Introduction
Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) 50 1-3 yaş üstü bireylerde körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. AMD iki formda sınıflandırılabilir: atrofik ("kurutmak") AMD ve neovasküler ("ıslak") AMD. Eski ikinci sızıntı, kanama ve fibrozis neden dış retina katmanlarının içine koroid anormal damarların işgali ile karakterize edilirken, retina pigment epiteli (RPE), koriokapillaris ve fotoreseptör coğrafi atrofi ile karakterize ve sonuçta bir körlük 1,2 yol açar. İki formları, neovasküler AMD görme kaybı 1 çoğunluğu oluşturuyor. Onun atrofik muadili şu anda hiçbir tıbbi tedaviler 3 kanıtlamıştır oysa Neyse ki, bu form sayısız etkili farmakolojik tedavi seçenekleri vardır. Neovasküler formu kolaylıkla bir hayvan modelinde yeniden teslim oldu edilmiştir çünkü Ayrıca, temel A'ya daha yaygın olarak erişilebilir olmuşturYeni tedaviler 4 geliştirmek için altta yatan patolojik mekanizmaların keşfetmek MD araştırma.
Deneysel koroid neovaskülarizasyon (KNV) ilk hayvan modeli Ryan ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. insan olmayan primatlar 5. Neovasküler AMD görülene benzer anjiyojenez ile sonuçlanan bir lokal enflamatuar bir yanıt neden olduğu lazer fotokoagülasyon ile Bruch zarının Bu model bağlı kopma. Anjiyogenez sonrası lazer indüksiyon histopatolojik ilerleme modelinin geçerliliğini 6 doğruladı neovasküler AMD, taklit bulunmuştur. Insan olmayan primatlar insanlara en çok benzeyen anatomi sunuyoruz, ama ne yazık ki, kolayca genetik manipüle edilemez, bakımı pahalı ve hastalığın ilerlemesi 7 yavaş bir zaman kursumuz var. Buna karşın bir, kemirgen modelleri çok daha düşük maliyetli sürdürmek, genetik göreli kolaylıkla manipüle edilebilir, ve cou hızlı bir çok şey varhastalık ilerlemesinin rse (deney ay karşısında haftalık bir zaman ölçeğinde yapılabilir). Bu albino hayvanlarda görselleştirmek için çok zor olduğu gibi bu deneyler sadece pigmentli kemirgenlerde yapılmalıdır.
İlk sonlarında 90 en 10 Campochiaro grubu tarafından geliştirilen fare lazer kaynaklı CNV modeli, son çalışmalar 11-16 çoğunda baskın bir hayvan modeli olarak büyümüştür. Nedeniyle CNV karmaşık ve hala belirsiz patogenez, lazer modeli gelecekte insan kullanımı için yeni tedavi modaliteleri değerlendirmek için anjiyogenez sürüş moleküler mekanizmaları inceleyerek kadar ıslak AMD araştırma tüm yönleriyle uygulanmıştır. Örneğin, Sakurai ve diğ. ve Espinoza-HEIDMANN ve diğ. transgenik fareler ve farmakolojik tükenme tedavileri 15, 16 kullanılarak KNV gelişimi üzerine makrofajlar etkisini araştırmak için lazer modeli kullanılır. Giani ve ark. ve Hoerster diğ. görüntüye kullanılan optik koherens tomografi (OCT) lazer kaynaklı KNV ilerlemesini karakterize ve Ekim görüntüleme 12,17 görülen bulgulara histopatolojik bulguları karşılaştırmak için bir çaba CNV. Son olarak, anti-anjiyogenik ajanlar intravitreal enjeksiyonunu içeren çalışmalar insan denemeleri için ön koşul olarak kullanılan ve neovasküler AMD 10,18,19 yönetiminde kullanılan anti-VEGF ajanların ilk nesil gelişmekte hayati önem oylandı.
Deneysel CNV için alternatif modeller KNV ikna etmek için cerrahi yöntemler kullanmaktadır. Bu prosedür, pro-anjiyojenik maddeler enjekte içerir (VEGF aşırı eksprese eden örneğin, rekombinant viral vektörler, RPE hücreleri ve / veya polistiren boncuklar subretinal enjeksiyon) anjiyojenezi 8,20 neden amacıyla, neovasküler AMD görülen artış olarak VEGF ifadesini taklit etmek. Bununla birlikte, bu yöntem, neovaskülarizasyonun büyük ölçüde düşük bir oranda verir; Bu çalışmalar, bu KNV gösterdiC57 / BL6 fareleri iki ayrı fare 8,14 aynı gerginlik lazer fotokoagülasyon yönteminde görülen ~% 70 başarı oranı karşı enjeksiyonlar 31% 'unda görülür. Bu nedenlerden dolayı, ve insan olmayan primatlar karşı kemirgenler kullanmanın avantajları göz önüne alındığında, lazer kaynaklı KNV'ların fare modeli en neovasküler AMD çalışma deneyleri 8 KNV'nin standart hayvan modeli haline gelmiştir.
Fare gözü ile çalışmak için bir minik, narin bir dokudur. Retina görselleştirmek için göz Manevra zordur ve ustalık elde edilene kadar çok pratik gerektirir. Bu görev hakim ve baskın olmayan el ile öğrenmiş olmalıdır gerçeği ile karmaşık. Retina görselleştirmek için gerekli ince hareketleri öğrenmiş edildikten sonra Dahası, her iki el ve lazer işletim ayak pedalı arasındaki koordinasyon önemlidir. Bu yazıda, lazer kaynaklı KNV yordam katılan fiziksel manipülasyonlar tüm öğrenme zorlukları damıtmak çalıştıoperatörler bu model ile hızlı bir başarı elde yardımcı olacak bir rehber haline edure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvanlar Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım 2013 Edition Kılavuzu uyarınca tedavi edilir, Görme ve Oftalmoloji (ARVO) Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım Tablosu Araştırma Derneği ve Kurumsal Hayvan tarafından onaylanmış Bakım ve Northwestern Üniversitesi için kullanın Komitesi.
Not: Aşağıdaki prosedür bir operatör tamamen yapılabilir; görevler buna göre bölünmüş olan ancak çok daha verimli iki operatörleri ile yapılmaktadır.
1. Lazer ve Ön lazer Station hazırlayın
- Kolayca erişilebilir olabilir lazer ve yarık lamba yerleştirin. Lazer açın ve parametrelerini ayarlamak önceden belirlenmiş (örneğin 75 mikron spot büyüklüğü, 100 mW güç, 100 milisaniye süre).
DİKKAT: emin olun operatör tüm hayvan ve lazer güvenlik, kişisel koruyucu ekipman ve ilgili lazer güvenlik işaretleri prosedür odası dışında görüntülenen giyer.- Herhangi bir deneysel hayvan kullanmadan önce, bir kalibrasyon, deneysel olmayan fareyi kullanarak İdeal parametreler bulmak. Lazer parametreleri kullanılan lazer bağlıdır. İdeal parametreleri düzgün odaklı olduğunda sürekli "balon" oluşmasına neden olur düşük lazer güç ayarı tarafından belirlenir. Uygun "balon" oluşumu ile lezyonun örneğin videoyu izleyin.
- Anestezi, sıcak hayvan, doku mendil ve tüm göz damlaları (Tropikamid, Tetrakain ve yapay gözyaşı) operatöre ulaşılabilecek kolayca böylece ön lazer istasyonu hazırlayın.
- Hayvan sıcak olun olup anestezi kaynaklı hipotermi önlemek için ilk fare içine anestezik enjekte önce sıcaklık (37 ° C) düzeltmek için önceden ısıtılmış.
- Isı tutma ve lazer işlemi başladıktan sonra sıcak kalabilir, böylece sıcak fare sahne yerleştirin.
2. Fare Anestezi ve Pre-lazer Hazırlık
- Enjekte önceanestezi ing, hiçbir deformiteleri veya kornea netlik (örn katarakt) azaltmak anormallikleri vardır sağlamak için makroskopik göz inceleyin.
- Fareyi tartılır.
- Tutanak ağırlığı, cinsiyet, ve hayvan kimlik numarası.
- 20 g bir fare için, 0.20 ml ksilazin / Ketamin Kokteyli enjekte; ağırlığı kullanılarak, anestezi, uygun miktarda hesaplamak 10 mg / kg ksilazin TD tribromoethanol 250 mg / kg (örneğin, 100 mg / kg ketamin hidroklorür kurum tarafından verilen ilkelere dayalı olarak kullanılmak üzere tribromoethanol OR 0.25 mi). Matematiksel hatalarını azaltmak amacıyla 1 g artışlarla ağırlığı başına önceden hesaplanmış dozajların bir tablo yazıldı.
- Scruff fare ve enjekte anestezi intraperitoneal adımda 2.4 hesaplamalara dayalı.
- Sıcak hayvan fare yerleştirin ve fare tamamen ayak tutam (yaklaşık 3-5 dakika) yoluyla pedal refleksini kontrol ederek anestezi kadar bekleyin.
- Silin, bir doku Roll up ve Aspirat önlemek için farenin burun alanını korumakSıvı roll-off iyon. Rulo yan fare ve topikal anestezi için her bir göz içine tetrakain hidroklorür damla (yaklaşık 30 ul) yerleştirin. Çözelti etkili olması için 2 dakika bekleyin.
- Pupil dilatasyonu topikal tropikamid bir damla adımı yineleyin 2.7. Seçenek olarak ise, dilatasyon fenilefrin hidroklorür (% 2.5) kullanımı.
- Çözümler etkili olması için 2 dakika bekleyin; Bu süre boyunca sıcak üzerinde hayvan tutun.
- Uygun zaman geçtikten sonra, hızlı bir şekilde fare sahnede fare koyun ve yarık lamba çene geri kalanı sahne yerleştirin.
- Düşük ışık parlaklığına biyomikroskopta açın ve pupilla dilatasyonu derecesini kontrol edin. Öğrenci yeterince (yaklaşık 2,5-3 mm) dilate değilse, sıcak hayvana fare dönmek ve bekleyin. Alternatif olarak, tropikamid başka damla yönetmek. Göz yeterince dilate sonra, lazer prosedürüne devam edin.
3. Lazer Prosedürü
Not: Diğer p emin olunersons odasında lazer korumalı yarık lamba göz parçasından uzakta koruyucu gözlük
- Bu ideal optik sinir görselleştirme (3.1.2 bakınız) konumlandırılmış böylece fare sahnede fare yerleşimini ayarlayın.
- Yatay yatıyor böylece diğer azından bir tarafında baş ve kuyruk, lamba ışın yarık dik, sahibine fare yönlendirmek. İdeal fare yerleştirme kapak kayma uygulandıktan sonra çok daha kolay optik sinir görselleştirme yapacaktır.
- Daha yakın lazer operatörü baş bir ~ 170 ° 'lik açıyla yani hafifçe fare çevirin.
- Kararlı ve nerede operatörün eli ince manipülasyon için yeterli alana sahip olacak olduğu bir pozisyonda yine lambayı yarık henüz mümkün olduğunca o fare kadar yakın olduğundan emin olun.
- Fare ideal yerleştirilmesinden sonra, bir 25 mm x 25 mm ebadındaki bir cam lamel yapay gözyaşı çözeltisi bir damla yerleştirin.
- Farenin opp suni gözyaşı çözümün bir damla yerleştirinosite göz - Bu sağlayacaktır göz sulu ve yardım gecikme katarakt olduğunu.
- Başparmak ve işaretçi parmakları arasında lamel köşesini tutun; konumu ve böylece cam iki parmak uçları arasında sıkılır.
- Yavaşça destek ve el stabilizasyonu için hayvanın vücudu etrafında kalan üç parmaklarını sarın. Pozisyon eli böylece cam lamel kolayca farenin göze yerleştirilebilir.
- Bilek El titreme azaltmak için sağlam bir yüzey üzerinde stabilize olduğundan emin olun.
- Kararlı pozisyon elde edildikten sonra, dikkatle farenin gözün üzerine (hala yapışık yapay gözyaşı damla ile) cam lamel basın.
- Lamel lazer ışını yayılımını veya yansımasını önlemek amacıyla lazer ışını mümkün olduğunca dik olarak konumlandırılmış emin olun. Lamel kornea düzleştirmek için bir kontakt lens gibi davranır.
- Toggle unt odak yarık lamba ile ve serbest el ile bakmakil retina görülebilir. Retina görüntülenmiştir yere bağlı açık sarı / kırmızı renk olacak, farklı, kırmızı damarlar görünür olacaktır.
- Yavaş ve dikkatli bir optik siniri görüntülenmesi kadar fare kafasını ve / veya lamel işlemek. Optik sinir o yayılan çok sayıda gemi ile, sarı renkli olacaktır.
- Operatör optik sinirin görselleştirme onaylamıştır sonra, ışın odaklama lazeri açın.
- Lazer ışını açıldıktan sonra, istenilen pozisyona (optik sinir yaklaşık 1 disk çapı) ışını odaklama lazer manevra.
- Göz fundus RPE üzerinde lazer ışınını odaklanın. Uygun odak keskin ve net lazer ışını sahip sağlanır. Işını amaçlayan yarık lamba odak veya yeniden pozisyon cam lamel geçiş, oval ya da odak dışı görünüyorsa.
- Hedefleme ışını RPE odaklanmıştır sonra, lazerin ayak tetiği kullanarak lazer yönetimini başlatmak.
- Intraoküler önlemek için retina damarları önlemek için emin olun oraji.
- Hemen lazer uygulamasından sonra bir kabarcığın görünüm için izleyin. Lazer atış hatları net ve hiçbir şekilde puslu olmamalıdır.
- Lazer atış kabarcığı oluşumuna yol açmaz ise, ya da darbe alan (genel ort başarılı etkisi net, keskin tanımlı sınırına kötü tanımlanmış dairesel kenarlıklı bulutlu bir görünüm) puslu görünüyor, ya da kanama lazer uygulamasından sonra görülürse, DEĞİL yapmak gelecek analizi için bu lezyonlar bulunur.
- Tekrarlayın istenen tüm CNV pozisyonları için 3.10-3.12 (genellikle 3'te, 6, 9, ve optik sinir etrafında 00:00 pozisyonları) yineleyin. Lazer indüksiyonlar optik sinir yaklaşık aynı mesafede uygulanırsa, yeniden yoğunlaşma gerekli olmamalıdır. Ancak, retina bulunabilecek ışını refocusing ardışık lazer idareleri arasında gerekli olabilir fare göz ve küçük değişimlerin güçlü eğrilik.
- Bir dizüstü konumu ve e sonucu rekorach lazer atış idaresi ve sonuç (başarılı, puslu, kanama vb.) göz için her uygulanan vurdu. Kullanılmadığı zaman stand-by modunda lazer yerleştirmek emin olun.
- Gerekirse istikrar ve yeni bir lamel için ters elinizi kullanarak, fare, diğer göz için 3.1-3.14 tekrarlayın.
- İstenen tüm lazer çekim uygulanır sonra lazer kapatın ve yarık-lamba.
- Anestezi kurtarma için sıcak üzerinde lamel ve yer fareyi atın. Makroskobik herhangi bir yaralanma için göz kontrol ve sulandırılmış göz tutmak ve potansiyel gelecek katarakt gelişimini önlemek için yapay gözyaşı çözümün bir damla yerleştirin. Fare anestezi kurtarır sonra kafese geri döner.
| AVERTIN | AVERTIN | AVERTIN | XYL / KET | XYL / KET | |
| Fare Ağırlık (g) | Doz (mg / kg) | Anestetik doz (mi) | Doz (mg / kg) | Anestetik doz (mi) | |
| 15 | 250 | 20 | 0,1875 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.15 |
| 16 | 250 | 20 | 0,2 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.16 |
| 17 | 250 | 20 | 0,2125 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.17 |
| 18 | 250 | 20 | 0.225 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.18 |
| 19 | 250 | 20 | 0,2375 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.19 |
| 20 | 250 | 20 | 0.25 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0,2 |
| 21 | 250 | 20 | 0,2625 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.21 |
| 22 | 250 | 20 | 0.275 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.22 |
| 23 | 250 | 20 | 0,2875 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.23 |
| 24 | 250 | 20 | 0.3 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.24 |
| 25 | 250 | 20 | 0.3125 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.25 |
| 26 | 250 | 20 | 0.325 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.26 |
| 27 | 250 | 0,3375 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.27 | |
| 28 | 250 | 20 | 0.35 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.28 |
| 29 | 250 | 20 | 0,3625 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.29 |
| 30 | 250 | 20 | 0.375 | 100 mg / kg ketamin; 10 mg / kg ksilazin | 0.3 |
Tablo 1: XyIKet Doz Şeması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KNV lezyonlarının Niceleme CNV gemileri etiket immünoflüoresans boyama kullanarak düz monte choroids analizi yoluyla yapılabilir. Doku hazırlık iki en sık kullanılan yöntemler hemen endotel hücre işaretleyici ile hayvan kurban, ya da ölüm sonrası immün boyama önce perfüzyon yoluyla yapılan FITC-dekstran etiketleme vardır. Bu yöntemlerin ikisi de detaylı 13,14,21 daha önce tarif edilmiştir, sırasıyla her biri 1 ve 2 örneklerini göstermektedir. Konfokal mikroskopi görüntü alımı ya alanı (2-Boyutlar) veya hacim sonra (3-Boyutlar) hesaplanabilir ve ImageJ yazılım veya Volocity ile görüntülendi. Miktar ek olarak, Ekim görüntüleme in vivo CNV lezyonu görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Elde edilen CNV retina bir kesit görüntüsünün bir örneği, Şekil 3 'de gösterilmiştir.
lt = "Şekil 1" src = "/ files / ftp_upload / 53502 / 53502fig1.jpg" />
Şekil 1:. KNV Perfüzyon Boyama & Bölge (2B) Hesaplama Örneği (25X) (A) FITC dekstran KNV lezyonu perfüze. Eşikleme yoluyla (B) ImageJ alan ölçümü yöntemi. Fare Gerginlik:. C57BL / 6J bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: CNV immün ve Hacim (3D) Hesaplama Örneği (25X) (A) Isolectin GS-IB4 lekeli KNV lezyonu.. Yüz görünümünde en KNV lezyonu (B) 3 boyutlu rekonstrüksiyon. (C) 3D rekonstrüksiyon yan görünüm (B ve C tek çini width = 35 um). Fare Gerginlik: C57BL / 6J.g2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Ekim Kesit CNV Görselleştirme (A) Ekim KNV lezyonu yüz görünümü tr. (B) KNV ile retinanın Ekim kesit B-scan sarı çember. Fare Gerginlik:. C57BL / 6J bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başarılı lazer indüksiyon sonrası lazer teslimat ve sonuçtaki KNV lezyon gelişimini etkileyen birden fazla faktör vardır. Bu faktörler kontrollü ve en güvenilir sonuçlar elde etmek için standardize edilmelidir. Bu faktörlerin en uygun fare seçimi (genotipi, yaş, cinsiyet ve), anestezik seçimi, ve lazer ayarları vardır.
Kullanılan özel fare modeli KNV gelişme seyri üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. En yaygın olarak kullanılan genotip C57BL / 6 faredir. Hayvanlar elde edildiği bir satıcı sonuçtaki CNV boyutunu etkileyebilir. Zayıf ve diğ. Diğer iki satıcılar 4 önemli ölçüde daha büyük KNV gelişmekte Taconic'ten fareleri Jackson, Charles Rivers ve Taconic laboratuarlardan C57BL / 6 farelerinde son CNV lezyon boyutu önemli farklılıklar ortaya koymuştur. Bu nedenle, bir firmadan satın alıp aynı satıcıdan tüm fareleri kullanılarak harici farklılıkları en aza indirmek için yardımcı olacaktırCNV lezyon boyutu. Yaş ve fare seks de deney tasarlarken dikkate alınması gereken önemli bir faktör olduğu görülmüştür. Dişi fareler aynı yaştaki erkek farelere göre daha fazla KNV geliştirmek ve her iki cinste eski fareler genç farelerin 22,23 daha KNV gelişir. Deneysel parametrelere bağlı olarak, operatörler akılda bu faktörleri tutmalı. Operatörler mekanik ve ilaç geliştirme amaçlı aydınlatmak için lazer CNV prosedürü kullanılarak Örneğin, farklı yaşlarda her iki cinsiyette cinste ve olmayanlar özgü mekanizmaları tanımlamak için kullanılmalıdır.
Uygun anestezi özellikle öğrenme sürecinde, bu işlem için kritik bir adımdır. Çoğu IACUC onaylı rejimlerin prosedürü hakim olmuştur kez her göze 4-5 lazer çekim sunmak için fazlasıyla yeterli zaman en az 15-30 dakika süreyle anestezi uyarabilir. Ancak, çok fazla zaman geçtiğinde ise, anestezi tersinir lens kesafeti, yeniden yol açabilirDeneysel CNV 24 optik olarak geçirgen olmayan bir göz ndering. Anestezi ikna etmek için kullanılan iki ana protokolleri ksilizin / ketamin kokteyli veya tribromoethanol (TBE) intraperitoneal teslim vardır. Bazı raporlar, hem katarakt oluşumu açısından ksilazin / ketamin ile TBE avantajlarını varsaymak rağmen operatöre hızlı 14 işe yaramazsa, sonunda bulutlu lens gelişimine neden olur. Katarakt gelişimi önce süresini uzatmak için bir yolu suni gözyaşı 25 uygulaması ile, detaylı protokol belirtildiği gibi, gözün hidrasyon muhafaza etmektir. Bu yöntem, ne olursa olsun kullanılan anestezik maddenin, katarakt oluşumunu geciktirmek yardımcı ve operatör yordamı tamamlamak için daha fazla zaman vermek gerekir.
Lazer ayarları CNV güvenilir indüksiyon önemli bir faktör olabilir. Kalibre lazer gücü ve süresi deney hayvanlarında prosedürü yapmadan önce önemli bir ön adımdır. Lazer çekimkabarcık oluşumu olmadan neden kanama ya da odak dışı olan bu KNV gelişim sürecini bozar olarak, hesaplama dışında tutulmalıdır. Birden gemiler yaygın kanama neden yırtılmış ise, tüm göz dışlanmalıdır. İdeal olarak, sürekli açık çizimi ile baloncuk oluşumu ve lezyon neden Bruch membranı yırtması en düşük güç ve lazer kısa süre 4 kullanılmalıdır. Farklı güç ayarları ile deney Protokoller aşırı doku hasarı ve CNV formasyonu 4 14,17 sonradan daha düşük oranlarda bu artan gücü ve süresi kurşun göstermiştir. Ayrıca, lazer yaralanma konumu da KNV gelişimi etkileyebilir. Etkiler uzaklıkta 23 <1 DD veya 2 veya daha fazla DDs teslim anlamlı düzeyde daha alan CNV hacimleri vermiştir optik diskten yaklaşık 1 disk çapı (DD) teslim etti. Lazer sonrası analizi bağlı olarak, lezyon yer veya önemli olabilir ya da olmayabilir. Örneğin,Bir Ekim görüntüsü tüm lezyonların elde edilecek ise, optik sinir etrafında merkezi konumu hayati önem taşımaktadır. Lezyonlar düz montaj yoluyla analiz edilecekse Buna karşın bir, lezyon yeri olarak önemli değildir. Nihayet, son çekimleri birbirine ya da başka iki lezyon birlikte "büyümek" olabilir çok yakın yerleştirilir değil emin olun.
CNV deney, neovasküler AMD incelemek için sağlam bir yöntemdir. Lazer indüksiyonu elde edilen anjiyojenez, insan AMD hastalarda gözlenen anjiyogenez konumu ve genel görünüm olarak benzer. Bununla birlikte, bu çok mükemmel bir model değil. Insan gözünün aksine, fareler tanımlı makülayı yok ve lazer kaynaklı KNV modelinde görülen akut yaralanma ile ilişkili anjiyogenez temelde AMD 7,8,14 genetik etkilemiş, kronik patoloji farklıdır. Fare retina ortam sağlıklı ve sonuç anjiyogenez lazer etkisi, yerine genetik çok / e yol açtığı travma bir tepki olarak ortaya çıkarİnsan AMD gibi nvironmental faktörler ve yaş. Buna karşın bir AMD insan retina çevre VEGF ekspresyonu ve KNV 3 neden diğer sitokinler anormalliklerin sırasında kronik enflamasyon bir devlet yer almaktadır. Açıktır ki, bu iki ortamlarda neovasküler gelişimi belirgin bir şekilde farklıdır.
Sonuç olarak, lazer kaynaklı KNV protokolü gerçekleştirmek için başlangıçta zor ama usta sonuçta ödüllendirici bir tanesidir. Fare ve lamel tutun, yanı sıra optik sinir görselleştirmek için lamel ve fare kafasını işlemek için gerekli ince beceri onlar operatörün ya ellerini kullanarak iyi performans gereken bu yana özellikle, sabır ve pratik gerektiren hareketlerdir. Ancak, teknik, öğrenilen bir kez deneysel KNV uygulamak için etkili bir yol olabilir ve neovasküler AMD araştırma çoğu yönlerine uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% Tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% Tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 G insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
References
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L.
- Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Poor, S. H., et al. Reliability of the Mouse Model of Choroidal Neovascularization Induced by Laser Photocoagulation. IOVS. 55, 6525-6534 (2014).
- Ryan, S. J. The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration. Trans Am Ophthalmol Soc. 77, 707-745 (1979).
- Miller, H., Miller, B., Ishibashi, T., Ryan, S. J. Pathogenesis of laser induced choroidal subretinal neovascularization. IOVS. 31, 899-908 (1990).
- Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molr Aspects Mede. 33, 487-509 (2012).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal Models of Choroidal and Retinal Neovascularization. Prog Retin Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Zeiss, C. J. REVIEW PAPER: Animals as Models of Age Related Macular Degeneration An Imperfect Measure of the Truth. Vet Pathol Online. 47, 396-413 (2010).
- Tobe, T., et al. Targeted Disruption of the FGF2 Gene Does Not Prevent Choroidal Neovascularization in a Murine Model. Am J Pathol. 153, 1641-1646 (1998).
- He, L., Marneros, A. G. Macrophages Are Essential for the Early Wound Healing Response and the Formation of a Fibrovascular Scar. Am J Pathol. 182, 2407-2417 (2013).
- Hoerster, R., et al. In vivo and ex vivo characterization of laser induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Jawad, S., et al. The Role of Macrophage Class A Scavenger Receptors in a Laser Induced Murine Choroidal Neovascularization Model. IOVS. 54, 5959-5970 (2013).
- Lambert, V., et al. Laser induced choroidal neovascularization model to study age related macular degeneration in mice. Nat Protocols. 8, 2197-2211 (2013).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage Depletion Inhibits Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3578-3585 (2003).
- Espinosa Heidmann, D. G., et al. Macrophage Depletion Diminishes Lesion Size and Severity in Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3586-3592 (2003).
- Giani, A., et al. In Vivo Evaluation of Laser Induced Choroidal Neovascularization Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography. IOVS. 52, 3880-3887 (2011).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF Is Major Stimulator in Model of Choroidal Neovascularization. IOVS. 41, 3158-3164 (2000).
- Reich, S. J., et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molr Vis. 9, 210-216 (2003).
- Baffi, J., Byrnes, G., Chan, C. C., Csaky, K. G. Choroidal Neovascularization in the Rat Induced by Adenovirus Mediated Expression of Vascular Endothelial Growth Factor. IOVS. 41, 3582-3589 (2000).
- Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. JoVE. , 2563 (2011).
- Espinosa-Heidmann, D. G., et al. Age as an Independent Risk Factor for Severity of Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 43, 1567-1573 (2002).
- Zhu, Y., et al. Improvement and Optimization of Standards for a Preclinical Animal Test Model of Laser Induced Choroidal Neovascularization. PLoS ONE. 9, e94743 (2014).
- Weinstock, M., Stewart, H. C. Occurrence in rodents of reversible drug induced opacities of the lens. British J Ophthalmol. 45, 408-414 (1961).
- Ridder III, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of Cataract Development in Anesthetized Mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
