Abstract
NK-celle cytotoksisitet er en mye brukt tiltak for å bestemme virkningen av utvendig intervensjon på NK-cellefunksjonen. Imidlertid kan den nøyaktighet og reproduserbarhet av denne analysen overveies ustabil, enten på grunn av bruksfeil eller på grunn av følsomheten av NK-celler til eksperimentell manipulasjon. For å eliminere disse problemene, ble en arbeidsflyt som reduserer dem til et minimum etablert og er presentert her. For å illustrere, fikk vi blodprøver, på ulike tidspunkter, fra løpere (n = 4) som ble sendt til en intens anfall av trening. Først blir NK-celler samtidig er identifisert og isolert gjennom CD56 merking og magnetbaserte sortering, direkte fra fullblod og fra så lite som en milliliter. De sorterte NK-celler blir fjernet fra eventuelle reagens eller lokking av antistoffer. De kan telles for å etablere en nøyaktig NK-celletall per milliliter blod. For det andre kan de sorterte NK-celler (Effektor-celler eller E) blandes med 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) merket K562 celler (målcellene eller T) i en analyse-optimal 1: 5 T: E ratio, og analysert ved hjelp av en bildestrøm-cytometer som gjør det mulig for visualisering av hver hendelse og eliminering av falske positive eller falske negativer (for eksempel dubletter eller effektorceller). Denne arbeidsflyten kan være ferdig i ca 4 timer, og gir svært stabile resultater selv når du arbeider med humane prøver. Når tilgjengelig, kan forskergrupper teste flere eksperimentelle inngrep i mennesker, og sammenligne målinger over flere tidspunkter uten å ødelegge data integritet.
Introduction
Natural killer celler er en vesentlig del av det medfødte immunsystemet. Selv om de er meget regulert, har de evnen til å gjenkjenne og eliminere unormale celler via celle-til-celle-kontakt og uten forutgående aktivering 1. Som sådan, de danner en rask linje i forsvaret mot infeksjoner. Mosjon, særlig intens, har vist seg å transient hemmer immunsystemet 2, 3, 4, 5. NK-celler er særlig utsatt for denne effekten 4, 6, 7, effektivt skaper et vindu med forbedret sensitivitet for sykdom. Derfor studiet av tiltak før, under eller etter intens trening med mål om å redusere sin innvirkning på NK cellefunksjonen er av spesiell interesse for velvære for idrettsutøvere post-konkurranser.
8, ved omtrent 1% av de hvite blodlegemer rommet; 2) NK-celler er svært følsomme for stress og stole på konstant utsettes for fysiologiske betingelser for å være levedyktig, stabil under eksperimentering; og 3) standard analyser for å fastslå NK celle cytotoksisitet, for eksempel Ficoll gradienter 9 og slipp analyser 10, er upålitelige og inkonsekvent. Den iboende variabilitet av humane prøver bare sammensatte disse problemene. Ferske humane prøver samlet inn i løpet av intervensjoner er ganske regulert og vanskelig å skaffe, i hvert fall i forhold til dyr prøver eller udødeliggjorte cellelinjer. Dette reduserer mulighetene til å gjenta eksperimenter eller legge til deltakere i studiekohorten å nå betydelige statistiske terskler. Sammen er disse problemene støtter behovet for en strømlinjeformet protokoll som tillater for både høy gjennomstrømming og høy pålitelighet analyse av NK celle lytisk aktivitet i humane prøver.
Vi etablerte en arbeidsflyt som forkorter tiden som er nødvendig for å identifisere, isolere og test NK-celler fra humant fullblod mens eksponering for utenforliggende faktorer minimeres. Fremgangsmåten optimaliserer bruken av to instrumenter, en magnetisk basert cellesorterer og en avbildnings strømningscytometer, og en analysespesifikk, optimalisert T: E ratio for å tillate påvisning av reduksjon eller økning av NK-celle cytotoksisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle blod samling prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fastsatt av Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).
1. Hele Blodprøvetaking
- Ha en sertifisert phlebotomist trekke blod i henhold til Verdens helseorganisasjons retningslinjer.
- Trekke blod inn i en 4 ml blod samling rør som inneholder Di-Kalium Ethylenediaminetetraacetic syre (K 2 EDTA). Vend blod samling rør i henhold til produsentens instruksjoner. Hold blodprøverøret ved romtemperatur på en benk-top rocker til separasjon.
2. Utarbeidelse av Dio-merkede målceller
- Grow K562-celler i Complete Iscoves modifiserte Dulbeccos Media (IMDM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin i flere uker før forsøket for å sikre helsen til cellene. Juster Konsentraterion av cellene til 3 x 10 5 celler / ml daglig gjennom ferdigstillelsen av en celletelling og påfølgende passasje av celler. Utfør en komplett medie endring hver 2 til 3 dager.
- På dagen for analysen, utføre en celletall ved hjelp av en 1: 1 hemocytometer.
- Fjern 10 ul fra K562 kolbe og fyll i 1,5 ml tube.
- Tilsett 10 mL av trypan blått fargestoff inn i den samme 1,5 ml rør for en fortynningsfaktor på 1: 1.
- Forsiktig flick rør for å blande K562 celler og trypan blått fargestoff.
- Tillat K562 celle-trypan blått fargestoff inkuberes i 1 min ved romtemperatur.
- Fjern 15 ul farget K562 celler fra tube.
- Pipette på hemocytometer for celletall.
- Tell cellene i de fire hjørne rutene samt på midten firkantet for totalt fem kvadrater.
- Beregn celletall ved hjelp av ligningen:
Totalt celler / ml = Totalt celler telles X (fortynningsfaktoren / antall plasser) X 10.000 / ml
- For ufargede K562 target-celler, tilsett 10 ml av K562 target-celler i en 15 ml rør ved en tetthet på 1 x 10 6 celler / ml for en total på 10 x 10 6 K562-celler. Sett inn en 37 ° C inkubator med 5% CO 2 til den er klar til bruk.
- For DIO farget K562 target-celler, tilsett 10 ml K562 målrettet mot celler til en 15 ml rør ved en tetthet på 1 x 10 6 celler / ml for en total på 10 x 10 6 K562-celler.
- Tilsett 1 mL av Dio celle-merking løsning per ml cellesuspensjon i 15 ml tube utpekt for Dio farging og forsiktig vortex. For eksempel legge til 10 mL av Dio celle-merking løsning på 10 x 10 6 K562 celler / ml ved et volum på 1 x 10 6 celler / ml.
- Inkuber K562-Dio-løsning i 20 minutter ved 37 ° C med 5% CO2 i et 15 ml rør.
- Følge ettering inkubering tilsett 3 ml romtemperatur fosfat-bufret saltvann (PBS) til K562-Dio-løsning inneholdende 15 ml tube.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 135 xg ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre cellepelleten med en 1000 mL volum justerbare pipette.
- Tilsett 10 ml av frisk IMDM til cellepelleten-inneholdende 15 ml tube.
- Forsiktig vortex-røret for å resuspendere cellene.
- Gjenta trinn 2.7 til 2.10 to ganger.
- Oppbevar celler i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2 til den er klar til bruk.
MERK: Celler kan lagres i inkubatoren i opp til 24 timer, men det er foretrukket å anvende dem på samme dag.
3. Utarbeidelse av kontroller
- Overfør følgende i separate og hensiktsmessig merket 1,5 ml rør:
- Legg 500 mL av fersk IMDM inneholder resuspendert DIO-merkede K562 celler inn i "Double Positive" merket 1,5 ml tube.
- Legg 500 mL av fersk IMDM inneholder resuspendert DIO-merkede K562 celler inn i "Dio bare" merket 1,5 ml tube.
- Tilsett 500 ul frisk IMDM inneholdende resuspenderte umerkede K562-celler i "propidium jodid (PI) only" merkede 1,5 ml rør.
- Plasser den doble positive og PI bare rørene i et 55 ° C vannbad i 5 min.
- Etter 5 min er gått, fjerne rør og tørk av med 70% etanol.
- Tilsett 10 L av PI til Double Positive og PI bare 1,5 ml rør.
- Legg alle tre K562 target cellekontrollene i inkubator ved 37 ° C i 30 minutter.
- Etter 30 minutters inkubering har forløpt, sentrifuger alle tre K562 target cellekontroller i 2 minutter ved 163 x g.
- Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre cellepelleten.
- Resuspender hver kontroll med 20 mL av fersk IMDM cellekultur media, og la i 37 ° C inkubator med 5% CO 2 i minst30 min for optimal Dio signal.
MERK: Kontrollene er nå klar til å kjøre gjennom bilde strømningscytometeret.
4. NK Cell Automatisert Separation
- Slå på celle separator og tillate oppstart syklus for å fullføre.
- Sørg for at alle væskeflasker Illuminations er grønne, og at avfallsflasken er tom.
- Skaff en romtemperatur 15 ml tube rack.
MERK: Valget er basert på prøvevolumer. For eksempel, for et volum mindre enn 3 ml bruke en 15 ml rørstativ og for et volum mer enn 3 ml bruke en 50 ml rørstativ. - Etikett prøverør tilsvarende (Gjenta per prøve / deltaker): Deltaker en hel blodprøve; Deltaker 1 Negativ fraksjon; Deltaker 1 Positiv brøkdel.
- Forsiktig pipette 1,5 ml fullblod fra trinn 1,2 til "Whole Blood Sample" 15 ml tube.
- Plasser riktig merket 15 ml "Whole Blood Sample" tube fra trinn 4,5 og merket 15 ml "Negative Brøk" og"Positiv Brøk" rør i trinn 4,4 i røret rack. Bruk thefollowing prøvestativ oppsett: Row (R1) A: Whole Blood Sample, Row (R2) B: Negativ, umerkede brøkdel, Row (R4) C: Positiv, magnetisk merket brøkdel.
- Sett separator stativet på MiniSampler for autolabeling.
- Velg "Reagens" på menyen og utheve posisjonen hvor flasken vil bli plassert i separatoren rack.
- Velg "Les Reagens" for å aktivere 2D strekkodeleser.
- Plassere den aktuelle reagensflasken foran 2D strekkodeleseren mellom 0,5-2,5 cm fra kodeleseren dekselet.
MERK: For eksempel den nødvendige reagenser for NK celle separasjon er CD56. - Hold reagens i en vinkel foran 2D kodeleser for optimal avlesning.
- Plasser reagensflasken i riktig separator stativposisjon.
- Marker de skal brukes under fanen Separasjon på skjermen.
- Fra Merking menyen, tildele en autolabeling program.
- Gi Celleseparasjonsanordningene Reagens CD56 mikroperler til rack posisjonene 1, 2, 3 og 4.
- Velg "posselwb" separasjon program.
- Velg "skylle" vaskeprogram.
- Sett inn et prøvevolum på 1500 mL i "Volume" undermenyen ved hjelp av talltastaturet.
- Velg "Enter" på tastaturet.
- Velg "Kjør" for å starte cellen separasjon.
- Velg "OK" for å bekrefte at nok buffer er tilgjengelig for å behandle alle prøvene.
5. NK celletall Etter celleseparasjon
- Umiddelbart etter celleseparasjon med diafragmaet, hente den positive fraksjon. Gitt ved romtemperatur. Denne fraksjonen inneholder den ønskede rene NK-cellepopulasjonen.
- For hver enkelt prøve, utføre en celletall ved hjelp av en hemocytometer som per trinn 2.2.
- Etter beregninger, registrere legemer.
6. Cvtotoksisitetsmålinq Prøvepreparering
- Forbered og merke 1,5 ml rør for hver prøve / deltaker tilsvarende.
- Pipetter ønskede forhold av NK-celler og DIO-stemplet K562-celler i hvert rør.
NB: For eksempel, er det ønskede forhold av K562 target-celler og NK-effektorceller 1: 5. - Sentrifuger i 5 min ved 135 x g.
- Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre cellepelleten.
- Resuspender NK-DIO merket K562 celleblanding i 500 mL av NK-celle media uten interleukin-2 (IL-2) og 2-merkaptoetanol (2-ME) (ufullstendig NK-cellekulturmedium).
MERK: ufullstendig NK cellekultur media er Minimum Essential Medium Eagle med natriumbikarbonat, uten L-glutamin, ribonukleosider og deoksyribonukleosider. - Tilsett 5 ul av PI til hvert rør.
- Sentrifuge i 2 minutter ved 163 x g.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i 2 timer.
- Etter to timers inkubasjon, centrifuge i 2 minutter ved 163 x g.
- Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre cellepelleten.
- Resuspender celler i 25 ul ufullstendig NK-cellekulturmedier.
7. Utarbeidelse av Spontan ( "S") Prøve
- Pipetter 500 mL av DIO-merket K562-celler (konsentrasjon av 1 x 10 6 celler / ml) i 1,5 ml rør.
- Tilsett 10 mL av PI til hvert rør.
- Sentrifugerør i 2 minutter ved 163 x g.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i 2 timer.
- Etter 2 timers inkubering, sentrifuge i 2 minutter ved 163 x g.
- Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre cellepelleten.
- Resuspender celler i 25 ul ufullstendig alfa-Minimum Essential Medium (α-MEM) cellekulturmedier.
8. Data Acquisition med Imaging Flowcytometer
- Trykk på den grønne knappen på innsiden av inngangsdøren på bilde flowcytometer å slå på instrumentet.
- Slå på all datamaskiner knyttet til bilde strømningscytometer.
- Start bilde strømningscytometeret programvare.
- Klikk på "Startup" -knappen for å skylle systemet og forberede prøvelinjen.
- Når "Startup" er fullført, lukker ut "Kalibrering" -vinduet.
- Tildele kanaler: på toppen venstre side, klikk på hver kanal for å tilordne dem.
- På høyre side, klikk på spredningsplott for å lage 4 scatterplots: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 og FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
- Begynn å analysere prøvene ved først å bruke "Double Positive" kontroll.
- Klikk på "Load".
- Plasser 1,5 ml tube med "Double Positive" sample fra trinn 3.4 til 3.9 i prøvelaster.
- Velg 40X objektiv under "Forstørrelse" -kategorien.
- Slå på 405 mW og642 mW lasere.
- Slå på "Lysfelt" kanal.
- Klikk på "Select Intensitet."
- Basert på "Double Positive" kontrollprøve, bestemme ønsket intensitet for 405 mW laser slik at detektoren ikke er overbelastet.
Merk: For eksempel ble den optimale intensiteten for dette eksperimentet satt til 11 mW.
- Etter at den ønskede oppsett er oppnådd, innhenting av data.
- Under fanen "File Acquisition", skriv inn et egendefinert filnavn tekst. Velg en mappe for lagring av data filen (e).
- Skriv inn antall celler til å tilegne seg ved siden av "Collect". Vanligvis dette tallet varierer mellom 1000 til 10.000.
- Klikk på "Acquire."
MERK: Når ønsket antall celler er ervervet, er datafilen lagres automatisk i den tidligere valgte mappen.
- Etter oppkjøpet er ferdig, legger du i neste kontrollutvalget - Dio bare kontroll.
- Klikk på "Load".
- Plasser 1,5 ml rør med "Dio eneste" prøve inn i prøvelasteren.
- La 40X objektiv under "Forstørrelse" -kategorien valgt.
- La 405 mW laser slått på.
- Slå AV 642 mW laser og "Lysfelt" kanal.
MERK: Nå som ønsket set-up er oppnådd, kan data bli kjøpt. - Under fanen "File Acquisition", skriv inn et egendefinert filnavn tekst og velg en mappe for lagring av data filen (e). Skriv inn antall celler til å tilegne seg ved siden av "Collect".. Vanligvis dette tallet er 1.000.
- Klikk på "Acquire."
MERK: Når ønsket antall celler er ervervet datafilen lagres automatisk i den tidligere valgte mappen.
- Gjenta trinn 8,10 for «PI-only" kontrollprøve. De eksperimentelle prøver er nå klar til å bli samlet.
- Håndter remaining eksperimentelle prøver, inkludert "Spontan" s "Samples" som følger:
- La 40X objektiv under "Forstørrelse" -kategorien valgt.
- Slå på 405 mW og 642 mW lasere.
- Slå på "Lysfelt" kanal.
- Klikk på "Set Intensitet."
- Under fanen "File Acquisition", skriv inn et egendefinert filnavn tekst og velg en mappe for lagring av data filen (e). Skriv inn et egendefinert filnavn tekst.
- Skriv inn antall celler til å tilegne seg ved siden av "Collect".
- Klikk på "Acquire" -knappen.
MERK: Når ønsket antall celler er ervervet datafilen lagres automatisk i den tidligere valgte mappen.
- Gjenta trinn 8,12 for alle eksperimentelle prøvene.
- Etter at alle eksperimentelle data og filer har blitt samlet inn, klikker du på "Shutdown" -knappen for å sterilisere systemet.
9. Imaging Flowcytometer Sample Analysis
- Åpne bilde flowcytometer analyse program.
- Under "File", åpne en eksperimentell .RIF fil.
- Bygg en ny matrise ved hjelp av én farge .RIF filer (DIO-bare kontrollere og PI-bare kontroll, opprettet under trinn 8.10 og 8.11) ved å velge "Opprett en ny Matrix" under fanen Kompensasjon i bilde strømningscytometeret programvare.
MERK: Programvaren vil be for valg av enkeltfargefiler og flette dem til å lage en matrise fil (.ctm filtypen), er at for å bli valgt til å gjelde kanal kompensasjon. - Lag prikkplotter ved å bruke "byggeklosser" funksjon av programvaren.
- Lag en prikk-plott (BrightFieldGradient_RMS vs frekvens) til gate fokuserte celler. Ring gate "Focus" (figur 1A).
- Bruke "Focus" gate, opprette et prikkplott av Bright Field-området vs Bright Feltet størrelsesforhold for å g spiste singlet cellene. Ring gate "Single" (figur 1B).
- Bruke "Single" gate, opprette et prikkplott av Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Bruk denne tomten til å identifisere og gate Dio-positive bare celler (mål, live) og PI-Dio dobbel positive celler (mål, døde) (figur 1C).
MERK: Alle tomter er beskrevet i trinn 9.4.1, 9.4.2 og 9.4.3 kan skapes ved hjelp av "byggeklosser" funksjon av programvaren.
- Klikk på statistikkfunksjon av dot komplott for å få tilgang til celle tall i hver gate.
- Beregn prosentandelen av døde mål i den spontane prøven og forsøksprøver ved bruk av følgende formel:
% døde mål i prøven = (#dead mål x 100) / (# leve retter seg mot + #dead mål) - Beregn cytotoksisitet ved hjelp av følgende formel:
% Cytotoksisitet = [(Eksperimentell dead-Spontan død) / (100-Spontan død)] x100
Figur 1: Representative histogrammer, punktdiagrammer og bilder for cytotoksisk aktivitet analyse. (A) fokus celle analyse. (B) enkelt celle analyse. (C) målcelle farging analyse. Alle bestemmelser er gjort ved hjelp av bilde som er knyttet til hvert arrangement. Dette kan nås innen analyse programvare ved å klikke på arrangementet på grafene. (D) representant bilde av en dublett hendelse, viser en apoptotisk NK celle og en live K562 mål. K01, Lysfelt. Ch02, Dio. Ch05, PI. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fastsettelse av NK-celletall
Effekten av tunge som kjører på NK-celletall i fullblod ble målt ved hjelp av utøvelse protokoll beskrevet i figur 2. Blodprøver ble tatt før trening, umiddelbart etter trening, 1,5 timer etter trening, og til slutt 24 og 48 timer etter den første blodprøvetaking. Konsentrasjonen av NK-celler per milliliter av fullblod ble målt for hver løper (figur 3A) og i snitt (figur 3B) for hvert tidspunkt.
Våre resultater (figur 3A) viser at løpere 1, 2 og 4 presentere et lignende mønster med en svak økning på NK celletall etter trening, umiddelbart etterfulgt av en kraftig nedgang, før sakte tilbake til normalt etter 24 og 48 timer. Denne trenden var spesielt synlig ved å plotte NK celle gjennomsnitt for gruppen av løpere, men ingen signifikant forskjell frapre-trening nivåer ble oppdaget. Runner 3 presentert en meget høy teller i utgangspunktet, som sterkt redusert etter trening, og 1,5 time etter trening, før sakte tilbake til normalt etter 24 og 48 timer. I gjennomsnitt NK legemer (figur 3B) falt 1,5 time etter trening (om enn ikke signifikant), men var tilbake til nær normale nivåer etter 24 timer.
Fastsettelse av NK-celle cytotoksisitet
Etter beregning av NK celletall, ble NK-celler umiddelbart satt opp for å bestemme deres cytotoksisk aktivitet som beskrevet i punkt 6 i protokollen. Resultatene er presentert i figur 4A for hver enkelt løper, med Figur 4B viser den gjennomsnittlige NK-cytotoksisitet. Våre resultater viser at gjennomsnittlig NK-cytotoksisitet gått noe etter trening og 1,5 timer etter trening (om enn ikke-signifikant), men signifikant økt etter 24 timer. NK cytotoksisitet holdt seg høy i forhold til pre-Hobby nivåer, om enn ikke-signifikant (delvis på grunn av det lave antallet deltakere i dette pilotprosjektet).
Figur 2: Øvelse protokollen. Blod trekker (røde piler) ble utført på n = 4 løpere.
Figur 3: NK-celler teller pre-workout, post-workout, 1,5 timer og 21 timer etter trening. (A) NK-celleantall per milliliter av helblod for hver enkelt løper. (B) gjennomsnittlig NK-celleantall per milliliter av helblod. N = 4; Skala barer = standard feil.
Figur 4:NK-celler cytotoksisitet pre-workout, post-workout, 1,5 timer og 21 timer etter trening. (A) NK-celle cytotoksisitet (uttrykt som en prosentandel av døde målceller) for hver enkelt løper. (B) gjennomsnittlig celle cytotoksisitet (uttrykt som en prosentandel av døde målceller) NK. N = 4; Skala barer = standard feil; *: P <0,05; **: P <0,005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrives i denne undersøkelsen måler direkte den spesifikke aktivitet av et individs NK-celler som respons på stimuli (i dette spesielle tilfellet, langvarig trening). Vanligvis er NK-celler isolert fra en blod ved hjelp av tetthetsgradienter eller cellesortering ved hjelp av en kombinasjon av markører. Selv om disse metodene er mye brukt, har de mange ulemper: de er tidkrevende, innebære flere manipuleringer, og er sterkt avhengig av brukeren. Som et resultat blir unødig stress plassert på de isolerte NK-celler, noe som kan resultere i økt variasjon fra eksperiment til eksperiment, eller til og med innenfor samme eksperiment. I denne artikkelen har vi beskrevet en protokoll som benytter magnetisk-basert isolasjon. Dette gjør det mulig for rask, pålitelig og sortering av et stort antall av NK-celler i et individs fullblod, mens blod eller NK-celle manipulasjon minimaliseres.
Denne fremgangsmåte er særlig egnet for studier på mennesker hvor prøvene er tynt, menpå flipside metoden blir ganske vanskelig når for mye prøver må behandles sammen. Faktisk må vinduet i anskaffelse for cytotoksisk analyse å være typisk innen 30 min etter slutten av inkubasjonen, som i vår erfaring føre til 5 prøver på en gang på det meste. Hvis mange prøvene skal behandles, er det avgjørende å etablere en svimlende tidsplan for å gi tilstrekkelig tid for flowcytometri oppkjøpet. En annen ulempe ved denne metoden kan være kostnaden av reagensene som er forholdsvis høy, og kan forbrukes raskt hvis mer mengde blod er behandlet for høyere NK utbytte. Vi mener imidlertid at disse kostnadene er balansert med mye tid spart.
De kritiske trinn i denne protokollen er de som er mest åpne for endringer. Det er kritisk for å opprettholde blod ved romtemperatur, og for å behandle innen en time for å trekke for å unngå NK-celle stress. Etter isolering, er svært kritisk for celletallResultatet nøyaktighet, slik at tellemåte bør være konstant, for eksempel for trypanblått-assay sørge for at flere kvadrater telles på hemocytometer, og at brukeren eller lab er anvendelse av de samme identifikasjonsparametrene. Protokollen som presenteres her benytter 1,5 ml av blodet og test NK-celle cytotoksisitet ved et T: E-forhold på 1: 5, men disse parameterne kan optimaliseres avhengig av den ønskede analysen og den tilgjengelige mengden av blod: hvis mindre blod er tilgjengelig da det er mulig å anvende lavere forhold så som 1: 4 eller til og med 1: 3 til fremdeles ha rimelig fangsten. Etter vår erfaring er lavere forhold kan være utilstrekkelig til å tillate en passende cytotoksisk aktivitet. Også på grunn av prøven variasjon, hender det at den NK-celletall er mye lavere enn forventet; i respons, er det nødvendig å redusere mengden av målceller i reaksjonsrørene for å opprettholde den samme T: E-forhold gjennom et eksperiment. Under resultatanalyse, er den mest kritiske trinnet til å tilbringe så mye tid som er nødvendig for åoppnå en god matrise. Dette kan bare oppnås dersom stor forsiktighet er tatt for å fremstille kontrollene som er beskrevet i trinn 3 i protokollen. Når portene er etablert som beskrevet i trinn 9, kan filer sats sammen og analysert i serie med svært liten variasjon. Er du i tvil, bør brukeren alltid forholde seg til bildegalleriet ved å klikke på enhver hendelse plottet på en graf (sett på figur 1C), for å kontrollere at alle relevante hendelser er inkludert i riktig gate.
De representative resultater i figur 2A viste at 3 løpere av 4 presentert et lignende mønster. Mønsteret av 4 th løperen var trolig spesifikke for den enkelte og representerer ikke en feilaktig mål. NK-celletallet for denne personen var ved den øvre ende av akseptabelt område i humant fullblod både før trening og 48 timer etter trening. Dette viser en av styrkene til den metoden som er beskrevet i denne artikkelen, hvor NK calen kan være nøyaktig oppnådd. I tillegg er evnen til å oppnå tilpassede celler gjennom en enkelt merking trinn, gjør det mulig for minst mulig stress og modifikasjoner til de NK-celler. Dette er spesielt kritisk når NK-celle-cytotoksisitet blir målt under fysiologiske stress forhold.
Etter isolasjon blir NK-celle cytotoksisitet typisk bestemt ved strømningscytometri, eller en radioaktiv frigjøringsanalyse (krom assay for eksempel). Mens utslipp analyser er regnet som en gullstandard, er de avhengige bruk av radioaktive isotoper og tilhørende utstyr, som er svært kostbart. I tillegg bestemmelser for bruk og deponering av radioaktivt materiale legge kompleksiteten til eksperimenter som krever tid-effektivitet og presisjon. Bruken av en flowcytometri tilnærming er fornuftig, men vanlige forholdsregler må følges inkludert laser innstillinger, og fluorokrom kompensasjon og gating. Dette gjelder særlig når 2 forskjellige typer celler er i sa-mple, som det er tilfellet for cytotoksiske analyser. Imidlertid, i vårt tilfelle ved bruk av et avbildningsstrømnings tillater cytometer et bilde som skal bli tatt for hver hendelse, og størrelsen forholdsparameter tillater separasjon av dubletter fra enkeltceller. Dette er et kritisk punkt, ettersom den cytotoksiske analysen er avhengig av den fysiske kontakt mellom effektor og mål; svært ofte disse 2 typer celler vil fortsatt være sammen under mengdemåling, innføre falske doble positive til resultatene. Denne meget punkt er vist i figur 1D, som viser en dublett dannet av en (døende, PI positiv) NK-celle, og en (levende, Dio positiv, negativ PI) K562-celler. I tradisjonell flowcytometri, vil dette arrangementet være tilsatt til K562 celledød tall, men faktisk er en falsk positiv. Fjerne data kan faktisk være problematisk, men det er ikke, hvis det gjøres konsekvent og bruker svært strenge parametere fra eksperiment til eksperiment (i dette tilfellet "aspect ratio" parameter). Tilbake,de data som oppnås vil være mye mer stabile. I tillegg visualisere alle hendelser tillater presis gating (og telle) av hver hendelse basert på fargeparametere, uten å stole på stive porter som tradisjonelt etablert ved hjelp av kontrollene og som ikke tar hensyn til den naturlige "data drift" som kan oppstå i flowcytometri. I tillegg kan den avbilde hver enkelt mål hendelse under oppkjøpet, muliggjør en bedre gating av single (bare Dio, som representerer de levende målceller) og dobbelt farget befolkning (DIO + PI flekker, som representerer de døde målcellene).
I tillegg ble arbeidsflyten presentert her optimaliseres for å ta hensyn til mangel på NK-celler i fullblod og behovet for nøyaktige resultater. Mens tradisjonelle NK celle cytotoksisitetsassayer utforske lytisk aktivitet på flere T: E forhold, er det upraktisk for et par grunner: 1) mengden av tilgjengelige NK-celler fra fullblod er begrenset og ekstremt variabel og 2) mengden av målceller som er nødvendig for analysen må være stor nok til å gi rom for ganske rask anskaffelse av data. Flere tester på forskjellige forhold (ikke vist her) viste at en 1: 5 T: E ratio, som oversetter i 4 x 10 4 T / 2 x 10 5 E gir en optimal balanse, og gir stor reproduserbarhet. På grunnlag av gjentatte forsøk med prøver fra forskjellige individer (ikke vist her), dette forhold gir også en forventet cytotoksisk aktivitet på 50-70% i normale prøver, noe som gir en betydelig over og under vinduet for å måle effekten av intervensjoner.
NK-celletall var lik det som ble funnet i andre verk 11, 12, 13, og i tråd med aksepterte spekter av hyppigheten av NK-celler på blod 14. Imidlertid er fordelen med denne nye arbeidsflyten vist i figur 3B, hvor vi påviseed en betydelig økning av NK-celle cytotoksisitet etter 24 timer i forhold til pre-workout nivåer, til tross for en NK celletall som var i gjennomsnitt (riktignok ikke signifikant) lavere på det samme tidspunkt. Dette resultatet skiller seg fra andre publiserte studier hvor cytotoksiske nivåer hovedsakelig var identisk (eller enda lavere) til pre-workout nivåer. Det tyder på at i stedet for å bli trykket ned i løpet av en lang tidsperiode etter trening, kan NK-celle cytotoksisitet være i stand til å "rebound" til enda høyere nivåer etter så lite som 21 timer etter trening. Denne observasjonen ved hjelp av en roman metodikk med rene, friske NK-celler, hvis bekreftet i oppfølgingsstudier, har potensial til å endre dagens perspektiv som tunge treningen er immunsuppressiv. Når NK-celler blir oppnådd ved anvendelse av Ficoll-gradienter eller flow-cytometri-baserte sortering, er enten blandet sammen med andre celletyper av den resulterende populasjonen, inneholde flere skadede NK-celler og / eller NK-celler med endret respons. Disse konsekvensene er å forvente consiDering lengde, hardhet og / eller unøyaktigheten av de tidligere nevnte fremgangsmåter. Fjerne disse problemene, og å holde seg nær fysiologiske forhold til enhver tid, vil føre til eksperimentelle resultatene mer representative for NK-celler in vivo oppførsel.
For å oppsummere, beskrev vi en integrert arbeidsflyt som muliggjør en rask, nøyaktig isolering og deteksjon av NK-celle cytotoksisitet fra små humane blodprøver som unngår noen av de begrensninger som er forbundet med andre metoder. Mens menneskeblod var fokus for dette arbeidet, er det verdt å merke seg at denne metoden kan brukes på dyr blodprøver. Denne arbeidsflyten er ekstremt reproduserbar og kan oppdage små variasjoner, noe som er spesielt verdifull for trening studier der antall deltakere er begrenset og serieblod tiltak er overtatt. Som understreket i de representative resultater, har denne forbedrede metoden potensial til å utfordre og forbedre dagens kunnskap i øvelsen immunologi,og andre felt knyttet til NK immuno-overvåking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , Garland Science. (2001).
