Abstract
NK细胞细胞毒性是一种广泛使用的度量，以确定外部干预的对NK细胞功能的影响。然而，该测定的准确性和重复性可以认为不稳定的，或者是因为用户的错误，或者因为NK细胞的实验操纵的敏感性。为了消除这些问题，即它们减少到最低限度的工作流正式成立，这里提出。为了说明，我们获得的血液样品中，在不同的时间点，从流道（N = 4）被提交给运动的激烈比赛的。首先，NK细胞被同时确定，并通过CD56标记和基于磁分选分离，直接从全血和从少1毫升。排序后的NK细胞被删除任何试剂或封盖抗体。他们可以以每毫升血液建立一个准确的NK细胞数量进行计数。其次，分类NK细胞（细胞效应或E）可以与3,3'- Diotade混合cyloxacarbocyanine高氯酸盐（DIO）标记的K562细胞（靶细胞或T）在一个测定最优1:5 T：E比率，并分析使用成像流式细胞仪，其允许每个事件的可视化和任何假阳性的消除或假阴性（如双峰或效应细胞）。该工作流可以在大约4小时内完成，并允许甚至与人类的样品时非常稳定的结果。空闲时，研究团队可以在人类受试者的测试几种实验的干预措施，并比较不同的几个时间点测量，而不影响数据的完整性。
Introduction
自然杀伤细胞是先天免疫系统的一个基本要素。而他们非常规，他们必须识别并通过细胞-细胞接触，而不事先活化1消除异常细胞的能力。因此，它们构成抵御感染的快速线。运动，尤其是剧烈的，已经显示出瞬时抑制免疫系统的2，3，4，5。 NK细胞是特别容易出现这种效果4，6，7，从而有效地创建增强疾病敏感性的一个窗口。因此，干预措施的研究之前，期间或剧烈运动后以减少其对NK细胞功能的影响的目的是为运动员后比赛福祉特别的兴趣。
8，在白血细胞室的约1％; 2）NK细胞对压力非常敏感，依靠不断的暴露在生理条件下保持在实验过程中可行，稳定;和3）的标准测定法来确定NK细胞细胞毒性，如聚蔗糖梯度9和释放测定法10中 ，是不可靠的和不一致的。人样品的固有变异性只会加重了这些问题。干预期间收集的新鲜人类样本是相当受管制，很难弄到，相对于动物的样品或永生细胞系的至少。这减少的机会，重复实验或增加参与者的研究队列达到显著的统计阈值。总的来说，这些问题的支持简化协议，允许FO的需要R 2均高吞吐量和人类样品中NK细胞裂解活性的高可靠性分析。
我们建立了缩短所需的时间，以确定，同时尽量减少暴露于外来因素从人全血分离和测试NK细胞的工作流。该方法优化了使用两个仪器，在基于磁细胞分选和流式细胞仪的成像流，和一个特定的化验-，优化的T：E比率为允许减少或NK细胞细胞毒性的增加的检测。
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Protocol
注：所有采血程序是按照由阿巴拉契亚州立大学（ASU）机构审查委员会（IRB）规定的准则进行。
1.全采血车
- 有一个认证抽血根据世界卫生组织的指引抽血。
- 抽血到含有二钾乙二胺四乙酸14毫升采血管（K 2 EDTA）。根据制造商的说明倒置血液收集管。保持采血管在室温下在台式摇杆，直到分离。
2. DIO-标记的靶细胞的制备
- 生长K562细胞中完整的Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基（IMDM）补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素链霉素为之前测定，以保证细胞的健康几个星期。调整concentrat细胞的离子至3×10 5个细胞/ mL每日通过的小区的完成计数和细胞随后通过。执行完整的媒体变化每2至3天。
- 在测定当天，执行使用1细胞计数：1血细胞计数。
- 从K562烧瓶除去10μL的并放入1.5毫升管中。
- 加台盼蓝染料的10微升到同为1.5毫升管为1:1的稀释因子：1。
- 轻轻一抖管混合K562细胞台盼蓝染料。
- 允许的K562细胞的台盼蓝染料孵育在室温下1分钟。
- 从管中取出染K562细胞的15微升。
- 吸移管到血球细胞计数。
- 算在四角方块细胞以及总共五个方块的中间正方形。
- 通过使用方程式计算细胞计数：
总细胞/ mL =总细胞数×（稀释倍数/平方数）×10000个/毫升
- 对未染色的K562靶细胞，以1×10 6个细胞/ mL的密度加10毫升的K562靶细胞于一个15毫升管，共10×10 6个 K562细胞。放入37℃培养箱中，用5％ 的 CO 2，直到准备使用。
- 对于DIO染的K562靶细胞，以1×10 6个细胞/ mL的密度加10毫升的K562靶向细胞于一个15毫升管，共10×10 6个 K562细胞。
- 添加细胞悬浮液的每毫升1 DIOμL的细胞标记溶液中指定为DIO染色，轻轻涡旋15ml试管。例如，以1×10 6个细胞/ mL的量添加的DIO细胞标记溶液10微升至10×10 6个 K562细胞/ ml。
- 在一个15毫升管20分钟孵育的K562-DIO溶液，在37℃，5％的CO 2。
- 跟随ING孵育，添加3毫升室温磷酸盐缓冲盐水（PBS），以含有15毫升管的K562-DIO溶液。
- 在室温下以135 xg离心离心10分钟。
- 小心取出上清液，而不会干扰与1000微升音量可调移液器细胞沉淀。
- 加入10 mL新鲜IMDM至15毫升管细胞含丸。
- 轻轻涡管向悬浮细胞。
- 重复步骤2.7至2.10两次。
- 商店的细胞在37℃培养箱，用5％ 的 CO 2，直到准备使用。
注：细胞可以存储在培养箱长达24小时，但它是优选使用它们在同一天。
3.控制的制备
- 传输以下为单独的和适当的标记好的1.5毫升管：
- 补充新鲜IMDM 500微升含有悬浮DIO标记的K562细胞进入“双重利好”标记1.5毫升管。
- 加入新鲜的IMDM 500μL含有悬浮DIO标记的K562细胞进入“仅DIO”标记1.5毫升管。
- 添加含悬浮的未标记的K562细胞到新鲜的IMDM的500μL“碘化丙锭（PI）的唯一的”标记的1.5mL管中。
- 放置双阳性和PI仅管在55℃水浴中5分钟。
- 在5分钟已经过去之后，取出管和擦拭用70％的乙醇。
- 加入10升PI的双阳性和PI只有1.5毫升管。
- 放置所有三个的K562靶细胞对照在孵化器在37℃下30分钟。
- 后30分钟温育已经过去时，离心机所有三种的K562靶细胞对照为在163×g下2分钟。
- 小心取出上清液，而不会干扰细胞沉淀。
- 悬浮用新鲜的IMDM细胞培养基20μL的各控制，并在37℃培养箱，用5％ 的 CO 2离开至少30分钟最佳DIO信号。
注意：控制现在已经准备好通过成像流式细胞仪运行。
4. NK细胞分离自动化
- 打开电池用隔板，并允许启动周期来完成。
- 确保所有液体的瓶子照明是绿色的，该废液瓶是空的。
- 获得室温15毫升管架。
注意：选择是基于样品体积。例如，对于一个容积小于3毫升使用15毫升管架和用于体积超过3毫升用50毫升管架。 - 标签样品管据此（每个样品/参与者重复）：参与者1全血样品;参与者1负分数;参与者1正分数。
- 轻轻吸取1.5毫升的全血，从1.2步进入“全血样本”15毫升管。
- 从步骤4.5将适当标记的15毫升“全血样品”管和标签15毫升“阴性部分”和从管架4.4步“阳性分数”管。使用以下几部件样品架设置：行（R1）A：全血标本，行（R2）B：阴性，未标记的部分，行（R4）C：正，磁标记部分。
- 插入分隔架到MiniSampler为autolabeling。
- 选择“试剂”的菜单上并突出，其中所述小瓶将被放置在隔板架的位置。
- 选择“读取试剂”激活二维码阅读器。
- 放置在从读码器盖0.5-2.5厘米之间的二维码阅读器的前部的适当的试剂瓶中。
注意：例如，对于NK细胞分离所需要的试剂是CD56。 - 在二维码阅读器前最佳阅读的角度握住试剂瓶。
- 将试剂瓶到适当的分离器机架位置。
- 突出显示在屏幕上分离选项卡下的所需的位置。
- 从标签子菜单，分配一个保姆tolabeling程序。
- 分配细胞分离试剂CD56微珠机架位置1,2，3和4。
- 选择“posselwb”离职计划。
- 选择“冲洗”洗程序。
- 将在“卷”子菜单使用数字键盘1500μL的样本量。
- 选择键盘上的“Enter”选项。
- 选择“运行”，启动细胞分离。
- 选择“确定”，以确认有足够的缓冲区可用于处理所有样本。
5. NK细胞计数随着细胞分离
- 紧随与细胞分离细胞分离，检索阳性部分。留在室温下。这个级分含有所需纯的NK细胞群。
- 对于每个单独的样本，执行使用血球按照步骤2.2中的细胞计数。
- 计算后，记录细胞计数。
6.细胞毒性测定样品的制备
- 准备和相应的标签1.5 mL管每个样品/参与者。
- 吸管所需NK细胞和DIO-标有K562细胞比到每个管中。
注意：例如，K562靶细胞和NK效应细胞的所需的比例为1：5。 - 离心机在135×g下5分钟。
- 小心取出上清液，而不会干扰细胞沉淀。
- 重悬的NK-DIO标记的K562细胞混合物中的NK细胞培养基的500微升无白细胞介素-2（IL-2）和2-巯基乙醇（2-ME）（不完全的NK细胞培养基）。
注：不完全的NK细胞培养基是最低基本培养基Eagle用碳酸氢钠，不含L-谷氨酰胺，核糖核苷和脱氧核糖核苷。 - 添加5μL的PI的每管。
- 离心机在163×g下2分钟。
- 孵育细胞在37℃下2小时。
- 继2小时培养，centrifuGE在163×g的2分钟。
- 小心取出上清液，而不会干扰细胞沉淀。
- 悬浮细胞在25μL的不完整的NK细胞培养基。
7.准备自发的（“S”）样本
- 吸移管将500μlDIO标记K562细胞到1.5mL管中（1×10 6个细胞/ mL的浓度）。
- 加的PI的10微升每管。
- 离心管在163×g下2分钟。
- 孵育细胞在37℃下2小时。
- 继2小时培养，离心机在163×g的2分钟。
- 小心取出上清液，而不会干扰细胞沉淀。
- 悬浮细胞在25μl的不完整的α-最低必需培养基（α-MEM）的细胞培养介质。
8.数据采集与成像流式细胞仪
- 按成像前门内侧的绿色按钮，流式细胞仪，打开仪器。
- 打开人与成像相关联的升计算机流式细胞仪。
- 启动软件流式细胞仪成像流程。
- 点击“启动”按钮，冲洗系统，并准备样品线。
- 一旦“启动”完成后，关闭了“校准”窗口。
- 分配渠道：在顶部左侧，为了给它们分配点击每个通道上。
- 在右侧，点击散点图按钮创建4散点图：生最大像素_MC_6 VS Area_M06，原最大像素_MC_2 VS Area_M02，原最大像素_MC_5 VS Area_M05和FieldArea_M01 VS AspectRatio_M01。
- 开始先使用“双重利好”控制分析样品。
- 点击“加载”。
- 将1.5 ml管从3.4步“双积极”样品3.9到样品装载器。
- 在“放大”选项卡下面的40X目标。
- 打开405毫瓦642毫瓦的激光。
- 打开“明场”通道。
- 点击“选择强度。”
- 基于“双阳性”对照样品，确定为405毫瓦的激光所需的强度，这样，探测器不会过载。
注意：例如，对于这个实验的最佳强度设定在11毫瓦。
- 所需的设置，实现后，采集数据。
- 在“文件获取”选项卡，输入自定义的文件名的文本。选择保存数据文件（S）的文件夹。
- 进入细胞的数目，以获得下一个为“收集”。通常，这个数字1000之间变化至10000。
- 点击“采集”。
注意：一旦获取的细胞的期望数目时，数据文件自动保存先前选择的文件夹中。
- 收购完成后，加载下一个对照样品-迪欧唯一控制。
- 点击“加载”。
- 将1.5 ml管的“DIO只是”样品放入样品装载器。
- 请选中“放大”选项卡下的40倍的目标。
- 离开405毫瓦的激光开启。
- 关掉642毫瓦的激光和“明场”通道。
注意：现在，所需的设置已经实现，可以将数据获取。 - 在“文件获取”选项卡，输入自定义的文件名的文本并选择保存数据文件（S）的文件夹。进入细胞的数目，以获得下一个为“收集”。通常此数目为1,000。
- 点击“采集”。
注意：一旦获取单元的期望数量的数据文件自动保存先前选择的文件夹中。
- 重复步骤8.10，为“PI唯一的”对照样品。实验样品现已可供收集。
- 办理remaini纳克实验样品，其中包括“自发的”S“样本”，如下所示：
- 请选中“放大”选项卡下的40倍的目标。
- 接通405毫瓦和642毫瓦的激光。
- 启用“明场”通道。
- 点击“组强度。”
- 在“文件获取”选项卡，输入自定义的文件名的文本并选择保存数据文件（S）的文件夹。输入自定义文件名的文本。
- 进入细胞的数量来获取旁边的“收集”。
- 点击“采集”按钮。
注意：一旦获取单元的期望数量的数据文件自动保存先前选择的文件夹中。
- 重复步骤8.12对所有实验样品。
- 所有的实验数据和文件已被收集后，点击“关闭”按钮，消毒系统。
9. IMAGIN摹流式细胞仪样品分析
- 打开流式细胞仪分析软件应用的摄像流动。
- 在“文件”，打开一个实验.RIF文件。
- 建立一个使用单一颜色.RIF文件（DIO-只控制，只有PI控制，在步骤8.10和8.11创建）选择一个新的矩阵在成像流式细胞仪软件补偿选项卡下的“创建一个新的矩阵”。
注：该软件将提示输入单色文件的选择和将它们合并以创建一个矩阵文件（.ctm文件扩展名），即要被选择应用的信道补偿。 - 通过使用该软件的“积木”功能创建点图。
- 创建一个点图（BrightFieldGradient_RMS VS频率）门聚焦细胞。调用门“焦点访谈”（ 图1A）。
- 使用“焦点访谈”门，共创美好的场区的点积VS明场长宽比至G吃了单细胞。调用门“单”（ 图1B）。
- 使用“单次”门，创造Intensity_MC_Ch02的VS Intensity_MC_Ch5点图。使用此图来识别和门DIO阳性细胞只（目标，活的）和PI-DIO双阳性细胞（靶，死）（ 图1C）。
注：所有地块的步骤9.4.1，9.4.2所述，9.4.3可以通过软件的“积木”功能来创建。
- 点击散点图的统计功能来访问每个门的细胞数量。
- 计算使用下面的公式自发样品中死目标和实验样品的百分比：
样品％的死目标=（#dead目标×100）/（＃活靶子+ #dead目标） - 使用下列公式计算细胞毒性：
％细胞毒性= [（实验死自发死亡）/（100-自发性死亡）]×100
图1：代表直方图，散点图和图像细胞毒活性分析。 （ 一 ）重点细胞分析。 （B）单细胞分析。 （C）靶细胞染色分析。所有测定都使用连接到每个事件的图象制作。这可以在分析软件，只需点击图形上的事件进行访问。 （D）一种双峰事件的代表图像，表示凋亡NK细胞和活的K562靶。 CH01，明视。 CH02，DIO。 CH05，PI。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Representative Results
NK细胞计数的测定
测定对全血中的NK细胞数重运行的效果，使用图2中描述的运动方案。血样的初始抽血后运动前拉伸，运动后即刻，运动后1.5小时，最后24小时和48小时。每全血毫升NK细胞的浓度为每个转轮（ 图3A）和平均（ 图3B）对每个时间点进行测量。
我们的研究结果（ 图3A）显示，参赛1，2，4目前类似的模式与运动后的NK细胞数量略有增加，紧接着急剧下降，24和48小时后，才慢慢恢复正常。这种趋势是通过绘制NK细胞平均数为组选手的特别明显，但无显著差异检测锻炼前的水平。转轮3提出了一个非常高的计数开始，运动和运动后1.5小时后急剧下降，24小时和48小时后，才缓缓恢复正常。在平均，NK细胞计数（ 图3B）1.5小时运动后（显著尽管非）降低，但24小时后是回到接近正常水平。
NK细胞细胞毒性的测定
计算NK细胞计数后，NK细胞，立即成立以确定在协议中的第6部分介绍了他们的细胞毒活性。结果示于图4A中给出了每个单独的转轮，与图4B中描绘的平均NK细胞的细胞毒性。我们的研究结果显示，平均NK细胞活性锻炼和运动后1.5小时（尽管不显著）后略有下降，但24小时后显著上升。相比前期的NK细胞活性仍然很高-exercise的水平，虽然不显著（部分原因是由于在这个试点项目的少数参与者）。
图2： 练习协议 。抽血（红色箭头）被上N = 4选手进行。
图3：NK 细胞计数预锻炼，运动后，1.5小时和21小时后的锻炼。每个全血毫升（A）NK细胞计数每一个人亚军。每个全血毫升（B）的平均NK细胞计数。 N = 4;比例尺=标准误差。
图4：NK细胞的细胞毒性预锻炼，运动后，1.5小时和21小时后的锻炼。 （A）的NK细胞细胞毒性（表示为死靶细胞的百分比）为每个单独的转轮。 （B）的平均NK细胞细胞毒性（表示为死靶细胞的百分比）。 N = 4;比例尺=标准误差; *：P <0.05; **：P <0.005。
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Discussion
在这项研究中所描述的方法直接测量一个人的NK细胞响应于刺激的比活性（在此特定情况下，长时间运动）。通常情况下，NK细胞是从使用密度梯度或细胞用标记物的组合排序一个人的血液中分离。虽然这些方法被广泛使用，它们具有许多缺点：它们是耗时的，涉及多个操作，并且在很大程度上依赖于用户的。其结果是，过度的应力被放置在分离的NK细胞，这可以导致增加的可变性，从实验进行实验，甚至是在相同的实验。在本文中，我们描述了利用了基于磁隔离的协议。这允许在个体的全血中高数量的NK细胞的快速和可靠的排序，同时最大限度地减少血液或自然杀伤细胞操纵。
这种方法特别适合于人类的研究，其中的样品是稀疏的，但在另一面，当过于样品需要一起处理的方法变得相当困难。事实上，获得的细胞毒性测定中的窗口必须孵育，这在我们的经验转化为5个样品在在最一次结束后成为通常在30分钟内。如果许多样品要处理，这是建立一个惊人的时间表，以便有足够的时间流式细胞仪采集的关键。该方法的另一缺点可能是相当高的，如果血液更量较高的NK收率处理可迅速消耗的试剂的成本。但是，我们认为，这些费用由节约的时间显著量平衡。
在这个协议中的关键步骤是最为开放的修改的人。关键是要保持在室温下将血液和绘制避免NK细胞应力的一小时内处理。分离后，细胞计数是十分严峻结果的精度，所以计数的方法应该是恒定的：例如用于锥虫蓝测定法确保多个正方形的血细胞计数器计数，并且，该用户或实验室使用相同的标识参数。这里介绍的协议使用1.5毫升的血液和试NK细胞细胞毒性在T：1 E比：5，然而，这些参数可以被优化取决于所需测定和血液的可用量的：如果血少是可用的，则它可以使用比率较低，如1:4或甚至1:3至仍具有合理的采集时间。在我们的经验低比率可能不足以允许一个适当的细胞毒活性。另外，由于样品的变化，它发生的NK细胞计数大于预期低得多;在响应时，它是必要的，以降低靶细胞的量在反应管以保持相同的T：在整个实验E比。在结果分析，最关键的一步是花尽可能多的时间就要取得了良好的基质。如果非常小心以制备在协议的步骤3中描述的控制，这只能得到。一旦如在步骤9中所述门已经建立，文件可以一起分批和串联非常小的变化进行分析。如果有疑问时，用户应该总是通过点击无论如何参考图像库上绘制的曲线图（上看到图1C），以检查是否所有相应的事件包括在适当的门。
在图2A中的代表性的结果表明，3参赛者出4提出了一个类似的模式。 第 4流道的模式可能是特定于该个人，并不代表一个错误的测量。此个体NK细胞计数在人全血两个运动前和48小时后的运动的可接受的范围内的上端。这表明在本文中，其中NK C中描述的方法的优势之一厄尔可以准确地获得。此外，通过单一标记步骤，以获得天然细胞的能力，允许最小的应力和修改NK细胞。当NK细胞细胞毒性被生理胁迫条件下测得的，这是特别关键的。
以下隔离，NK细胞细胞毒性通常是通过流式细胞术或放射性释放测定（铬测定例如）测定。虽然释放试验被认为是黄金标准，他们依靠的是使用放射性同位素和相关设备，这是极其昂贵的。此外，对于放射性物质的使用和处理规定增加复杂到需要的时间效率和精度的实验。使用流式细胞术的方法流是有道理的，但典型的预防措施必须遵循包括激光设置，荧光补偿和门控。当2种不同类型的细胞是在SA这是特别真实mple，因为它是细胞毒性测定法的情况。然而，在我们的情况下，使用的成像流式细胞仪允许图像以每个事件被捕获，且尺寸比参数允许从单个细胞双峰的分离。这是一个关键点，由于细胞毒性测定法依赖于效应器和靶之间的物理接触;很多时候，这些2类型的细胞将流量测量中，仍然在一起，推出假阳性双入结果。这非常点在图1D，其示出了由（垂死，PI阳性）NK细胞形成的双峰示出，和一个（活，DIO阳性，PI阴性）K562细胞。在传统的流式细胞仪，此事件将被添加到K562细胞死亡计数，但实际上是一个假阳性。除去数据确实是有问题的，但它是没有，如果它持续进行，使用从实验很严格的参数进行实验（在这种情况下，“纵横比”参数）。作为回报，所获得的数据将更加稳定。此外，可视化的所有事件允许精确选通（和计数）的基础上的色彩参数每一个事件的，不依赖于所使用的控制传统上建立并没有考虑到可能发生的自然“数据漂移”刚性门流式细胞仪。采集过程中的每一个目标事件成像的附加功能，允许单个改善门（仅DIO，占活靶细胞）和双染人群（DIO + PI染色，代表死者靶细胞）。
此外，这里提出的工作流进行优化，以考虑到NK细胞的全血中的稀缺和需要准确的结果。虽然传统的NK细胞的细胞毒性实验探索在几个T中的溶解活性：E比率，这是不现实的一对夫妇的原因：1）可用的NK细胞从全血的量是有限的，非常v良莠不齐和2）所需的分析对象细胞的量必须足够大，以允许相当快速采集数据。在不同的比率（此处未示出）的几个测试表明，以1：5 T：E比率，该翻译在4×10 4个 T / 2×10 5] E给出了一个最佳的平衡，并且允许进行大重复性。基于与来自不同个体（这里未示出），该比率也提供了正常样品中的50-70％的预期的细胞毒性活性，它提供了一个显著上方和下方窗口来测量干预的效果样品重复测定。
NK细胞计数类似于在其他作品11，12，13中找到，并在线路与血液14的公认范围的NK细胞的频率。但是，这种新的工作流的优点是表现在图3B中 ，在那里我们检测编NK细胞细胞毒性相比，锻炼前的水平在24小时后，在同一时间点显著增加，尽管这是在平均NK细胞计数（尽管显著非）低。该结果不同于其他已发表的研究，其中的细胞毒性水平大多相同（或甚至更低），以在锻炼前的水平。它表明，而不是被按压一段时间运动后的一个周期长，NK细胞细胞毒性可能能够“回弹”少至21小时后运动后甚至更高的水平。这一观察结果与使用纯净，健康的NK细胞一种新颖的方法，如果证实了后续研究，有可能改变目前的角度出发，大量体力消耗是免疫抑制的潜力。当用Ficoll梯度或基于流式细胞术分选得到的NK细胞，将得到的人口或者与其它类型的细胞混合，包含多个受损NK细胞和/或NK细胞与改性反应。这些后果的，处consi预期dering前述方法的长度，粗糙度和/或不精确。消除这些问题，并在所有的时间呆在接近生理状态，会导致实验结果比较有代表性的NK细胞在体内的行为。
总而言之，我们描述一个综合的工作流程，允许一个快速，准确的NK细胞细胞毒性的小人血液样本可避免一些与其他方法相关的限制的分离和检测。而人血是此工作的重点，值得注意的是，这种方法可以适用于动物的血液样品。此工作流是非常可重复的，并且可以检测小的变化，这对于运动的研究，其中参与者号码被获取有限和串行血液措施特别有价值的。正如代表结果强调，这种改进方法有挑战，提高运动免疫现有知识的潜力，以及与NK免疫监控等领域。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
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