Abstract
NK-Zell-Cytotoxizität ist eine weit verbreitete Maßnahme, um die Wirkung der Intervention von außen auf NK-Zell-Funktion zu bestimmen. Jedoch kann die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays instabil betrachtet werden, entweder weil der Benutzer-Fehler oder wegen der Empfindlichkeit von NK-Zellen auf experimentelle Manipulation. Um diese Probleme zu beseitigen, wird ein Workflow, der sie auf ein Minimum reduziert wurde etabliert und wird hier vorgestellt. Zu veranschaulichen, erhalten wir Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten, von Läufern (n = 4), die zu einem intensiven Trainingseinheit vorgelegt wurden. Zunächst werden NK-Zellen gleichzeitig identifiziert und isoliert durch CD56-Tagging und magnetische-basierte Sortierung, direkt aus Vollblut und von so wenig wie ein Milliliter. Die sortierten NK-Zellen sind von irgendwelchen Reagenz oder Capping-Antikörper entfernt. Sie können, um gezählt werden, eine genaue NK-Zellzahl pro Milliliter Blut zu schaffen. Zweitens können die sortierten NK-Zellen (Effektoren Zellen oder E) mit 3,3'-Diotade gemischt werdencyloxacarbocyanine Perchlorat (DIO) markierte K562-Zellen (Zielzellen oder T) bei einem Test-optimal 1: 5 T: E-Verhältnis, und analysiert, um eine Bildgebungs Durchflusszytometer verwenden, die für die Visualisierung jedes Ereignisses und die Beseitigung aller falschen positiven erlaubt oder falsch-negative Ergebnisse (wie Dubletten oder Effektor-Zellen). Dieser Arbeitsablauf kann in etwa 4 h vollendet werden, und ermöglicht eine sehr stabile Ergebnisse, selbst wenn sie mit menschlichen Proben arbeiten. Wenn verfügbar, Forschungsteams können mehrere experimentelle Eingriffe am Menschen zu testen und zu vergleichen, Messungen über mehrere Zeitpunkte, ohne die Datenintegrität zu beeinträchtigen.
Introduction
Natürliche Killerzellen sind ein wesentlicher Bestandteil des angeborenen Immunsystems. Während sie sehr geregelt werden, haben sie die Fähigkeit , zu erkennen und abnormalen Zellen durch Zell-zu-Zell - Kontakt und ohne vorherige Aktivierung 1 beseitigen. Als solche bilden sie eine schnelle Verteidigungslinie gegen Infektionen. Exercise, besonders intensiv, wurde gezeigt , dass die transient das Immunsystem 2, 3, 4, 5 drücken. NK - Zellen sind besonders anfällig für diese Wirkung 4, 6, 7, effektiv ein Fenster mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber Krankheiten zu schaffen. Daher, bevor die Untersuchung von Interventionen, während oder nach intensivem Training mit dem Ziel, ihre Auswirkungen zu verringern auf NK-Zell-Funktion ist von besonderem Interesse für das Wohlbefinden der Athleten post-Wettbewerben.
8, bei etwa 1% der weißen Blutkörperchen Fach; 2) NK-Zellen sind sehr empfindlich gegenüber Stress und verlassen sich auf ständige Exposition gegenüber physiologischen Bedingungen während des Experimentierens lebensfähig und stabil zu bleiben; und 3) Standardassays NK - Zell - Cytotoxizität zu bestimmen, wie beispielsweise Ficoll - Gradienten 9 und Freisetzungsassays 10, sind unzuverlässig und inkonsistent. Die inhärente Variabilität der menschlichen Proben nur diese Fragen Verbindung. Frischen menschlichen Proben bei Eingriffen gesammelt sind ziemlich geregelten und schwer zu beschaffen, zumindest im Vergleich zu den Tierproben oder immortalisierten Zelllinien. Dies reduziert die Möglichkeiten Experimente zu wiederholen, oder fügen Sie die Teilnehmer der Studie Kohorte signifikanten statistischen Schwellenwerte zu erreichen. Zusammengefasst unterstützen diese Fragen die Notwendigkeit für eine optimierte Protokoll, das fo erlaubtr beide Hochdurchsatz und eine Hochzuverlässigkeitsanalyse von NK-Zell-lytische Aktivität in menschlichen Proben.
Wir haben ein Workflow, der die notwendige Zeit zu identifizieren, zu isolieren und zu testen NK-Zellen aus menschlichem Vollblut verkürzt, während der Exposition gegenüber äußeren Faktoren zu minimieren. Das Verfahren optimiert die Verwendung von zwei Instrumenten, eine Magnetbasis Zellsortierer und eine Abbildungs Durchflusszytometer und eine Assay-spezifische, optimierte T: E-Verhältnis die Detektion abnimmt oder zunimmt von NK-Zell-Cytotoxizität zu ermöglichen.
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Protocol
HINWEIS: Alle Blutsammelverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt von der Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) dargelegt.
1. Vollblut-Sammlung
- Haben Sie einen zertifizierten phlebotomist ziehen Blut nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation Richtlinien.
- Zeichnen Sie Blut in ein 4 ml Blutentnahmeröhrchen , das Di-Kalium Ethylendiamintetraessigsäure (K 2 EDTA). Invert-Blutsammelröhrchen nach den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Blutentnahmeröhrchen bei Raumtemperatur auf einem Benchtop-Rocker bis zur Trennung.
2. Vorbereitung der OVI-markierten Zielzellen
- Wachsen K562-Zellen in Komplett Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin mehrere Wochen lang vor dem Assay auf die Gesundheit der Zellen zu gewährleisten. Stellen Sie die KonzentratIonen der Zellen bis 3 x 10 5 Zellen / mL der Fertigstellung einer Zelle täglich durch Zählen und anschließende Passage von Zellen. Führen Sie eine vollständige Medienwechsel alle 2 bis 3 Tage.
- Am Tag des Tests, führen Sie eine 1 ein Zellenzahl: 1 - Hämozytometer.
- Entfernen 10 & mgr; l aus dem K562 Kolben aufnehmen und in 1,5 ml-Röhrchen.
- Zugabe von 10 ul Trypanblau-Farbstoff in der gleichen 1,5-ml-Röhrchen für einen Verdünnungsfaktor von 1: 1.
- Sanft flick Rohr K562-Zellen und Trypanblaufarbstoff zu mischen.
- Erlauben K562 Zellen Trypanblau für 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen 15 & mgr; l von gefärbten K562-Zellen aus dem Rohr.
- Pipette auf Hemocytometer für Zellzahl.
- Zählen von Zellen in den vier Eckquadrate sowie den mittleren Platz für insgesamt fünf Plätzen.
- Berechnen Zellzahl unter Verwendung der Gleichung:
Insgesamt Zellen / ml = Gesamt Zellen gezählt X (Verdünnungsfaktor / Anzahl der Quadrate) X 10000 / mL
- Für ungefärbte K562 - Zielzellen, 10 ml von K562 - Zielzellen zu einem 15 ml - Röhrchen in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml für insgesamt 10 x 10 6 K562 - Zellen. In eine 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 bis zur Verwendung.
- Dio gefärbten K562 - Zielzellen, mit 10 ml K562 - Zellen zu einem 15 ml - Röhrchen mit einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml für insgesamt 10 x 10 6 K562 - Zellen abzielt.
- 1 & mgr; l der OVI Zellmarkierungslösung pro ml Zellsuspension in 15-ml-Röhrchen Dio-Färbung bezeichnet und sanft Wirbel. Beispielsweise 10 & mgr; l Lösung DiO Zellmarkierungs bis 10 x 10 6 K562 Zellen / ml in einem Volumen von 1 x 10 6 Zellen / ml hinzu.
- Inkubieren K562-DIO - Lösung für 20 min bei 37 ° C mit 5% CO 2 in einem 15 ml Röhrchen.
- Folgening Inkubation 3 ml Raumtemperatur phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf K562-DIO-Lösung 15 ml Röhrchen mit.
- Zentrifuge für 10 min bei 135 xg bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie vorsichtig Überstand, ohne mit einem 1000 ul Volumen verstellbare Pipette das Zellpellet zu stören.
- In 10 ml frischem IMDM zu Zellpellet enthaltenden 15 ml-Röhrchen.
- Sanft Wirbelrohr um die Zellen zu resuspendieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,7-2,10 zwei weitere Male.
- Store - Zellen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 bis zur Verwendung.
HINWEIS: Die Zellen können bis zu 24 h im Brutschrank gelagert werden, aber es ist bevorzugt, sie am selben Tag zu verwenden.
3. Herstellung von Kontrollen
- Übertragen Sie die folgenden in getrennte und in geeigneter Weise 1,5 - ml - Röhrchen beschriftet:
- Add 500 ul frischem IMDM, enthaltend erneut suspendiert DiO-markierte K562-Zellen in den "Double Positive" bezeichnet 1,5 ml-Röhrchen.
- In 500 ml frisches IMDM, enthaltend erneut suspendiert DiO-markierte K562-Zellen in den "DiO nur" etikettiert 1,5 ml-Röhrchen.
- In 500 ul frischem IMDM enthält, erneut suspendiert unmarkierten K562-Zellen in den "Propidiumiodid (PI) nur" etikettiert 1,5 ml-Röhrchen.
- Der doppelte Positive und PI nur Röhrchen in einem 55 ° C Wasserbad für 5 min.
- Nach dem 5 Minuten verstrichen ist, entfernen Sie Rohre und wischen Sie mit 70% Ethanol nach unten.
- In 10 l PI an das Doppel Positive und PI nur 1,5 ml-Röhrchen.
- Platzieren alle drei K562 Zielzelle steuert in dem Inkubator bei 37 ° C für 30 min.
- Nach der 30 min Inkubation Ablauf Zentrifuge alle Steuerelemente Zielzelle K562 drei für 2 min bei 163 x g.
- Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören.
- Resuspendieren jede Steuerung mit 20 & mgr; l frischem IMDM Zellkulturmedien, und lassen Sie in der 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für mindestens30 min für eine optimale DiO Signal.
HINWEIS: Die Kontrollen sind nun bereit, cytometer durch die Abbildungsfluss ausgeführt werden.
4. NK-Zellen Automatisierte Trennung
- Schalten Sie Zellseparator und lassen Sie den Start-up-Zyklus zu beenden.
- Stellen Sie sicher, dass alle Flüssigkeit Flaschen Illuminationen sind grün und dass die Abfallflasche ist leer.
- Besorgen Sie sich eine Raumtemperatur 15 ml-Röhrchen-Rack.
HINWEIS: Die Auswahl basiert auf Probenvolumina. Zum Beispiel für ein Volumen von weniger als 3 ml verwenden, um ein 15 ml Röhrchen Zahnstangen- und für ein Volumen von mehr als 3 mL verwenden, um eine 50 ml-Röhrchen Rack. - Label-Probenröhrchen entsprechend (Wiederholung pro Probe / Teilnehmer): Teilnehmer 1 Vollblut-Probe; Teilnehmer 1 Negativ-Fraktion; Teilnehmer 1 Positive Fraktion.
- Pipette vorsichtig 1,5 ml Vollblut aus Schritt 1.2 in "Vollblut-Probe" 15 ml-Röhrchen.
- Legen Sie entsprechend markierten 15 ml "Vollblut-Probe" Röhrchen aus Schritt 4.5 und markierte 15 ml "Negative Fraktion" und"Positive Fraktion" Rohre aus Schritt 4.4 in der Rohrgestell. Verwenden Sie thefollowing Probenrack Set-up: Reihe (R1) A: Vollblut-Probe, Reihe (R2) B: Negativ, unmarkierten Fraktion, Reihe (R4) C: Positiv, magnetisch markierten Fraktion.
- Legen Sie die Separator-Rack auf den Minisampler für autolabeling.
- Wählen Sie "Reagenz" auf dem Menü und markieren Sie die Position, wo das Fläschchen wird in dem Separator Rack platziert werden.
- Wählen Sie "Read-Reagenz", um den 2D-Code-Leser zu aktivieren.
- Legen Sie das entsprechende Reagenzabfüllung vor dem 2D-Code-Leser zwischen 0,5-2,5 cm von dem Codeleser Abdeckung.
HINWEIS: Zum Beispiel ist die erforderliche Reagenz für NK Zelltrennung CD56. - Halten Reagenzabfüllung in einem Winkel vor 2D-Code-Leser für die optimale Lese.
- Legen Sie die Reagenzabfüllung in die richtige Trennzeichen Rackposition.
- Markieren Sie die gewünschten Positionen unter der Trennung Registerkarte auf dem Bildschirm.
- Aus dem Labeling Untermenü zuweisen ein Autolabeling Programm.
- die Zellseparation Reagenz CD56 MicroBeads Weisen Positionen Rack 1, 2, 3 und 4.
- Wählen Sie den "posselwb" Trennung Programm.
- Wählen Sie den "spülen" Waschprogramm.
- Legen Sie ein Probenvolumen von 1.500 & mgr; l in der "Lautstärke" Untermenü mit der Zifferntastatur.
- Wählen Sie die "Enter" auf der Tastatur.
- Wählen Sie "Ausführen", um die Zelltrennung starten.
- Wählen Sie "OK", um zu bestätigen, dass genügend Puffer für die Bearbeitung aller Proben zur Verfügung steht.
5. NK Cell Count Nach Zellseparation
- Unmittelbar im Anschluss an die Zelltrennung mit dem Zellseparator, rufen Sie die positive Fraktion. Lassen Sie bei Raumtemperatur. Diese Fraktion enthält die gewünschten reinen NK-Zell-Population.
- Für jede einzelne Probe, führen Sie eine Zellzahl einer Zählkammer gemäß Schritt 2.2 verwendet wird .
- Nach Berechnungen, die Zellenzahl aufzuzeichnen.
6. Zytotoxizitätstest Probenvorbereitung
- Bereiten Sie und beschriften entsprechend 1,5 ml Röhrchen für jede Probe / Teilnehmer.
- Pipette gewünschte Verhältnis von NK-Zellen und DiO-labled K562-Zellen in jedes Röhrchen.
HINWEIS: Zum Beispiel ist das gewünschte Verhältnis von K562-Zielzellen und Effektorzellen NK 1: 5. - Zentrifuge für 5 Minuten bei 135 x g.
- Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören.
- Resuspendieren NK-DiO markierten K562 Zellgemisch in 500 & mgr; l von NK-Zell-Medium ohne Interleukin-2 (IL-2) und 2-Mercaptoethanol (2-ME) (incomplete NK Zellkulturmedien).
HINWEIS: Die unvollständige NK Zellkulturmedien ist, Minimum Essential Medium Eagle mit Natriumbicarbonat, ohne L-Glutamin, Ribonukleosiden und Desoxyribonukleosiden. - Werden 5 ul PI zu jedem Röhrchen.
- Zentrifuge für 2 min bei 163 x g.
- Inkubiere Zellen bei 37 ° C für 2 h.
- Nach 2 h Inkubation centrifuge für 2 min bei 163 x g.
- Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören.
- Resuspendiere Zellen in 25 ul unvollständiges NK Zellkulturmedien.
7. Herstellung von Spontaneous ( "S") Probe
- Pipette 500 ul DiO-markierte K562 - Zellen (Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml) in 1,5 ml - Röhrchen.
- Zugabe von 10 & mgr; l von PI zu jedem Röhrchen.
- Zentrifugenröhrchen für 2 min bei 163 x g.
- Inkubiere Zellen bei 37 ° C für 2 h.
- Folgenden 2 h Inkubation Zentrifuge für 2 min bei 163 x g.
- Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören.
- Die Zellen in 25 ul unvollständig alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) Zellkulturmedien.
8. Datenerfassung mit Imaging Durchflusszytometer
- Drücken Sie die grüne Taste in der vorderen Tür des Abbildungs Durchflusszytometer auf das Gerät einzuschalten.
- Schalten Sie all Computer mit der Imaging-assoziierten Durchflusszytometer.
- Starten Sie die Imaging-Durchflusszytometer Software.
- Klicken Sie auf die "Inbetriebnahme", um das System zu spülen und die Probenleitung vorzubereiten.
- Sobald die "Inbetriebnahme" abgeschlossen ist, schließen Sie das "Calibra" Fenster.
- Weisen Sie Kanäle: auf der oberen linken Seite, klicken Sie auf jedem Kanal, um sie zu vergeben.
- Auf der rechten Seite klicken Sie auf den Streudiagramm-Taste 4 Scatterplots zu erstellen: Rohmaterial Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Rohmaterial Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Rohmaterial Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 und FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
- Beginnen Analyse von Proben , indem zuerst die "Double Positive" Steuerung.
- Klicken Sie auf "Laden".
- Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit dem "Double Positive" Probe aus den Schritten von 3,4 bis 3,9 in den Probenlader.
- Wählen Sie das 40X-Objektiv unter der "Vergrößerung" aus.
- Schalten Sie die 405 mW und642 mW Laser.
- Schalten Sie das "Hellfeld" Kanal.
- Klicken Sie auf "Wählen Sie Intensität."
- Basierend auf dem "Double Positive" Kontrollprobe, bestimmen die gewünschte Intensität für die 405 mW Laser so dass der Detektor nicht überlastet wird.
Hinweis: Zum Beispiel wurde bei 11 mW die optimale Intensität für dieses Experiment eingestellt.
- Nachdem die gewünschte Set-up erreicht, Daten erfassen.
- Im Rahmen der "Acquisition Datei", geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text. Wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Datendatei (en).
- Geben Sie die Anzahl der Zellen neben "Collect" zu erwerben. Typischerweise variiert diese Zahl zwischen 1.000 bis 10.000.
- Klicken Sie auf "Acquire".
HINWEIS: Wenn die gewünschte Anzahl von Zellen gewonnen wird, wird die Datendatei in dem zuvor ausgewählten Ordner automatisch gespeichert.
- Nach dem Erwerb abgeschlossen ist , legen Sie die nächste Kontrollprobe - DiO nur Kontrolle.
- Klicken Sie auf "Laden".
- Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit dem "DiO nur" Probe in die Probenzuführung.
- Lassen Sie das 40X-Objektiv unter der "Vergrößerung" Registerkarte ausgewählt.
- Lassen Sie das 405-mW-Laser eingeschaltet.
- Schalten Sie den 642-mW-Laser und das "Hellfeld" Kanal.
HINWEIS: Nun, da die gewünschte Set-up erreicht wurde, können die Daten erfasst werden. - Unter dem "File Acquisition", geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text und wählen Sie die Datendatei einen Ordner für das Speichern (s). Geben Sie die Anzahl der Zellen neben erwerben "sammeln.". Typischerweise ist diese Zahl 1000.
- Klicken Sie auf "Acquire".
HINWEIS: Wenn die gewünschte Anzahl von Zellen, die Datendatei automatisch in dem zuvor ausgewählten Ordner gespeichert wird, erfasst wird.
- Wiederholen Sie Schritt 8,10 für die "PI nur" Kontrollprobe. Die experimentellen Proben sind nun bereit, gesammelt werden.
- Behandeln Sie die remaining experimentellen Proben, einschließlich der "Spontane" S "Samples" wie folgt:
- Lassen Sie das 40X-Objektiv unter der "Vergrößerung" Registerkarte ausgewählt.
- Schalten Sie die 405 mW und 642 mW Laser.
- Schalten Sie die "Hellfeld" Kanal.
- Klicken Sie auf "Set Intensität."
- Unter dem "File Acquisition", geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text und wählen Sie die Datendatei einen Ordner für das Speichern (s). Geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text.
- Geben Sie die Anzahl der Zellen zu erwerben neben "sammeln."
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen".
HINWEIS: Wenn die gewünschte Anzahl von Zellen, die Datendatei automatisch in dem zuvor ausgewählten Ordner gespeichert wird, erfasst wird.
- Wiederholen Sie Schritt 8.12 für alle experimentellen Proben.
- Nachdem alle experimentellen Daten und Dateien gesammelt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche "Shutdown" um das System zu sterilisieren.
9. Imaging Durchflusszytometer Probenanalyse
- Öffnen Sie die Imaging-Durchflusszytometer-Analyse-Software-Anwendung.
- Unter "Datei", öffnen Sie eine experimentelle .RIF Datei.
- Erstellen Sie eine neue Matrix, die die einzelnen Farb .RIF Dateien mit (DIO-only steuern und PI-only-Steuerung, erstellt während der Schritte 8.10 und 8.11), indem Sie "Erstellen einer neuen Matrix" unter der Kompensation Registerkarte in der Abbildungs Durchflusszytometer Software.
HINWEIS: Die Software fordert für die Auswahl der einzelnen Farbdateien und kombiniere sie mit einer Matrix-Datei (.ctm Dateierweiterung) zu erstellen, dh ausgewählt werden Kanalkompensation anzuwenden. - Erstellen Sie Dot - Plots unter Verwendung der "Bausteine" Funktion der Software.
- Erstellen Sie ein Punkt-Plot (BrightFieldGradient_RMS vs Frequenz) die fokussierten Zellen Tor. Rufen Sie das Tor "Focus" (Abbildung 1A).
- den "Focus" Tor benutzen, ein Punkt-Diagramm von Bright Field Bereich vs Hell Feld Seitenverhältnis g schaffen aßen die Singulett-Zellen. Rufen Sie das Tor "Single" (1B).
- Mit dem "Single" Tor, erstellen Sie ein Punktdiagramm von Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Verwenden Sie diese Handlung zu identifizieren und Gate DiO-positive Zellen nur (Ziele, lebendig) und PI-DIO doppelt positiven Zellen (Targets, tot) (1C).
HINWEIS: Alle Grundstücke in den Schritten 9.4.1, 9.4.2 und 9.4.3 kann unter Verwendung der "Bausteine" Funktion der Software erstellt werden.
- Klicken Sie auf die Statistik-Funktion des Dot-Plot zu Zellzahlen von jedem Gate zugreifen.
- Berechnen Sie den Prozentsatz der toten Ziele in der spontanen Probe und experimentellen Proben unter Verwendung folgender Formel:
% Tote Ziele in Probe = (#dead Ziele x 100) / (# leben Ziele + #dead Ziele) - Berechnen Zytotoxizität unter Verwendung der folgenden Formel:
% Zytotoxizität = [(Experimental dead-Spontane tot) / (100-Spontane tot)] x100
Abbildung 1: Repräsentative Histogramme, Streudiagramme und Bilder für zytotoxische Aktivität Analyse. (A) Fokus Zellanalyse. (B) Einzelzellanalyse. (C) Zielzellfärbung Analyse. Alle Bestimmungen werden unter Verwendung des Bildes zu jedem Ereignis angebracht gemacht. Dies kann durch einfaches Klicken auf die Veranstaltung in den Diagrammen in der Analyse-Software zugegriffen werden. (D) repräsentatives Bild eines Dubletts Ereignis, eine apoptotische NK - Zellen und eine Live - K562 Ziel zeigt. Ch01, Hellfeld. Ch02, OVI. CH05, PI. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Representative Results
Bestimmung der NK-Zellzahl
Die Wirkung von schweren Lauf auf NK - Zellzahl im Vollblut wurde gemessen, die Übung Protokoll in Abbildung 2 beschrieben ist . Blutproben wurden vor dem Training gezogen, unmittelbar nach dem Training, 1,5 Stunden nach dem Training, und schließlich 24 und 48 Stunden nach der ersten Blutentnahme. Die Konzentration von NK - Zellen pro Milliliter Vollblut wurde für jede Kufe (3A) gemessen und im Schnitt (Figur 3B) für jeden Zeitpunkt.
Unsere Ergebnisse (3A) zeigen , dass 1, 2 Läufer und 4 zeigen ein ähnliches Muster mit einem leichten Anstieg der NK - Zellzahl nach dem Training, unmittelbar gefolgt von einem starken Rückgang gefolgt, bevor sie langsam wieder normal nach 24 und 48 h. Dieser Trend zeigte sich insbesondere durch Auftragen NK-Zell-Mittelwerte für die Gruppe von Läufern, aber keinen signifikanten Unterschied ausVorübung Ebenen nachgewiesen. Runner 3 präsentiert eine sehr hohe Anzahl zunächst, die scharf nach dem Training verringert und 1,5 Stunden nach dem Training, bevor sie langsam wieder normal nach 24 und 48 h. Im Durchschnitt nahm die NK - Zellzahl (3B) 1,5 h nach dem Training (wenn auch nicht wesentlich) , aber war wieder auf nahezu normale Werte nach 24 h.
Bestimmung der NK-Zell-Cytotoxizität
Nach der Berechnung wurden die NK-Zellzahl, NK-Zellen sofort eingerichtet ihre zytotoxische Aktivität zu bestimmen, wie in Abschnitt 6 des Protokolls beschrieben. Die Ergebnisse sind in 4A für jeden einzelnen runner dargestellt, wobei Figur 4B die mittlere NK - Zytotoxizität zeigt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die durchschnittliche NK-Zytotoxizität leicht nach dem Training und 1,5 h nach dem Training verringert (wenn auch nicht wesentlich), aber nach 24 h deutlich erhöht. Die NK-Zytotoxizität blieb hoch im Vergleich zu dem vor-Übung Ebenen, wenn auch nicht signifikant (teilweise aufgrund der geringen Anzahl der Teilnehmer an diesem Pilotprojekt).
Abbildung 2: Übung Protokoll. Blutentnahmen (rote Pfeile) wurden auf n = 4 Läufer durchgeführt.
Abbildung 3: NK - Zellen zählt , vor dem Training, nach dem Training, 1,5 h und 21 h nach dem Training. (A) NK - Zellen für jeden einzelnen Läufer pro Milliliter Vollblut zählen. (B) durchschnittlich NK - Zellen pro Milliliter Vollblut zählen. N = 4; Maßstabsbalken = Standardfehler.
Abbildung 4:NK - Zellen Zytotoxizität Pre-Workout, nach dem Training, 1,5 h und 21 h nach dem Training. (A) NK - Zell - Cytotoxizität (als Prozentsatz der toten Zielzellen exprimiert) für jeden einzelnen Läufer. (B) Durchschnitts NK - Zell - Cytotoxizität (als Prozentsatz der toten Zielzellen exprimiert wird ). N = 4; Maßstabsbalken = Standardfehler; *: P <0,05; **: P <0,005.
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Discussion
Das Verfahren in dieser Studie beschriebenen Maßnahmen direkt auf die spezifische Aktivität eines NK-Zellen des Individuums als Reaktion auf Reize (in diesem speziellen Fall längerer Übung). Typischerweise werden NK-Zellen aus einem das Blut unter Verwendung von Dichtegradienten oder eine Zelle durch die Verwendung einer Kombination von Markern Sortierung isoliert. Obwohl diese Verfahren weit verbreitet sind, haben sie viele Nachteile: sie zeitraubend sind, beinhalten mehrere Manipulationen und sind stark Benutzer abhängig. Als Ergebnis wird eine übermäßige Belastung auf den isolierten NK-Zellen gegeben, die zu einer erhöhten Variabilität von Experiment führen zu experimentieren, oder sogar in dem gleichen Experiment. In diesem Papier haben wir beschrieben, ein Protokoll, das magnetisch-basierte Isolierung verwendet. Dies ermöglicht eine schnelle und zuverlässige Sortierung von einer hohen Anzahl von NK-Zellen in einer Vollblut des Individuums, während Blut oder NK Zellmanipulation minimieren.
Dieses Verfahren ist besonders geeignet für den menschlichen Studien, in denen Proben spärlich sind, aberwobei das Verfahren auf der B-Seite wird ziemlich schwierig, wenn zu viel Proben zusammen verarbeitet werden müssen. Tatsächlich muss das Fenster des Erwerbs für zytotoxische Assays typischerweise nach dem Ende der Inkubation innerhalb von 30 min, die in unserer Erfahrung am meisten in 5 Proben zu einem Zeitpunkt, zu übersetzen. Wenn viele Proben zu verarbeiten sind, ist es entscheidend, eine Staffelung Zeitplan zu schaffen ausreichend Zeit für die Durchflusszytometrie Nahme zu ermöglichen. Ein weiterer Nachteil dieser Verfahren könnten die Kosten der Reagenzien, die ziemlich hoch sind, und kann schnell verbraucht werden, wenn mehr Blutmenge ist für höhere NK Ausbeute verarbeitet. Wir glauben jedoch, dass diese Kosten durch die erhebliche Menge an Zeit gespeichert ausgeglichen sind.
Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind diejenigen, die die meisten offen für Modifikationen sind. Es ist wichtig, das Blut bei Raumtemperatur zu halten und innerhalb einer Stunde des Zeichnens auf NK Zellstress zu verarbeiten vermeiden. Nach der Isolierung ist Zellzahl äußerst kritisch fürErgebnisgenauigkeit sollte so die Methode der Zählung konstant sein: zum Beispiel für Trypanblau Test sicherstellen, dass mehrere Quadrate auf dem Hämocytometer gezählt werden, und dass der Benutzer oder Labor ist die gleiche Identifikationsparameter verwenden. Das Protokoll vorgestellt hier verwendet 1,5 ml Blut und Test NK-Zell-Cytotoxizität zu einem T: E-Verhältnis von 1: 5, aber diese Parameter optimiert werden können, der gewünschten Assay und die verfügbare Blutmenge abhängig: wenn weniger Blut ist es verfügbar, dann ist möglich, niedrigere Verhältnisse verwendet werden, wie 1: 4 oder sogar 1: 3 haben noch vernünftig Akquisitionszeit. Nach unserer Erfahrung können niedrigere Verhältnisse unzureichend eine geeignete zytotoxische Aktivität zu ermöglichen. Auch wegen der Probe Variation kommt es vor, dass die NK-Zellzahl ist viel niedriger als erwartet; in Reaktion ist es notwendig, die Menge an Zielzellen in Reaktionsrohre zu senken gleich T zu halten: E-Verhältnis im gesamten Experiment. Während der Ergebnisanalyse, der kritischste Schritt so viel Zeit wie nötig zu verbringeneine gute Matrix erhalten. Dies kann nur erreicht werden, wenn große Sorgfalt darauf verwendet wird, um die Kontrollen in Schritt 3 des Protokolls beschrieben vorzubereiten. Sobald Gattern in Schritt 9 beschrieben festgelegt wurden, können Dateien zusammen und mit sehr wenig Variation in Serie analysiert batched werden. Im Zweifelsfall sollte der Benutzer immer auf die Fotogalerie zu beziehen , indem Sie auf jeden Fall zu klicken , aufgetragen auf einem Diagramm (gesehen auf 1C), um zu prüfen, ob alle entsprechenden Ereignisse in der richtigen Gate enthalten sind.
Die repräsentativen Ergebnisse in 2A gezeigt , dass drei Läufer aus 4 ein ähnliches Muster dargestellt. Das Muster der 4 th runner war wahrscheinlich spezifisch für diese Person und keine fehlerhaften Maßnahme darstellen. Die NK-Zellzahl für dieses Individuum war am oberen Ende des zulässigen Bereichs in menschlichem Vollblut sowohl vor dem Training und 48 Stunden nach der Übung. Dies zeigt eine der Stärken des Verfahrens in diesem Papier beschrieben, wobei c NKells kann genau erhalten werden. Zusätzlich ermöglicht die Fähigkeit zu erhalten nativen Zellen durch eine einzige Markierungsschritt, für eine minimale Belastung und Modifikationen an den NK-Zellen. Dies ist besonders kritisch, wenn der NK-Zellen-Zytotoxizität wird unter physiologischen Stress-Bedingungen gemessen werden.
Nach der Isolierung wird der NK-Zellen-Zytotoxizität typischerweise mittels Durchflusszytometrie oder einem radioaktiven Freisetzungstest (Chrom-Assay zum Beispiel) bestimmt. Während Release-Assays ein Goldstandard betrachtet werden, verlassen sie sich auf die Verwendung von radioaktiven Isotopen und zugehörige Ausrüstung, die extrem teuer sind. Darüber hinaus Vorschriften für die Verwendung und Entsorgung von radioaktiven Materialien erhöhen die Komplexität zu Experimenten, die Zeit-Effizienz und Präzision erfordern. Die Verwendung eines Durchflusszytometrie Ansatz ist sinnvoll, aber typische Vorsichtsmaßnahmen müssen einschließlich der Lasereinstellungen folgen, und Fluorochrom Kompensation und Gating. Dies gilt insbesondere, wenn zwei verschiedene Arten von Zellen in der SAmple, wie es der Fall für zytotoxische Assays. in unserem Fall ermöglicht jedoch die Verwendung eines Abbildungs Durchflusszytometer ein Bild für jedes Ereignis erfasst werden, und das Größenverhältnis Parameter ermöglicht die Trennung von Dubletts von einzelnen Zellen. Dies ist ein kritischer Punkt, da der zytotoxischen Assays auf dem physischen Kontakt zwischen dem Effektor und dem Ziel setzt; sehr oft sind diese zwei Arten von Zellen werden noch zusammen bei Durchflussmessung sein, falsche Doppel Positive in die Ergebnisse der Einführung. Diese sehr Punkt ist in 1D dargestellt, die eine Dublette von einem ( im Sterben, PI positiv) NK - Zellen und ein (live dio positiv, PI negativ) K562 - Zellen gebildet zeigt. In der traditionellen Durchflusszytometrie, würde dieses Ereignis an die K562 Zelltod Zählung hinzugefügt werden, ist aber in der Tat um einen Fehlalarm. Entfernen von Daten kann in der Tat problematisch sein, jedoch ist es nicht, wenn es konsequent durchgeführt wird, und unter Verwendung von sehr strenge Parameter von Versuch zu Versuch (in diesem Fall ist der "aspect ratio" Parameter). Im Gegenzug,die erhaltenen Daten werden viel stabiler. Darüber hinaus ermöglicht die präzise Gating alle Ereignisse zu visualisieren (und zählen) jedes Ereignis anhand von Farbparameter, ohne auf starren Gates angewiesen, die traditionell eingerichtet sind mit Kontrollen und das nicht in Betracht nehmen die natürliche "Daten Drift", die in auftreten können Durchflusszytometrie. Die zusätzliche Fähigkeit zur Abbildung jedes einzelne Zielereignis während der Erfassung, ermöglicht eine verbesserte Verknüpfung von einzelnen (DIO nur, was die Live-Zielzellen) und doppelgefärbt Bevölkerung (DIO + PI gefärbt, um die toten Zielzellen darstellt).
Zusätzlich wurde der Arbeitsablauf hier präsentierten optimiert, um die Knappheit von NK-Zellen in Vollblut zu berücksichtigen, und die Notwendigkeit für genaue Ergebnisse. Während traditionelle NK-Zell-Zytotoxizitätstests die lytische Aktivität bei verschiedenen T erforschen: E-Verhältnisse ist es für eine Reihe von Gründen unpraktisch: 1) die Menge der verfügbaren NK-Zellen aus Vollblut ist begrenzt und extrem variable und 2) die Menge an Ziel für die Analyse benötigten Zellen müssen groß genug sein, um ziemlich schnell Erfassung der Daten zu ermöglichen. Mehrere Tests in verschiedenen Verhältnissen (hier nicht gezeigt) zeigten , dass eine 1: 5 T: E - Verhältnis, das in 4 x 10 & sup4 ; T / 2 x 10 5 E gibt eine optimale Balance zu übersetzen, und ermöglicht eine gute Reproduzierbarkeit. Basierend auf wiederholten Tests mit Proben aus verschiedenen Individuen (hier nicht gezeigt), dieses Verhältnis stellt auch eine erwartete zytotoxische Aktivität von 50-70% in normalen Proben, die eine signifikante über und unter Fenster bietet den Effekt der Interventionen zu messen.
Die NK - Zellzahl war ähnlich dem , was in anderen Werken 11, 12, 13, und in-line mit dem akzeptierten Bereich der Frequenz von NK - Zellen auf Blut 14 gefunden wurde. Allerdings ist der Vorteil dieser neuen Workflow in 3B gezeigt, wo wir feststellen ,ed eine deutliche Erhöhung der NK-Zell-Zytotoxizität nach 24 h im Vergleich zu Pre-Workout Ebenen trotz einer NK-Zellzahl, die (wenn auch nicht signifikant) niedriger bei gleichen Zeitpunkt im Durchschnitt. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von anderen veröffentlichten Studien, in denen zytotoxische Ebenen weitgehend identisch waren (oder sogar weniger) auf die Pre-Workout Ebenen. Sie schlägt vor, dass anstelle der über einen langen Zeitraum nach dem Training gedrückt wird, NK-Zell-Cytotoxizität kann nach so wenig wie 21 h nach dem Training auf "Rebound", um noch höhere Niveaus der Lage sein. Diese Beobachtung ein neues Verfahren mit reinen, gesunden NK-Zellen verwenden, wenn in der Follow-up-Studien bestätigt, hat das Potenzial, die aktuelle Perspektive zu ändern, dass schwere Anstrengung immunsuppressive ist. Bei NK-Zellen erhalten werden unter Verwendung von Ficoll-Gradienten oder Durchflusszytometrie-basierte Sortierung, die sich ergebende Bevölkerung entweder gemischt mit anderen Zelltypen ist, enthalten mehrere beschädigte NK-Zellen und / oder NK-Zellen mit modifizierten Reaktion. Diese Folgen sind zu erwarten considering die Länge, Härte und / oder Unschärfen der vorgenannten Verfahren. Das Entfernen dieser Probleme und zu jeder Zeit in der Nähe physiologischen Bedingungen zu bleiben, führt zu experimentellen Ergebnisse repräsentativer für die NK - Zellen in vivo Verhalten.
Zusammenfassend haben wir beschrieben, einen integrierten Arbeitsablauf, der für eine schnelle, genaue Trennung und den Nachweis von NK-Zell-Cytotoxizität von kleinen menschlichen Blutproben ermöglicht, die einige der Einschränkungen, die mit anderen Verfahren vermeidet. Während menschliche Blut im Mittelpunkt dieser Arbeit war, ist es bemerkenswert, dass diese Methode zu Tier Blutproben angewendet werden kann. Dieser Workflow ist extrem reproduzierbar und können kleine Veränderungen erkennen, die für die Ausübung Studien besonders wertvoll ist, wo die Teilnehmerzahl begrenzt ist und serielle Blut Maßnahmen erworben werden. Wie in den repräsentativen Ergebnissen unterstrichen, hat diese verbesserte Methode das Potenzial, herauszufordern und das aktuelle Wissen in Bewegung Immunologie zu verbessern,und anderen Bereichen zu NK Immunüberwachung im Zusammenhang.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
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