Summary
Udsættelse for teratogener kan forårsage fosterskader. Zebrafisk er nyttige til bestemmelse af teratogene potentiale af kemikalier. Vi demonstrerer anvendeligheden af zebrafisk ved at udsætte embryoner til forskellige niveauer af nitrit og også på forskellige tidspunkter af eksponering. Vi viser, at nitrit kan være giftige og forårsage alvorlige udviklingsmæssige defekter.
Abstract
Høje nitratindhold i miljøet kan medføre medfødte defekter eller aborter hos mennesker. Formentlig dette skyldes omdannelsen af nitrat til nitrit af tarm og spyt-bakterier. Men i andre mammale undersøgelser, høj nitritværdier ikke forårsager fødselsdefekter, selv om de kan føre til dårlige reproduktive resultater. Således er den teratogene potentiale af nitrit er ikke klart. Det ville være nyttigt at have et hvirveldyr modelsystem til nemt at vurdere teratogene virkninger af nitrit eller andre kemiske af interesse. Her demonstrerer vi nytten af zebrafisk (Danio rerio) til at screene forbindelser til toksicitet og embryonale defekter. Zebrafisk embryoner befrugtet eksternt og har hurtig udvikling, hvilket gør dem en god model for teratogene undersøgelser. Vi viser, at forøgelse af eksponeringstiden til nitrit negativt påvirker overlevelse. Øge koncentrationen af nitrit også negativt påvirker overlevelse, mens nitrat ikke. For embryoner that overleve nitrit eksponering kan forskellige defekter forekomme, herunder perikardiel og blommesæk ødem, svømme blære noninflation, og kraniofaciale misdannelser. Vores resultater indikerer, at zebrafisk er en bekvem til undersøgelse teratogene potentiale af nitrit. Denne fremgangsmåde kan let tilpasses til at teste andre kemikalier for deres virkninger på tidlig hvirveldyr udvikling.
Introduction
Teratogenese er en proces, der forstyrrer den normale udvikling af et foster ved at forårsage permanente strukturelle og funktionelle abnormiteter, væksthæmning eller abort i svære tilfælde 1. Det kan være forårsaget af visse naturlige midler (teratogener), som interfererer med fosterudviklingen på flere måder 2. Under menneskelig fosterudvikling, har fælles teratogener såsom stråling, smitstoffer, giftige metaller og organiske kemikalier blevet rapporteret at forårsage defekter i epicanthic folder (fold huden i den øverste øjenlåg) og clinodactyly (buede finger eller tå) gennem morfogenetiske fejl 1.
Forståelse af molekylære mekanisme for teratogenese er det første skridt i retning af at udvikle behandling og forebyggelse. Adskillige hvirveldyr modeller som Xenopus laevis (Xenopus laevis) og zebrafisk (Danio rerio) er blevet anvendt til at bestemme de molekylære veje ramt af teratogens. Tidligere undersøgelser har brugt zebrafisk som model for epidemiologi, toksikologi og teratogenese 3-7. Scholz et al. betragtes zebrafisk som en "gold standard" for toksicitet miljøvurdering. Dette skyldes til dels, at gennemsigtigheden af zebrafisk embryo, som gør det muligt for forskerne at visualisere den udviklingsmæssige defekt som det forekommer 8. Ca. 70% af menneskelige gener har orthologer i zebrafisk, hvilket gør zebrafisk en ønskelig hvirveldyr model til at studere menneskelige fejl 9.
Nogle epidemiologiske studier har antydet, at nitrat og nitrit, almindeligvis til stede i gården fødevarer og vand, der er forbundet med fødselsdefekter eller spontane aborter 10,11, mens andre undersøgelser ikke støtter denne forening 12. Nitrat (NO3 -) og nitrit (NO 2 -) er naturligt til stede i jord og vand. De er en kilde til nitrogen til planter og er en del af nitrogen cyklus 13. Fødevarer såsom grønne bønner, gulerødder, squash, spinat og roer fra gårde, der bruger gødning højt nitrat har væsentligt forøget indhold af nitrat og nitrit 7. Mælk fra køer fodret med høje nitrat fødevarer og fisk i høj nitrat vand (primært fra jord afstrømning 30) kan føre til mennesker indtager store mængder af nitrat og nitrit 14. Nitrat og nitrit er også almindeligt anvendt i fødevarer konservering, som dramatisk øger mængden indtages af mennesker 12.
Optimale niveauer af nitrat og nitrit spille fundamentale roller i fysiologiske processer som vaskulær homeostase og funktion, neurotransmission og immunologiske vært forsvarsmekanismer 13-15. Eksponering for høje niveauer af nitrat og nitrit, kan imidlertid føre til bivirkninger, især hos spædbørn og børn 16. Indtages nitrat omdannes yderligere til nitrit i mundhulen ved mikroflora og i the mavetarmkanalen ved intestinal mikroflora 17.
Nitrat sætter spædbørn på en høj risiko for blå baby syndrom ved oxidation af hæmoglobin til methæmoglobin, forringe hæmoglobin fra sin ilt transporterer evne 18. Dette resulterer i den blå farve af huden, der strækker sig til perifere væv i mere alvorlige tilfælde. Hæmmet iltning af væv resultater i andre symptomer, hårdest fører til koma og død 19,20. Lignende symptomer er observeret hos spædbørn og voksne ved højere koncentrationer af nitrat 21. Forhøjede niveauer af methæmoglobin i voksne på grund af nitrit forgiftning medfører cyanose, hovedpine, åndedrætsbesvær 31, og død, hvis de ikke behandles på grund af komplikationer i forbindelse med vitale vævshypoksi 32,33.
Nitrat indtages på højere niveauer kan også resultere i forskellige sundhedsmæssige komplikationer. Barndom diabetes, tilbagevendende diarré og tilbagevendende luftvejsinfektioneri børn er blevet forbundet med høj nitrat indtag 11,17,22. Kronisk eksponering for et højt niveau af nitrat er forbundet med vandladning og milt hemorrhaging. Akut høj dosis eksponering for nitrat kan føre til et bredt spektrum af medicinske tilstande som mavesmerter, muskelsvaghed, blod i afføring og urin, besvimelse og død 11. Prænatal eksponering for nitrat ved høje niveauer har været forbundet med neurale rør og bevægeapparatet defekt 11.
En nylig rapport viste, at behandling af zebrafisk embryoner med nitrit førte til blommesæk ødem, kraniofaciale og aksiale misdannelser, og svømme blære noninflation 5. I denne undersøgelse udviser vi en fremgangsmåde til behandling zebrafisk embryoner med nitrat og nitrit at bestemme deres teratogent potentiale. Embryoner blev udsat for nitrit ved forskellige koncentrationer og forskellig varighed. Ethanol blev anvendt som en positiv kontrol, da det er en etableret teratogen 23. Our metode viste, at både høje koncentrationer og lange eksponeringstider til nitrit var skadelige for overlevelse og resulteret i forskellige fænotyper, der spænder fra mild (ødem) til alvorlige (brutto udviklingsmæssige defekter). Derfor er zebrafisk er en nyttig model for direkte at udforske de potentielle teratogene virkninger af nitrat og nitrit på embryoner til at supplere epidemiologiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De er beskrevet i denne protokol procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved Indiana University of Pennsylvania.
1. Harvest Embryoner
- Oprethold zebrafisk ved 28,5 ° C, pH 7, ledningsevne mellem 500-1,500 uS, og en lys / mørke cyklus på 14 timers lys og 10 timers mørke 24. Brug vildtypestammer såsom TU AB eller Tü / AB hybrid. Forskellige stammer kan reagere forskelligt på kemisk behandling 25.
- Opsætning af fisk til parring aftenen før høst æg ved at tilføje fisk systemet vand i en parring tank. Tilføj en mandlig og kvindelig fisk i tanken og adskille de to fisk med en skillevæg. Hver fisk par vil producere en række 50-300 æg. For at sikre, at der nok æg vil blive produceret, oprettet 30 par fisk. Typisk vil omkring 50% af fisk par på prime parring alder (6-9 måneder gamle) producerer æg, hvilket resulterer op til 200 æg pr par og maksimalt op til 3, 000 æg til dette eksperiment.
- Den næste morgen efter lyset tændes, skal du fjerne divider at indlede parring. Kontroller parring tanke for æg hver 15 min.
- Når fiskene lægge æg, høste alle embryoner ved hjælp af en tesi og kombinere dem i én stor container med E3 buffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4). På 1,5 HPF, fjerne og kassere ubefrugtede æg med en plastik overførsel pipette under et dissektionsmikroskop. Ubefrugtede æg er uigennemsigtige mens befrugtede æg er gennemsigtige 34.
- Overfør 50 embryoer i en 100 x 15 mm glas petriskål indeholdende 50 ml E3 buffer for hver behandling tilstand. Der er behov for i alt 33 retter for 11 forhold behandlingsmuligheder og 3 gentagelser.
2. Behandling Embryoner
- Udføre behandlinger på 2 timer efter befrugtningen (HPF) 35. Inkuber embryoner / larver ved 28,5 ° C og undersøges larverne ved 120 HPF. Udfør mindsst tre gentagelser af hver behandling betingelse for statistisk analyse.
- For 3 petriskåle (hver indeholder 50 embryoner) ved 2 HPF, fjerne E3 buffer med en overførsel pipette og tilsæt 50 ml 300 mM ethanol fortyndet i E3 buffer. Dæk petriskåle med Parafilm at minimere fordampning af ethanol.
- Fortsæt udsætte embryoner til ethanol i 22 timer. Fjern derefter ethanol med en overførsel pipette. 50 ml E3 buffer og slyng fadet flere gange for at vaske ud ethanol. Fjern denne E3 buffer med en overførsel pipette og gentag vasketrinnet 2 gange mere.
- For 3 petriskåle (hver indeholder 50 embryoner) ved 2 HPF, fjerne E3 buffer med en overførsel pipette og tilsæt 50 ml nye E3 buffer.
- For 9 Petriskåle (hver indeholder 50 embryoner) ved 2 HPF, fjerne E3 buffer med en overførsel pipette og tilsæt 50 ml 1000 mg / l natriumnitrit opløst i E3 buffer. Bekræft koncentrationen af bestanden nitritopløsning forhånd under anvendelse af enmodifikation af diazotering (USEPA Method 354,1) spektrofotometrisk metode 28.
- Fortsæt udsætte 3 retter til 46 timer, 3 retter for 70 timer og 3 retter for 94 timer. Erstatte nitrit opløsningen med frisk gjort nitrit opløsning dagligt.
- Efter hver eksponeringstid, fjerne nitrit med en overførsel pipette. 50 ml E3 buffer og slyng fadet flere gange for at vaske ud nitrit. Fjern denne E3 buffer med en overførsel pipette og gentag vasketrinnet 2 gange mere.
- For 3 petriskåle (hver indeholder 50 embryoner) ved 2 HPF, fjerne E3 buffer med en overførsel pipette og tilsæt 50 ml 200 mg / l natriumnitrit. Gentag dette med 400, 600, 800, og 1000 mg / l natriumnitrit.
- Fortsæt udsætte embryoner til nitrit for 70 timer. Erstatte nitrit opløsningen med frisk gjort nitrit opløsning dagligt.
- Efter eksponeringen tid, skal du fjerne nitrit med en overførsel pipette. 50 ml E3 buffer og slyng fadet fleregange for at udvaske nitrit. Fjern denne E3 buffer med en overførsel pipette og gentag vasketrinnet 2 gange mere.
- For 3 petriskåle (hver indeholder 50 embryoner) ved 2 HPF, fjerne E3 buffer med en overførsel pipette og tilsæt 50 ml 1000 mg / l natriumnitrat opløst i E3 buffer. Bekræft koncentrationen af bestanden nitratopløsning forhånd anvendelse af en modifikation af reduktionen cadmium (USEPA Method 353.3) spektrofotometrisk metode 28.
- Fortsæt udsætte embryoner til nitrat for 70 timer. Erstatte nitrat opløsning med frisk gjort nitrat opløsning dagligt.
- Efter eksponeringen tid, skal du fjerne nitrat med en overførsel pipette. 50 ml E3 buffer og slyng fadet flere gange for at vaske ud nitrat. Fjern denne E3 buffer med en overførsel pipette og gentag vasketrinnet 2 gange mere.
- Under hver dag af eksponeringen, tælle antallet af døde foster / larver ved hjælp af et stereomikroskop. Tegn på dødenomfatter manglende hjerteslag og blodcirkulation, eller mangel på motilitet efter 1 min observation. Fjern døde embryoner / larver med en overførsel pipette for at reducere forurening af E3 buffer.
- Når eksperimenter ender ved 120 HPF, aflive larverne.
- Fjern E3 buffer med en overførsel pipette. Derefter tilsættes 50 ml 0,2% MS-222 (pufret til pH 7) og vent i 10 minutter.
- Fjern MS-222 med en overførsel pipette. 50 ml E3 buffer og hvirvel til at vaske ud MS-222.
- Fjern E3 buffer med en overførsel pipette og tilsættes 20 ml 4% paraformaldehyd (PFA) at fastsætte larver. Swirl skålen flere gange. Brug en overførselspipette at overføre larverne i et hætteglas sammen med nok PFA at fylde hætteglasset. Opbevares glassene i køleskabet natten over (O / N).
- Tag billeder af fast larver ved hjælp af en Stereoskopet med et digitalt kamera. Brug 30X forstørrelse, ISO 200, og 200 ms eksponeringstid. Orientere larverne så den forreste til left og den dorsale er til toppen af banen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udsættelse for 300 mM ethanol i 22 timer havde ingen effekt på overlevelse (data ikke vist), i overensstemmelse med tidligere rapporter 5,23,26. Dette er forventet, da ethanol er en kendt teratogen og tjente som en positiv kontrol. Observerede fænotyper inkluderet perikardiel ødem, svømmeblære noninflation (figur 1), kraniofaciale defekter, og forsinket udvikling (data ikke vist).
Behandling med nitrit resulterede i let til svær virkninger på overlevelse, afhængigt af tidspunktet for eksponering. For eksempel eksponering til 1.000 mg / l for 94 timer hårdt ramt overlevelse sammenlignet med kortere eksponeringstider (figur 2).
Vi vurderede også virkningen af forskellige Nitritkoncentrationerne på overlevelse. Embryoner blev eksponeret i 70 timer til 200, 400, 600, 800, og 1000 mg / l. Overlevelsesrater var lavere, når de udsættes for højkoncentrationer af nitrit, mens nitrat ikke havde en effekt på overlevelse (Figur 3). Fænotyper for nitrit-behandlet larver lignede ethanol behandlede embryoer (figur 4).
Figur 1:. Udviklingseffekt ethanol Behandling Embryoner behandlet med ethanol udviste perikardial ødem (pil), svømme blære noninflation (stiplet linie), blommesæk ødem (pilespids), og kraniofaciale defekter (data ikke vist). Billeder blev taget ved 96 HPF. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: overlevelse på 1.000 mg / l Nitrit Behandling efter forskellige tidspunkter af Exposure. Embryoner blev eksponeret for 1000 mg / l nitrit ved 2 HPF. Nitrit blev vasket ud efter 46, 70, og 94 timers eksponering, og overlevelse blev beregnet. Øget eksponeringstid resulterede i nedsat overlevelsesrate. Standardafvigelser: Ubehandlede = 24; 46 timer = 6; 70 timer = 6; 94 timer = 0,9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Overlevelse efter Udsættelse for forskellige Nitrit Koncentrationer Embryoner blev udsat for 70 timer til stigende koncentrationer af nitrit. Højere koncentrationer af nitrit resulteret i lavere overlevelsesrater. Nitrat havde ingen effekt selv ved den højeste koncentration på 1.000 mg / l efter eksponering for 70 timer. Standardafvigelser for nitrit: Ubehandlede = 19; 200 mg / L = 16; 400 mg / L = 21; 600 mg / L = 20; 800mg / L = 14; 1000 mg / L = 12. Standardafvigelse for nitrat lig 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Udviklingseffekt af nitrat og nitrit Embryoner behandlet med 1.000 mg / l nitrat (midterste panel) ikke havde nogen virkning sammenlignet med den ubehandlede kontrol (øverste panel). Nitrit behandling på 1.000 mg / l resulterede i grove udviklingsmæssige defekter i tillæg til lignende fænotyper observeret i ethanol behandling (nederste panel). Billeder blev taget ved 120 HPF. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne metode viser anvendeligheden af zebrafisk i vurderingen af teratogene potentiale af nitrit og nitrat. Sammenlignet med andre hvirveldyr, zebrafisk har fordele, der omfatter høj frugtbarhed, ekstern befrugtning, optisk transparens, og hurtig udvikling. Ledige mutanter der mangler pigmentering (såsom casper zebrafisk 36) også bidrage til at øge synligheden af indre organer. Det er også nemt at generere transgene zebrafisk med reportergener at lette analysen i levende fisk 37. Fordi zebrafisk genom er bevaret med mennesker, kan oplysninger indhentet fra deres studier føre til translationelle resultater i mennesker 9. Fremgangsmåden kan anvendes til genanalyse, såsom in situ hybridisering, for at få yderligere oplysninger om fejlagtig regulering af gener forårsaget af teratogener.
Ethanol eksponering påvirkede ikke signifikant overlevelse, men det forårsage marked defekter ligner tidligere rapporter 5,23,26. Dette viser, at vores metode er pålidelig i at gentage offentliggjorte resultater. Nitrat havde ingen effekt på overlevelse, mens nitrit havde en betydelig indflydelse afhængig af koncentrationen og eksponeringstid. Længere eksponering og højere niveauer af nitrit haft en negativ effekt på overlevelse, i overensstemmelse med tidligere resultater 5. Det blev for nylig vist, at overdreven udsættelse nitrit forårsagede defekt hjerteklap udvikling i zebrafisk 27, validering brugen af zebrafisk til at studere den mekanisme af teratogener.
Det er afgørende at bekræfte koncentrationerne af arbejdsopløsninger efter de er lavet. Koncentrationerne af nitrat og nitrit kan måles ved hjælp af modifikationer af reduktion af cadmium (USEPA Method 353.3) og diazotering (USEPA Method 354,1) spektrofotometriske metoder, henholdsvis 28. Et andet afgørende skridt er at dække petriskål med Parafilm at minimere fordampningration af ethanol, hvis dette anvendes som en positiv kontrol. Hvis larver have uventede dødelighed (for høj eller for lav), dobbelt-tjekke beregningerne og koncentrationer af de løsninger.
For nylig blev en lignende metode anvendes til at bestemme de teratogene virkninger af ethanol 29. Selv om denne metode svarer til vores metode her, det kun udsætter embryoner til ethanol i op til 24 timer, formodentlig på grund af toksiciteten af eksponere embryoner til ethanol i lang tid. I modsætning hertil vores metode udsætter embryoner til nitrat og nitrit i flere dage med udskiftning af testopløsningerne dagligt. Dette er fordelagtigt til afprøvning mindre giftige kemikalier.
Vi forestiller os, der kan påføres vores metode til at teste andre lægemidler eller specifikke miljøforhold. Imidlertid er denne metode begrænset til kun at teste vandopløselige molekyler. Den lysfølsomhed af visse kemikalier er en anden faktor til at overveje. Hvis test kemikalier er lette SenSitive, wrap petriskåle i aluminiumfolie for at beskytte mod lys. Også den metode er ikke god til test vand taget fra et bestemt miljø, fordi laboratoriet zebrafisk kræver særlige betingelser (såsom pH og ledningsevne) for optimal udvikling. Alligevel zebrafisk tjener som en positiv model hurtigt afgøre udviklingsmæssige defekter forårsaget af potentielle teratogene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| KIMAX glass Petri Dish | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Nitrate Reagent | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Nitrite Reagent | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E stereomicroscope | Leica | 10446294 | |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | S343 | |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | S347 | |
| Transfer pipets | Laboratory Products Sales | L320072 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-338B |
References
- Gilbert-Barness, E.
- Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
- Pamanji, R., et al. Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).
- Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).
- Mantecca, P., et al. Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties. Toxicol Sci. , (2015).
- Jensen, F. B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).
- Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing). Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- CDC. Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water--LaGrange County, Indiana, 1991-1994. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).
- Brender, J. D., et al. Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study. Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).
- Huber, J. C., et al. Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study. Nutr J. 12, 34 (2013).
- Phillips, W. E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia. Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).
- Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).
- Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation. Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).
- Gupta, S. K., et al. Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water. Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).
- Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America. Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).
- Greer, F. R., Shannon, M. Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).
- Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants. Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).
- Reregistration Eligibility Decision: Inorganic Nitrate/Nitrite (Sodium and Potassium Nitrates). , U.S. Environmental Protection Agency. Available from: http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/old_reds/4052red.pdf (1991).
- Virtanen, S. M., et al. Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).
- Case Studies in Environmental Medicine: Nitrate/Nitrite Toxicity. , U.S. Agency for Toxic Substances and Diseases Registry. Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/HEC/CSEM/nitrate/docs/nitrate_nitrite.pdf (2001).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).
- Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
- Loucks, E., Carvan, M. J. Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).
- Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome. Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).
- Li, J., Jia, W., Zhao, Q. Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling. PLoS One. 9 (3), e92728 (2014).
- Methods for chemical analysis of water and wastes. , United States Environmental Protection Agency. Cincinnati, OH. Environmental Monitoring and Support Laboratory, Office of Research and Development (1983).
- Loucks, E., Ahlgren, S. Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure. J Vis Exp. (61), (2012).
- Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , book 5 1-26 (1996).
- Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports. Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).
- Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite. Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).
- Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium. Forensic Research. 6, (2015).
- Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
