, או אזור (2-ממדים) או נפח (3-ממדים) יכולים להיות מחושבים ומדמיינים עם תוכנת ImageJ או Volocity. בנוסף לכימות, ההדמיה אוקטובר ניתן להשתמש כדי להמחיש את נגע CNV in vivo. דוגמא של תמונת חתך רוחב של הרשתית עם CNV התוצאה מוצגת באיור 3.
LT = "איור 1" src = "/ קבצים / ftp_upload / 53502 / 53502fig1.jpg" />
איור 1:. CNV זלוף מכתים ושטח (2D) לדוגמא חישוב (25x) (א) dextran FITC perfused נגע CNV. שיטת כימות אזור ImageJ (ב) באמצעות סף. זן עכבר:. C57BL / 6J אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: CNV Immunostaining ונפח (3D) דוגמא חישוב (25x) (א) isolectin נגע CNV GS-IB4 מוכתם.. שחזור (B) 3D של נגע CNV en פנים נוף. מבט מצד שחזור (C) 3D (B ו- C רוחב אריח אחד = 35 מיקרומטר). זן עכבר: C57BL / 6J."Target =" _ g2large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. יזואליזציה אוקטובר חתך CNV () אוקטובר en פנים נוף של נגע CNV. B-סריקת חתך אוקטובר של רשתית עם CNV (ב ') בעיגול צהוב. זן עכבר:. C57BL / 6J אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם גורמים רבים שיכולים להשפיע על אספקת לייזר והתפתחות נגע CNV תוצאה לאחר לייזר אינדוקציה מוצלחת. גורמים אלה צריכים להיות מבוקרים ולטופלו על מנת לקבל את התוצאות הכי אמינות. הרלוונטי ביותר של גורמים אלה הם בחירת עכבר (גנוטיפ, גיל, ומין), בחירת חומר הרדמה, והגדרות לייזר.
מודל העכבר הספציפי בשימוש יכול להיות השפעה משמעותית על מהלך התפתחות CNV. גנוטיפ ביותר בשימוש נרחב הוא עכבר C57BL / 6. הספק שממנו בעלי החיים מתקבלים יכול להשפיע על גודל CNV תוצאה. עניי et al. הראה הבדלים משמעותיים בגודל נגע CNV סופי בC57BL עכברים / 6 מג'קסון, צ'ארלס ריברס, ומעבדות Taconic, עם עכברים מTaconic פיתוח CNV הגדול יותר באופן משמעותי משני ספקים האחרים 4. לכן, רכישה מחברה אחת ומשתמש בכל העכברים מאותו הספק תעזור למזער הבדלים חיצונייםבגודל נגע CNV. גיל ומין של העכבר גם הוכח להיות גורם חשוב לשקול בעת תכנון הניסוי. נקבות עכברים לפתח יותר מ CNV עכברי זכרי הבנים אותו הגיל, ועכברים מבוגרים משני המינים לפתח יותר CNV מעכברים צעירים 22,23. בהתאם לפרמטרים של הניסוי, מפעילים צריכים לשמור גורמים אלה בחשבון. לדוגמא, אם מפעילים משתמשים בהליך הלייזר CNV להבהיר מטרות מכניסטית ופיתוח תרופות, יש להשתמש בשני המינים בגילים שונים להגדיר מנגנונים ספציפיים למינים ואלה שאינם.
הרדמה נכונה היא שלב קריטי בהליך זה, במיוחד בתהליך הלמידה. רוב המשטרים אושרו IACUC יכולים לגרום להרדמה לפחות 15-30 דקות, וזה יותר ממספיק זמן כדי לספק לכל עין 4-5 יריות לייזר פעם אחת את ההליך כבר שולט. עם זאת, אם יותר מדי זמן שחולף, הרדמה יכולה להוביל לעננות בעדשה הפיכה, מחדשndering עין אופטית אטום למשך 24 CNV הניסיוני. שני הפרוטוקולים העיקריים המשמשים להרדמה הם לגרום xylazine / קוקטייל קטמין או tribromoethanol (TBE) נמסר intraperitoneally. למרות כמה דיווחים מניחים את היתרונות של TBE לxylazine / קטמין במונחים של היווצרות קטרקט, שני סופו של הדבר לגרום להתפתחות של עדשת מעונן אם המפעיל לא עובד במהירות 14. אחת דרכים להאריך את הזמן לפני פיתוח קטרקט היא לשמור על לחות של העין, כאמור בפרוטוקול מפורט, דרך יישום של דמעות מלאכותיות 25. שיטה זו, ללא קשר לחומר הרדמה משמש, אמורה לעזור לעכב היווצרות קטרקט ולתת למפעיל יותר זמן כדי להשלים את ההליך.
הגדרות לייזר יכולות להיות גורם מרכזי באינדוקציה אמינה של CNV. כיול כוח הלייזר ומשך הוא צעד ראשוני חשוב לפני ביצוע ההליך בחיות ניסוי. יריות לייזרשדימום הסיבה או מחוץ לפוקוס ללא היווצרות בועה צריך להיות מחוץ חישוב, כמו זה משבש את תהליך הפיתוח של CNV. אם כלי מרובים מקרע גורמים דימום מפוזר, צריכה להיות מחוץ לכל עין. באופן אידיאלי, יש להשתמש בכח הנמוך ביותר ומשך קצר של לייזר שאופן עקבי נקרע הקרום של ברוך גורם היווצרות בועה ונגע בתיחום ברור 4. פרוטוקולי ניסויים עם הגדרות כוח שונות הוכיחו כי גדלה כוח ומשך הובלה לנזק לרקמות מופרזות ושיעורים נמוכים יותר של היווצרות לאחר מכן CNV 4, 14,17. יתר על כן, מיקום של פגיעת הלייזר יכול להשפיע גם על פיתוח CNV. השפעות נמסרו כ 1 קוטר דיסק (DD) מהדיסק האופטי הניבו שטח גדול יותר באופן משמעותי מאלה כרכי CNV נמסרו <1 DD או 2 או יותר דוקטורים לתיאולוגיה משם 23. בהתאם לניתוח שלאחר הלייזר, מיקום נגע עשוי או לא עשוי להיות מכריע. לדוגמה,אם תמונת אוקטובר היא שיתקבל מכל הנגעים, מיקום מרכזי בעצב הראייה הוא חיוני. Contrastingly, אם נגעים הם להיות מנותחים באמצעות הר שטוח, מיקום נגע אינו קריטי. לבסוף, להבטיח כי היריות האחרונות לא ממוקמות קרובה מדי זה לזה או אחר שני נגעים עלולים "לגדול" יחד.
Assay CNV הוא שיטה חזקה ללמוד AMD neovascular בניסוי. אנגיוגנזה נובעת מאינדוקצית לייזר דומה במיקום ובמראה כללי לאנגיוגנזה נצפתה בחולי AMD אנושיים. עם זאת, זה רחוק מלהיות מודל מושלם. בניגוד לעין האנושית, אין לי עכברים המקולה מוגדרת, ואנגיוגנזה הקשורות לפגיעה החריפה ראתה במודל CNV מושרה הלייזר שונה במהותו מהפתולוגיה השפיעה גנטי, הכרונית של AMD 7,8,14. סביבת רשתית העכבר היא בריאה ואנגיוגנזה התוצאה מתרחשת כתגובה לטראומה שנגרמה על ידי השפעת הלייזר, ולא גנטי / הגורמי nvironmental וגיל, כמו בAMD האנושי. Contrastingly, סביבת רשתית האנושית בAMD היא במצב של דלקת כרונית, שבמהלכו חריגות בביטוי VEGF וציטוקינים אחרים סיבת CNV 3. ברור, פיתוח neovascular בשתי הסביבות הללו הוא שונה במידה ניכרת.
לסיכום, פרוטוקול CNV מושרה הלייזר הוא אחד שהוא קשה בהתחלה לבצע אבל סופו של דבר מתגמל לאדון. המיומנות העדינה הדרושה כדי להחזיק את העכבר וcoverslip, כמו גם לתפעל את ראש coverslip ועכבר כדי להמחיש את עצב הראייה הן תרגילים שדורשים סבלנות ותרגול, במיוחד משום שהם צריכים להתבצע גם באמצעות שני ידיים של המפעיל. עם זאת, ברגע שהטכניקה למדה שזה יכול להיות דרך יעילה ליישום CNV הניסיוני ויכול להיות מיושם על רוב ההיבטים של מחקר AMD neovascular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% Tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% Tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 G insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
References
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L.
- Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Poor, S. H., et al. Reliability of the Mouse Model of Choroidal Neovascularization Induced by Laser Photocoagulation. IOVS. 55, 6525-6534 (2014).
- Ryan, S. J. The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration. Trans Am Ophthalmol Soc. 77, 707-745 (1979).
- Miller, H., Miller, B., Ishibashi, T., Ryan, S. J. Pathogenesis of laser induced choroidal subretinal neovascularization. IOVS. 31, 899-908 (1990).
- Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molr Aspects Mede. 33, 487-509 (2012).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal Models of Choroidal and Retinal Neovascularization. Prog Retin Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Zeiss, C. J. REVIEW PAPER: Animals as Models of Age Related Macular Degeneration An Imperfect Measure of the Truth. Vet Pathol Online. 47, 396-413 (2010).
- Tobe, T., et al. Targeted Disruption of the FGF2 Gene Does Not Prevent Choroidal Neovascularization in a Murine Model. Am J Pathol. 153, 1641-1646 (1998).
- He, L., Marneros, A. G. Macrophages Are Essential for the Early Wound Healing Response and the Formation of a Fibrovascular Scar. Am J Pathol. 182, 2407-2417 (2013).
- Hoerster, R., et al. In vivo and ex vivo characterization of laser induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Jawad, S., et al. The Role of Macrophage Class A Scavenger Receptors in a Laser Induced Murine Choroidal Neovascularization Model. IOVS. 54, 5959-5970 (2013).
- Lambert, V., et al. Laser induced choroidal neovascularization model to study age related macular degeneration in mice. Nat Protocols. 8, 2197-2211 (2013).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage Depletion Inhibits Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3578-3585 (2003).
- Espinosa Heidmann, D. G., et al. Macrophage Depletion Diminishes Lesion Size and Severity in Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3586-3592 (2003).
- Giani, A., et al. In Vivo Evaluation of Laser Induced Choroidal Neovascularization Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography. IOVS. 52, 3880-3887 (2011).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF Is Major Stimulator in Model of Choroidal Neovascularization. IOVS. 41, 3158-3164 (2000).
- Reich, S. J., et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molr Vis. 9, 210-216 (2003).
- Baffi, J., Byrnes, G., Chan, C. C., Csaky, K. G. Choroidal Neovascularization in the Rat Induced by Adenovirus Mediated Expression of Vascular Endothelial Growth Factor. IOVS. 41, 3582-3589 (2000).
- Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. JoVE. , 2563 (2011).
- Espinosa-Heidmann, D. G., et al. Age as an Independent Risk Factor for Severity of Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 43, 1567-1573 (2002).
- Zhu, Y., et al. Improvement and Optimization of Standards for a Preclinical Animal Test Model of Laser Induced Choroidal Neovascularization. PLoS ONE. 9, e94743 (2014).
- Weinstock, M., Stewart, H. C. Occurrence in rodents of reversible drug induced opacities of the lens. British J Ophthalmol. 45, 408-414 (1961).
- Ridder III, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of Cataract Development in Anesthetized Mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
