Abstract
Cytotoxicité des cellules NK est une mesure largement utilisée pour déterminer l'effet d'une intervention extérieure sur la fonction des cellules NK. Cependant, la précision et la reproductibilité de cet essai peut être considéré comme instable, soit à cause des erreurs de l'utilisateur ou du fait de la sensibilité des cellules NK à une manipulation expérimentale. Pour éliminer ces problèmes, un flux de travail qui les réduit à un minimum a été créé et est présenté ici. Pour illustrer, nous avons obtenu des échantillons de sang, à divers moments, des coureurs (n = 4) qui ont été soumis à un combat intense d'exercice. Tout d'abord, les cellules NK sont simultanément identifiés et isolés par CD56 de marquage et de tri magnétique à base, directement à partir de sang total et d'aussi peu que un millilitre. Les cellules NK triées sont retirées de tous les anticorps de réactifs ou de coiffage. Ils peuvent être comptés afin d'établir un décompte précis des cellules NK par millilitre de sang. Deuxièmement, les cellules NK (cellules triées effecteurs ou E) peuvent être mélangés avec 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perchlorate (DIO) marqué des cellules K562 (cellules cibles ou T) à un 1 dosage optimal: 5 T: rapport E et analysé à l'aide d'un flux-cytomètre d'imagerie qui permet la visualisation de chaque événement et l'élimination de tout faux positif ou de faux négatifs (tels que des doublets ou des cellules effectrices). Ce flux de travail peut être complété en environ 4 h, et permet des résultats très stables, même lorsque l'on travaille avec des échantillons humains. Lorsqu'elles sont disponibles, les équipes de recherche peuvent tester plusieurs interventions expérimentales chez des sujets humains, et de comparer les mesures à travers plusieurs points de temps sans compromettre l'intégrité des données.
Introduction
Les cellules tueuses naturelles sont un élément essentiel du système immunitaire inné. Alors qu'ils sont très réglementés, ils ont la capacité de reconnaître et d' éliminer les cellules anormales par contact de cellule à cellule et sans activation préalable 1. En tant que tel, ils forment une ligne rapide de défense contre les infections. L' exercice, surtout intense a été montré pour déprimer le système immunitaire transitoirement 2, 3, 4, 5. Les cellules NK sont particulièrement sujettes à cet effet , 4, 6, 7, créant ainsi une fenêtre d' une sensibilité accrue aux maladies. Par conséquent, l'étude des interventions avant, pendant ou après un exercice intense dans le but de réduire son impact sur la fonction des cellules NK est d'un intérêt particulier pour le bien-être des athlètes post-concours.
8, à environ 1% du blanc compartiment des cellules sanguines; 2) Les cellules NK sont très sensibles au stress et reposent sur une exposition constante à des conditions physiologiques pour rester viable et stable au cours de l'expérimentation; et 3) des tests standard pour déterminer la cytotoxicité des cellules NK, tels que les gradients de Ficoll 9 et libèrent des essais 10, ne sont pas fiables et incohérentes. La variabilité inhérente des échantillons humains ne font qu'aggraver ces problèmes. échantillons humains frais prélevés lors d'interventions sont assez réglementé et difficile à se procurer, au moins par rapport à des échantillons d'animaux ou de lignées cellulaires immortalisées. Cela réduit les possibilités de répéter des expériences ou ajouter des participants à la cohorte de l'étude pour atteindre les seuils statistiques significatives. Collectivement, ces questions prennent en charge la nécessité d'un protocole simplifié qui permet for à la fois à haut débit et une analyse de haute fiabilité de NK activité lytique des cellules dans des échantillons humains.
Nous avons établi un flux de travail qui réduit le temps nécessaire pour identifier, isoler et les cellules NK de test à partir de sang total humain, tout en minimisant l'exposition à des facteurs externes. La méthode optimise l'utilisation des deux instruments, un trieur magnétique à base de cellules et d'un flux d'imagerie cytomètre et un spécifique de test, T optimisé: rapport E pour permettre la détection d'une diminution ou une augmentation de cytotoxicité des cellules NK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Toutes les procédures de collecte de sang ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices énoncées par l'Appalachian State University Board Review (ASU) Institutionnel (CISR).
1. Toute la collection de sang
- Avoir un phlébotomiste certifié prélever du sang selon les directives de l'Organisation mondiale de la Santé.
- Prélever le sang dans un tube de 4 ml de collecte de sang contenant de l' acide Dipotassique éthylènediaminetétraacétique (EDTA K 2). Invertir le tube de prélèvement de sang selon les instructions du fabricant. Gardez le tube de collecte de sang à la température ambiante sur une bascule paillasse jusqu'à la séparation.
2. Préparation des cellules cibles marquées DiO
- Cultiver des cellules K562 dans son Complete Iscove modifié Médias Dulbecco (IMDM) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline streptomycine pendant plusieurs semaines avant l'essai pour assurer la santé des cellules. Réglez le concentration des cellules à 3 x 10 5 cellules / mL par jour grâce à la réalisation d'une cellule de comptage et le passage ultérieur des cellules. Effectuer un changement de support complet tous les 2 à 3 jours.
- Le jour de l'essai, effectuer une numération cellulaire en utilisant un mélange 1: 1 hémocytomètre.
- Retirer 10 ul du flacon K562 et le placer dans le tube 1,5 ml.
- Ajouter 10 pl de colorant bleu trypan dans le même tube de 1,5 ml pour un facteur de dilution de 1: 1.
- Doucement le tube flick pour mélanger des cellules K562 et colorant bleu trypan.
- Laisser K562 colorant bleu cellule trypan à incuber pendant 1 min à température ambiante.
- Retirer 15 ul de cellules K562 colorées du tube.
- Pipette sur hémocytomètre pour le nombre de cellules.
- Compter les cellules dans les quatre cases de coins, ainsi que la place centrale pour un total de cinq places.
- Calculer le nombre de cellules en utilisant l'équation suivante:
cellules totales / ml = Total cellules comptées X (facteur de dilution / Nombre de places) X 10000 / mL
- Pour les cellules cibles K562 non marquées, ajouter 10 ml de cellules cibles K562 à une 15 tubes ml à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml pour un total de 10 x 10 6 cellules K562. Placer dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2 jusqu'à ce que prêt à l' emploi.
- Pour les cellules cibles DiO teinté K562, ajouter 10 ml de K562 cible les cellules à un 15 tube de ml à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml pour un total de 10 x 10 6 cellules K562.
- Ajouter 1 pl de DiO solution cellulaire étiquetage par ml de suspension cellulaire dans 15 ml tube désigné pour DiO coloration et doucement vortex. Par exemple, ajouter 10 ul de solution DiO cellule marquage à 10 x 10 6 cellules K562 / ml à un volume de 1 x 10 6 cellules / ml.
- Incuber solution K562-DIO pendant 20 min à 37 ° C avec 5% de CO 2 dans un tube de 15 ml.
- Suivreing incubation, ajouter 3 ml de solution saline température ambiante tamponnée au phosphate (PBS) à la solution K562-DiO contenant 15 ml tube.
- Centrifuger pendant 10 min à 135 xg à la température ambiante.
- Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire avec un volume réglable pipette 1000 pi.
- Ajouter 10 ml de IMDM frais à culot cellulaire contenant 15 ml tube.
- Doucement tube vortex pour remettre en suspension les cellules.
- Répétez les étapes 2.7 à 2.10 deux fois plus.
- Stocker les piles dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2 jusqu'à ce que prêt à l' emploi.
Note: Les cellules peuvent être stockées dans l'incubateur pendant au moins 24 h, mais il est préférable de les utiliser sur le même jour.
3. Préparation des commandes
- Transférer le suivant dans 1,5 ml tubes séparés et étiquetés de manière appropriée:
- Ajouter 500 pi de IMDM frais contenant remis en suspension DiO marqué des cellules K562 dans le "Double positif" étiqueté tube de 1,5 ml.
- Ajouter 500 pi de IMDM frais contenant remis en suspension les cellules K562 DiO marquées dans le "DiO seulement" tube de 1,5 ml étiqueté.
- Ajouter 500 pi de IMDM frais contenant des cellules K562 non marquées remises en suspension dans le "iodure de propidium (PI) que" tube de 1,5 ml étiqueté.
- Placer le positif Double et PI seulement tubes dans un bain d'eau à 55 ° C pendant 5 min.
- Après 5 min écoulé, retirer les tubes et essuyez avec 70% d'éthanol.
- Ajouter 10 L de PI à la Positive Double et PI seulement 1,5 ml tubes.
- Placer tous les trois contrôles K562 de cellules cibles dans l'incubateur à 37 ° C pendant 30 min.
- Après 30 minutes d'incubation est écoulée, centrifuger les trois K562 contrôles de cellules cibles pendant 2 min à 163 x g.
- Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire.
- Resuspendre chaque contrôle avec 20 ul de milieu frais de culture cellulaire IMDM, et laisser dans le 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2 pendant au moins30 min pour le signal de DiO optimal.
REMARQUE: Les contrôles sont maintenant prêts à être exécutés à travers le flux d'imagerie cytomètre.
4. cellules NK Séparation automatique
- Allumez séparateur de cellules et laisser le cycle de démarrage pour terminer.
- Veiller à ce que toutes les bouteilles enluminures fluides sont verts et que la bouteille de déchets est vide.
- Obtenir un rack tube mL température 15 ambiante.
NOTE: La sélection est basée sur des volumes d'échantillons. Par exemple, pour un volume inférieur à 3 ml d'utiliser un support de tube de 15 ml et un volume de plus de 3 ml d'utiliser un support de tube de 50 ml. - tubes d'échantillons d'étiquettes en conséquence (Répéter par échantillon / participant): Participant 1 échantillon de sang; Participant 1 fraction négative; Participant 1 fraction positive.
- pipette doucement 1,5 ml de sang total de l'étape 1.2 dans "échantillon de sang total" 15 ml tube.
- Placez correctement étiquetés 15 ml "échantillon de sang total" tube de l'étape 4.5 et marqué 15 mL "Fraction négative" ettubes "Fraction positive" de l'étape 4.4 dans le rack du tube. Utilisez rack d'échantillons thefollowing set-up: Row (R1) A: échantillon de sang total, Rangée (R2) B: Négatif, fraction non marquée, Rangée (R4) C: Positif, fraction magnétiquement marqué.
- Insérez le séparateur en rack sur le MiniSampler pour autolabeling.
- Sélectionnez "réactif" dans le menu et mettre en évidence la position où le flacon sera placé dans le rack de séparation.
- Sélectionnez "Lire réactif" pour activer le lecteur de code 2D.
- Placer le flacon de réactif approprié devant le lecteur de code 2D entre 0,5-2,5 cm du couvercle du lecteur de code.
REMARQUE: par exemple, le réactif nécessaire pour la séparation des cellules NK CD56. - Tenir flacon de réactif à un angle en face du lecteur de code 2D pour une lecture optimale.
- Placer le flacon de réactif dans la position correcte de la grille de séparation.
- Mettre en évidence les positions souhaitées sous l'onglet de séparation sur l'écran.
- Dans le sous-menu d'étiquetage, d'attribuer une fille auprogramme de tolabeling.
- Attribuer la cellule de séparation microbilles réactif CD56 à accumuler les positions 1, 2, 3 et 4.
- Sélectionnez le programme de séparation "de posselwb".
- Sélectionnez le "rinçage" programme de lavage.
- Insérez un volume d'échantillon de 1500 pi dans le "Volume" sous-menu à l'aide du pavé numérique.
- Sélectionnez l'option "Enter" sur le clavier.
- Sélectionnez "Exécuter" pour commencer la séparation des cellules.
- Sélectionnez "OK" pour confirmer que le tampon assez est disponible pour le traitement de tous les échantillons.
5. NK Cell Count Après séparation cellulaire
- Immédiatement après la séparation des cellules avec le séparateur de cellules, de récupérer la fraction positive. Laisser à température ambiante. Cette fraction contient la population de cellules NK pur souhaitée.
- Pour chaque échantillon, effectuer un comptage des cellules en utilisant un hémocytomètre selon l' étape 2.2.
- Après les calculs, enregistrer le nombre de cellules.
6. Essai de cytotoxicité Préparation d'échantillons
- Préparer et étiqueter les tubes de 1,5 mL pour chaque échantillon / participant en conséquence.
- Pipette désiré rapport des cellules NK et les cellules K562 DiO-labled dans chaque tube.
REMARQUE: par exemple, le rapport désiré de cellules cibles K562 et des cellules effectrices NK est de 1: 5. - Centrifuger pendant 5 min à 135 x g.
- Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire.
- Remettre en suspension NK-DIO marqué mélange de cellules K562 dans 500 ul de milieu de cellules NK sans interleukine-2 (IL-2) et 2-mercaptoéthanol (2-ME) (NK incomplète des milieux de culture cellulaire).
NOTE: Le NK milieux de culture cellulaire incomplète est du milieu essentiel minimum d'Eagle avec du bicarbonate de sodium, sans L-glutamine, ribonucléosides et désoxyribonucléosides. - Ajouter 5 ul de PI à chaque tube.
- Centrifugeuse pendant 2 min à 163 x g.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 h.
- Après 2 heures d'incubation, centrifuge pendant 2 min à 163 x g.
- Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire.
- Resuspendre les cellules dans 25 ul incomplet NK milieux de culture cellulaire.
7. Préparation de spontanée ( «S») Echantillon
- Pipette 500 pi de cellules K562 DiO marqués (concentration de 1 x 10 6 cellules / mL) en tube de 1,5 ml.
- Ajouter 10 pi de PI à chaque tube.
- Tube à centrifuger pendant 2 min à 163 x g.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 h.
- Après 2 heures d'incubation, centrifuger 2 min à 163 x g.
- Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire.
- Resuspendre les cellules dans 25 ul incomplète Essential Medium (α-MEM) des milieux de culture de cellules alpha-minimum.
8. Acquisition de données avec imagerie cytomètre de flux
- Appuyez sur le bouton vert à l'intérieur de la porte d'entrée de l'imagerie cytomètre en flux pour allumer l'instrument.
- Allumez all ordinateurs associés à l'imagerie du cytomètre en flux.
- Lancer le flux d'imagerie cytomètre logiciel.
- Cliquez sur le bouton "Démarrage" pour purger le système et préparer la ligne d'échantillon.
- Une fois que le "démarrage" est terminée, fermez la fenêtre "étalonnages".
- Attribuer canaux: sur le côté supérieur gauche, cliquez sur chaque canal afin de les affecter.
- Du côté de la main droite, cliquez sur le bouton de nuage de points pour créer 4 diagrammes de dispersion: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 et FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
- Commencez l' analyse d' échantillons en utilisant d' abord la commande "Double Positive".
- Cliquez sur "Load".
- Placer le tube de 1,5 ml avec l'échantillon "Double Positive" de Steps 3.4 à 3.9 dans l'échantillon chargeur.
- Sélectionnez l'objectif 40X sous l'onglet «Grossissement».
- Allumez le mW 405 etDes lasers à 642 mW.
- Tourner sur le canal "Brightfield".
- Cliquez sur "Sélectionner l'intensité."
- Sur la base de l'échantillon de contrôle "Double positif", déterminer l'intensité souhaitée pour le laser de 405 mW de sorte que le détecteur ne soit pas surchargé.
Remarque: Par exemple, l'intensité optimale pour cette expérience a été fixée à 11 mW.
- Après la mise en place souhaitée est atteinte, l' acquisition de données.
- Sous l'onglet "Fichier Acquisition", entrez dans un texte personnalisé de nom de fichier. Sélectionnez un dossier pour enregistrer le fichier (s) de données.
- Entrez le nombre de cellules d'acquérir à côté de "Collect". Généralement, ce nombre varie entre 1.000 à 10.000.
- Cliquez sur "Acquire."
NOTE: Une fois que le nombre souhaité de cellules est acquise, le fichier de données est automatiquement enregistrée dans le dossier sélectionné précédemment.
- Après l' acquisition terminée, charger le prochain échantillon de contrôle - DiO seul contrôle.
- Cliquez sur "Load".
- Placer le tube de 1,5 ml avec le "DiO seulement" échantillon dans le chargeur.
- Laissez l'objectif 40X sous l'onglet «Grossissement» sélectionné.
- Laisser le laser de 405 mW allumé.
- Eteignez le laser 642 mW et le canal "Brightfield".
NOTE: Maintenant que le set-up souhaité a été atteint, les données peuvent être acquises. - Sous l'onglet "Fichier Acquisition", entrez dans un texte personnalisé de nom de fichier et sélectionnez un dossier pour enregistrer le fichier (s) de données. Entrez le nombre de cellules d'acquérir à côté de "Collect.". Généralement, ce nombre est de 1000.
- Cliquez sur "Acquire."
NOTE: Une fois que le nombre souhaité de cellules est acquise le fichier de données est automatiquement enregistrée dans le dossier sélectionné précédemment.
- Répétez l'étape 8.10 pour le "PI seulement" échantillon de contrôle. Les échantillons expérimentaux sont maintenant prêts à être collectés.
- Manipuler les remaining échantillons expérimentaux, y compris les "échantillons" S "spontanées" comme suit:
- Laissez l'objectif 40X sous l'onglet «Grossissement» sélectionné.
- Allumez le 405 mW et 642 mW lasers.
- Allumez le canal "Brightfield".
- Cliquez sur "Définir l'intensité."
- Sous l'onglet "Fichier Acquisition", entrez dans un texte personnalisé de nom de fichier et sélectionnez un dossier pour enregistrer le fichier (s) de données. Entrez dans un texte personnalisé de nom de fichier.
- Entrez le nombre de cellules d'acquérir à côté de "Collect."
- Cliquez sur le bouton "Acquire".
NOTE: Une fois que le nombre souhaité de cellules est acquise le fichier de données est automatiquement enregistrée dans le dossier sélectionné précédemment.
- Répétez l'étape 8.12 pour tous les échantillons expérimentaux.
- Après toutes les données expérimentales et les fichiers ont été collectés, cliquez sur le bouton "Arrêter" pour stériliser le système.
9. Imaging cytomètre de flux Analyse d'échantillon
- Ouvrir le flux d'imagerie cytomètre application logicielle d'analyse.
- Sous "Fichier", ouvrir un fichier .rif expérimental.
- Construire une nouvelle matrice en utilisant les fichiers .rif de couleur unique (DIO uniquement contrôler et PI-seulement le contrôle, créé au cours des étapes 8.10 et 8.11) en sélectionnant «Créer un nouveau Matrix" sous l'onglet Compensation dans le flux d'imagerie cytomètre logiciel.
REMARQUE: Le logiciel vous demandera la sélection des fichiers d'une seule couleur et de les fusionner pour créer un fichier de matrice (extension de fichier .ctm), qui doit être sélectionné pour appliquer une compensation de canal. - Créer des parcelles de points en utilisant la fonction "blocs de construction" du logiciel.
- Créer un point-plot (BrightFieldGradient_RMS vs fréquence) à la porte des cellules ciblées. Appelez la porte "Focus" (figure 1A).
- Utilisation de la porte "Focus", créez un tracé de points de Bright Zone Champ vs brillant Champ Aspect Ratio à g mangé les cellules singlet. Appelez la porte "Single" (figure 1B).
- Utilisation de la porte "Single", créer un terrain dot de Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Utilisez ce terrain pour identifier et porte des cellules doubles positives (cibles, morts) DiO positif seules les cellules (cibles, vivant) et PI-DiO (figure 1C).
NOTE: Toutes les parcelles décrites dans les étapes 9.4.1, 9.4.2 et 9.4.3 peuvent être créés en utilisant la fonction "blocs de construction" du logiciel.
- Cliquez sur la fonction statistique du tracé de points pour accéder aux numéros de cellules de chaque porte.
- Calculer le pourcentage de cibles mortes dans l'échantillon spontanée et des échantillons expérimentaux utilisant la formule suivante:
% des cibles mortes dans l'échantillon = (cibles de #dead x 100) / (# vivent cibles + #dead cibles) - Calculer la cytotoxicité en utilisant la formule suivante:
% Cytotoxicité = [(expérimentale mort spontanée morts) / (100 morts-spontanée)] x100
Figure 1: histogrammes représentatifs, des diagrammes de dispersion et des images pour l' analyse de l' activité cytotoxique. Analyse (A) de la cellule de mise au point. (B) seule analyse cellulaire. (C) Analyse de coloration de la cellule cible. Toutes les déterminations sont faites en utilisant l'image jointe à chaque événement. Cela peut être consulté dans le logiciel d'analyse en cliquant simplement sur l'événement sur les graphiques. (D) d'image représentative d'un événement de doublet, montrant une cellule apoptotique NK et une cible de K562 en direct. Ch01, Brightfield. Ch02, DiO. CH05, PI. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Détermination de NK numération cellulaire
L'effet de la course lourde sur NK numération des cellules dans le sang total a été mesurée en utilisant le protocole d'exercice décrit à la figure 2. Des échantillons de sang ont été prélevés avant l'exercice, immédiatement après l'exercice, 1,5 h après l'exercice, et enfin 24 et 48 h après le prélèvement sanguin initial. La concentration des cellules NK par ml de sang total a été mesurée pour chaque canal de coulée (figure 3A) et en moyenne (figure 3B) pour chaque point de temps.
Nos résultats (Figure 3A) montrent que les coureurs 1, 2 et 4 présentent une tendance similaire avec une légère augmentation de NK nombre de cellules après l' exercice, immédiatement suivie d'une forte baisse, de retour avant de lentement à la normale après 24 et 48 h. Cette tendance est particulièrement visible en représentant graphiquement les moyennes des cellules NK pour le groupe de coureurs, mais aucune différence significative par rapportles niveaux pré-exercice a été détecté. Runner 3 a présenté un nombre très élevé au départ, qui a fortement diminué après l'exercice et 1,5 h après l'exercice, de retour avant de lentement à la normale après 24 et 48 h. En moyenne, le nombre de cellules NK (figure 3B) a diminué de 1,5 h après l' exercice (quoique non significative) , mais était de retour à des niveaux proches de la normale après 24 h.
Détermination de la cytotoxicité des cellules NK
Après avoir calculé le nombre de cellules NK, les cellules NK ont été immédiatement mis en place afin de déterminer leur activité cytotoxique tel que décrit à l'article 6 du protocole. Les résultats sont présentés sur la figure 4A , pour chaque coureur individuel, à la figure 4B montrant la cytotoxicité des cellules NK moyenne. Nos résultats montrent que la cytotoxicité moyenne NK a légèrement diminué après l'exercice et 1,5 h après l'exercice (quoique non significative), mais a augmenté de façon significative après 24 h. La cytotoxicité NK est restée élevée par rapport à la préniveaux -Exercice, quoique non significative (en partie à cause du petit nombre de participants à ce projet pilote).
Figure 2: protocole d'exercice. Prélèvements sanguins (flèches rouges) ont été effectuées sur n = 4 coureurs.
Figure 3: les cellules NK compte pré-entraînement, après l'entraînement, 1,5 h et 21 h après l'entraînement. (A) cellules NK nombre par millilitre de sang total pour chaque coureur individuel. (B) cellules NK moyenne comptage par ml de sang entier. N = 4; Les barres d'échelle = erreur standard.
Figure 4:Cellules NK cytotoxicité pré-entraînement, après l'entraînement, 1,5 h et 21 h après l'entraînement. Cytotoxicité (A) NK cellulaire (exprimée en pourcentage de cellules cibles mortes) pour chaque coureur individuel. (B) moyenne de la cytotoxicité des cellules NK (exprimé en tant que pourcentage de cellules cibles mortes). N = 4; Les barres d'échelle = erreur standard; *: P <0,05; **: P <0,005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La méthode décrite dans cette étude mesure directement l'activité spécifique des cellules NK d'un individu en réponse à des stimuli (dans ce cas particulier, l'exercice prolongé). Typiquement, les cellules NK sont isolées à partir de sang en utilisant un gradient de densité ou de tri cellulaire en utilisant une combinaison de marqueurs. Bien que ces méthodes sont largement utilisées, elles présentent de nombreux inconvénients: ils prennent beaucoup de temps, impliquent de multiples manipulations, et sont fortement tributaires de l'utilisateur. Par conséquent, un stress excessif est placé sur les cellules NK isolées, ce qui peut entraîner une augmentation de la variabilité d'une expérience à, ou même au sein de la même expérience. Dans cet article, nous avons décrit un protocole qui utilise l'isolement magnétique à base. Cela permet un tri rapide et fiable d'un nombre élevé de cellules NK dans le sang entier d'un individu, tout en réduisant au minimum la manipulation du sang ou des cellules NK.
Cette méthode est particulièrement adaptée pour les études humaines où les échantillons sont rares, maissur le revers de la méthode devient assez difficile lorsque les échantillons trop doivent être traitées ensemble. En effet, la fenêtre d'acquisition pour le dosage cytotoxique doit être typiquement dans les 30 minutes après la fin de l'incubation, ce qui se traduit dans notre expérience en 5 échantillons à la fois au maximum. Si de nombreux échantillons doivent être traités, il est essentiel d'établir un calendrier stupéfiant de laisser suffisamment de temps pour l'acquisition de cytométrie de flux. Un autre inconvénient de cette méthode pourrait être le coût des réactifs qui sont assez élevés et peuvent être consommés rapidement si plus de quantité de sang est traité pour un rendement de NK supérieur. Cependant, nous croyons que ces coûts sont contrebalancées par la quantité importante de temps économisé.
Les étapes critiques dans ce protocole sont ceux qui sont les plus ouverts à des modifications. Il est essentiel de maintenir le sang à la température ambiante et de traiter dans une heure de dessin pour éviter le stress des cellules NK. Après isolement, le nombre de cellules est extrêmement critique pourla précision des résultats, de sorte que la méthode de comptage doit être constante: par exemple pour le dosage du bleu trypan assurez-vous que plusieurs places sont comptées sur le hémocytomètre, et que l'utilisateur ou le laboratoire utilise les mêmes paramètres d'identification. Le protocole présenté ici utilise 1,5 ml de sang et NK test cytotoxicité cellulaire à un T: E ratio de 1: 5, mais ces paramètres peuvent être optimisés en fonction du dosage souhaité et la quantité disponible de sang: si moins de sang est disponible, alors il est possible d'utiliser des rapports inférieurs tels que 1: 4 ou même 1: 3 à avoir encore le temps d'acquisition raisonnable. Dans notre expérience des rapports inférieurs pourraient être insuffisantes pour permettre une activité cytotoxique appropriée. En outre, en raison de la variation de l'échantillon, il se trouve que le nombre de cellules NK est beaucoup plus faible que prévu; en réponse, il est nécessaire de réduire la quantité de cellules cibles dans des tubes de réaction pour maintenir le même T: rapport E tout au long de l'expérience. Au cours de l'analyse des résultats, l'étape la plus critique est de passer autant de temps que nécessaire pourobtenir une bonne matrice. Cela ne peut être obtenu que si on prend grand soin de préparer les commandes décrites à l'étape 3 du protocole. Une fois que les portes ont été établies comme décrit à l'étape 9, les fichiers peuvent être mis en lots ensemble et analysés en série avec très peu de variation. En cas de doute, l'utilisateur doit toujours se référer à la galerie d'images en cliquant sur un événement tracée sur un graphique (vu sur la figure 1C), afin de vérifier que tous les événements appropriés sont inclus dans la grille appropriée.
Les résultats représentatifs de la figure 2A a montré que 3 coureurs sur 4 ont présenté un modèle similaire. Le motif de la 4 e coureur était probablement spécifique à cette personne et ne représente pas une mesure erronée. Le nombre de cellules NK pour cet individu était à l'extrémité supérieure de la fourchette acceptable dans le sang humain à la fois avant l'exercice entier et 48 heures après l'exercice. Cela démontre l'un des points forts de la méthode décrite dans le présent document, où NK caunes peuvent être obtenus avec précision. En outre, la capacité d'obtenir des cellules natives par une étape de marquage unique, permet un minimum de stress et des modifications des cellules NK. Ceci est particulièrement important lorsque cytotoxicité des cellules NK est mesurée dans des conditions de stress physiologique.
Suite à l'isolation, la cytotoxicité des cellules NK est généralement déterminée par cytométrie de flux ou d'un test de libération radioactif (test de chrome par exemple). Bien que les tests de libération sont considérés comme un étalon-or, ils reposent sur l'utilisation d'isotopes radioactifs et du matériel connexe, qui sont extrêmement coûteux. En outre, les réglementations relatives à l'utilisation et l'élimination des matières radioactives ajoutent de la complexité à des expériences qui nécessitent du temps-efficacité et de précision. L'utilisation d'une cytométrie en flux approche est logique, mais les précautions typiques doit être suivi, y compris les paramètres du laser, et la compensation de fluorochrome et gating. Ceci est particulièrement vrai lorsque les 2 types de cellules différentes sont en sample, comme il est le cas pour les dosages cytotoxiques. Cependant, dans notre cas, l'utilisation d'un flux d'imagerie permet cytomètre une image à capturer pour chaque événement, et le paramètre de rapport de taille permet la séparation des doublets de cellules individuelles. Ceci est un point critique, étant donné que le dosage cytotoxique repose sur le contact physique entre l'effecteur et de la cible; très souvent, ces 2 types de cellules seront toujours ensemble pendant la mesure du débit, l'introduction de doubles faux positifs dans les résultats. Ce point très est illustré à la figure 1D, qui montre un doublet formé par un (mourant, positif PI) des cellules NK, et un (PI, négatif en direct, DiO positifs) des cellules K562. En cytométrie de flux traditionnel, cet événement sera ajouté au compte de la mort cellulaire K562 mais est en fait un faux positif. données Suppression peuvent en effet être problématique, mais il est pas, si elle est faite de manière cohérente et en utilisant des paramètres très stricts d'une expérience à (dans ce cas, le paramètre "aspect ratio"). En retour,les données obtenues seront beaucoup plus stable. De plus, la visualisation de tous les événements permet de déclenchement précis (et le nombre) de chaque événement en fonction des paramètres de couleur, sans compter sur les portes rigides qui sont traditionnellement établies en utilisant des commandes et qui ne prennent pas en compte la "dérive de données" naturel qui peut se produire dans cytométrie de flux. La capacité supplémentaire d'imager chaque événement unique cible pendant l'acquisition, permet une transmission sélective améliorée unique (DIO seulement, ce qui représente les cellules cibles vivantes) et de la population à double teinté (DIO + PI taché, ce qui représente les cellules cibles mortes).
En outre, le flux de travail présenté ici a été optimisé pour tenir compte de la rareté des cellules NK dans le sang total et la nécessité pour des résultats précis. Alors que NK tests traditionnels de cytotoxicité cellulaire explorent l'activité lytique à plusieurs T: ratios E, il est peu pratique pour un couple de raisons: 1) la quantité de cellules NK disponibles à partir du sang total est limité et extrêmement variable et 2) la quantité de cellules cibles nécessaires à l'analyse doit être suffisamment grand pour permettre l'acquisition assez rapide des données. Plusieurs tests à différents rapports (non représentés ici) ont montré que 1: 5 T: E ratio, ce qui se traduit en 4 x 10 4 T / 2 x 10 5 E donne un équilibre optimal et permet une grande reproductibilité. Sur la base des essais répétés avec des échantillons provenant de divers individus (non représentés ici), ce rapport fournit également une activité cytotoxique attendue de 50-70% dans les échantillons normaux, qui offre une importante sur et sous la fenêtre pour mesurer l'effet des interventions.
Le nombre de cellules NK était similaire à ce qui a été trouvé dans d' autres ouvrages 11, 12, 13, et en ligne avec la gamme acceptée de la fréquence des cellules NK du sang 14. Cependant, l'avantage de ce nouveau flux de travail est démontré dans la figure 3B, où nous détectonsed une augmentation significative de la cytotoxicité des cellules NK après 24 h par rapport aux niveaux pré-entraînement, en dépit d'un nombre de cellules NK qui était en moyenne (quoique non significative) inférieure à ce même point de temps. Ce résultat diffère des autres études publiées où les niveaux cytotoxiques étaient pour la plupart identiques (ou même plus bas) aux niveaux pré-entraînement. Il suggère qu'au lieu d'être déprimé pendant une longue période de temps après l'exercice, cytotoxicité des cellules NK pourrait être en mesure de «rebond» des niveaux encore plus élevés pour après aussi peu que 21 heures après l'exercice. Cette observation en utilisant une nouvelle méthodologie avec des cellules NK pures, en bonne santé, si elle est confirmée dans des études de suivi, a le potentiel de changer la perspective actuelle que l'effort lourd est immunosuppressive. Lorsque les cellules NK sont obtenues en utilisant des gradients de Ficoll ou de tri basé sur la cytométrie de flux, les populations qui en résulte est mélangé à d'autres types cellulaires, contiennent de multiples cellules endommagées NK et / ou de cellules NK présentant une réponse modifiée. Ces conséquences sont à prévoir consiDering la longueur, la dureté et / ou l'imprécision des méthodes mentionnées ci-dessus. La suppression de ces questions, et de rester proche des conditions physiologiques en tout temps, conduira à des résultats expérimentaux plus représentatifs des cellules NK dans le comportement in vivo.
Pour résumer, nous avons décrit un workflow intégré qui permet un isolement rapide précis et la détection de cytotoxicité des cellules NK à partir de petits échantillons de sang humain qui évite certaines des limitations associées à d'autres méthodes. Alors que le sang humain a été l'objet de ce travail, il convient de noter que cette méthode peut être appliquée à des échantillons de sang des animaux. Ce flux de travail est extrêmement reproductible et peut détecter de petites variations, ce qui est particulièrement utile pour les études d'exercice où le nombre de participants sont des mesures de sang limitées et de série sont acquises. Comme l'a souligné dans les résultats représentatifs, cette méthode améliorée a le potentiel de contester et d'améliorer les connaissances actuelles dans l'exercice de l'immunologie,et d'autres domaines liés à NK immuno-surveillance.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , Garland Science. (2001).
