Abstract
клеточная цитотоксичность NK является широко используемым показателем для определения влияния внешнего вмешательства на функцию NK-клеток. Тем не менее, точность и воспроизводимость результатов этого анализа можно считать нестабильным, либо из-за ошибок пользователя или из-за чувствительности клеток NK к экспериментальному манипулированию. Для устранения этих проблем был создан рабочий процесс, который сводит их к минимуму и представлена здесь. Чтобы проиллюстрировать это, мы получили образцы крови, в различные моменты времени, из бегунов (n = 4), которые были представлены в интенсивный бой упражнений. Во-первых, NK-клетки одновременно идентифицируют и выделяют через CD56 мечения и магнитной сортировки на основе, непосредственно из цельной крови и от всего лишь один миллилитр. Отсортированные клетки NK удалены из любых реагентов или укупорки антител. Они могут быть подсчитаны с целью установления точного подсчета клеток NK на миллилитр крови. Во-вторых, отсортированной клетки NK (эффекторы клетки или E) могут быть смешаны с 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine Хлорнокислый (DIO) помечено клетки К562 (клетки-мишени или Т) на тест-оптимальным 1: 5 T: отношение E, и анализировали с использованием изображений проточные цитометр, который позволяет для визуализации каждого события и устранение любых ложных срабатываний или ложных негативов (такие как дублеты или эффекторных клеток). Этот рабочий процесс может быть завершен в течение примерно 4 ч, и позволяет очень стабильные результаты даже при работе с человеческими образцами. При наличии, исследовательские группы могут испытать несколько экспериментальных вмешательств у больных людей, и сравнить измерения в нескольких точках времени без ущерба для целостности данных.
Introduction
Естественные клетки-киллеры являются существенным элементом врожденной иммунной системы. В то время как они очень регулируются, они обладают способностью распознавать и элиминировать аномальных клеток через клетки к клетке контакта и без предварительной активации 1. Таким образом, они образуют быструю линию защиты против инфекций. Физические упражнения, особенно интенсивно, как было показано, скоротечно угнетают иммунную систему 2, 3, 4, 5. NK - клетки, особенно подвержены этому эффекту 4, 6, 7, эффективно создание окна повышенной чувствительности к болезни. Таким образом, изучение мер до, во время или после интенсивной физической нагрузки с целью снижения его влияния на функцию NK-клеток представляет особый интерес для благосостояния спортсменов пост-соревнований.
8, при температуре около 1% числа белых клеток крови отсека; 2) NK-клетки очень чувствительны к стрессу и полагаться на постоянного воздействия на физиологические условия, чтобы оставаться жизнеспособными и стабильными во время экспериментов; и 3) стандартные анализы для определения цитотоксичности клеток NK, такие как Ficoll градиенты 9 и выпуск 10 анализов, являются ненадежными и непоследовательными. Присущая изменчивость человеческих образцов только усугубляют эти проблемы. Свежие образцы человека, собранные в ходе вмешательств достаточно регламентирована и сложно получить, по крайней мере, по сравнению с образцами, животных или иммортализованные клеточные линии. Это уменьшает возможность повторить эксперименты или добавить участников исследования когорты достичь значительных статистических пороговых значений. В совокупности эти вопросы подтверждают необходимость обтекаемый протокол, позволяющий FOг и с высокой пропускной способностью и анализ высоконадежный НК клеток литической активности в человеческих образцах.
Мы создали рабочий процесс, который сокращает время, необходимое для идентификации, выделения и испытания NK-клетки из цельной крови человека при сведении к минимуму воздействия внешних факторов. Метод оптимизирует использование двух инструментов, магнитной основе сортировщика клеток и потока изображений цитометр, и анализ конкретных, оптимизированные T: отношение E, чтобы позволить обнаружение уменьшается или увеличивается клеточной цитотоксичности NK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все процедуры сбора крови были проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Аппалачи государственного университета совет Review (ASU) Институциональная (IRB).
1. Весь забор крови
- Есть сертифицированный Phlebotomist забор крови в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения.
- Нарисуйте кровь в один 4 мл пробирку для сбора крови , содержащей ди-Калий этилендиаминтетрауксусной кислоты (K 2 ЭДТА). Переверните пробирку для сбора крови в соответствии с инструкциями изготовителя. Держите пробирку для сбора крови при комнатной температуре на настольном коромысла до разделения.
2. Получение DIO-меченых клеток-мишеней
- Grow К562 в комплекте Исков Модифицированная Дульбекко Медиа (IMDM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина стрептомицин в течение нескольких недель до анализа, чтобы обеспечить здоровье клеток. Отрегулируйте Концентратиона клеток до 3 х 10 5 клеток / мл в день путем заполнения ячейки подсчета и последующее прохождение клеток. Выполните полное изменение среды каждые 2 до 3 дней.
- В день анализа, выполнять подсчет клеток с использованием 1: 1 гемоцитометра.
- Удалить 10 мкл из К562 колбу и помещают в 1,5 мл трубки.
- Добавьте 10 мкл трипанового синего красителя в той же 1,5 мл трубки для коэффициент разбавления 1: 1.
- Осторожно Флик трубки перемешать К562 и трипанового синего красителя.
- Разрешить К562 клеток-трипанового синего красителя для инкубирования в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Удалить 15 мкл окрашенных клеток К562 из трубки.
- Пипетка на гемоцитометра для подсчета клеток.
- Количество клеток в четырех угловых квадратов, а также средний квадрат в общей сложности пяти квадратов.
- Подсчитайте число клеток с помощью уравнения:
Всего клеток / мл = Общее количество подсчитанных клеток X (коэффициент разбавления / кол-во квадратов) X 10000 / мл
- Для неокрашенных - мишеней К562, добавляют 10 мл клеток - мишеней K562 в один 15 мл трубки при плотности 1 х 10 6 клеток / мл в течение в общей сложности 10 х 10 6 клеток К562. Поместите в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 до готовности к использованию.
- Для клеток - мишеней DiO витражное К562, добавьте 10 мл K562 цели клеток к одному 15 мл трубки при плотности 1 × 10 6 клеток / мл в общей сложности 10 × 10 6 клеток К562.
- Добавить 1 мкл Диу клеток мечения раствора на мл клеточной суспензии в 15 мл пробирку, предназначенную для окрашивания DiO и мягко вихрем. Например, добавить 10 мкл раствора DiO клеток , меченных до 10 х 10 6 клеток К562 / мл при объеме 1 х 10 6 клеток / мл.
- Решение Инкубировать К562-DiO в течение 20 мин при температуре 37 ° С с 5% CO 2 в 15 мл пробирку.
- следитьИнг инкубации, добавляют 3 мл воды комнатной температуры фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в растворе К562-DiO, содержащей 15 мл пробирку.
- Центрифуга в течение 10 мин при 135 х г при комнатной температуре.
- Осторожно удалите супернатант, не нарушая осадок клеток с 1000 мкл объема регулируемой пипетки.
- Добавляют 10 мл свежей IMDM к осадку клеток, содержащих 15 мл пробирку.
- Аккуратно вихревой трубки для ресуспендирования клеток.
- Повторите шаги 2.7 до 2.10 еще два раза.
- Хранить клетки в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 до готовности к использованию.
Примечание: Ячейки могут быть сохранены в инкубаторе в течение до 24 ч, но предпочтительно использовать их в тот же день.
3. Получение контроля
- Передача следующих на отдельные и надлежащим образом маркированных 1,5 мл пробирки:
- Добавить 500 мкл свежей IMDM, содержащей ресуспендировали DIO-меченый К562 в "Двойной" Позитивный меченым 1,5 мл трубки,
- Добавить 500 мкл свежей IMDM, содержащей ресуспендировали DIO-меченых клеток К562 в "только DiO" маркированы 1,5 мл трубки.
- Добавить 500 мкл свежей IMDM, содержащей ресуспендировали немаркированные К562 в "Пропидиум йодида (PI) только" маркированы 1,5 мл трубки.
- Поместите дважды положительных и PI только трубы в водяной бане 55 ° С в течение 5 мин.
- После того, как 5 мин прошло, удалите трубки и вытрите с 70% -ным этанолом.
- Добавляют 10 л PI к двойной положительной и PI только 1,5 мл пробирки.
- Поместите все три элемента управления К562 клетки-мишени в термостате при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
- После 30 мин инкубации истечет, центрифужные все три элемента управления клетки-мишени К562 в течение 2 мин при 163 х г.
- Осторожно удалите супернатант, не нарушая клеточный осадок.
- Ресуспендируют каждый элемент управления с 20 мкл свежей IMDM среды для культивирования клеток, и оставить в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение по крайней мере ,30 мин для оптимального сигнала DiO.
Примечание: Элементы управления теперь готов к запуску через поток обработки изображений цитометрии.
4. NK Cell Автоматизированный Разделение
- Включите ячейки сепаратора и позволяют цикл запуска до завершения.
- Убедитесь, что все жидкости бутылки истолкования зеленые и что бутылка отходов пуст.
- Получить температуру 15 мл стойку трубки номера.
Примечание: Выбор основан на объемах выборки. Например, при объеме менее 3 мл используют стойку пробирку объемом 15 мл и объемом более 3 мл используют Штатив для пробирок на 50 мл. - образец этикетки трубки соответственно (повтор каждого образца / участника): Участник 1 образец цельной крови; Участник 1 Отрицательный фракцию; Участник 1 Положительная дробь.
- Аккуратно пипеткой 1,5 мл цельной крови с шага 1.2 в "образец цельной крови" 15 мл трубки.
- Поместите соответствующим образом меченый 15 мл "образец цельной крови" трубки с шага 4.5 и метили 15 мл "Негативный фракции" и"Положительная фракция" трубки с шага 4.4 в стойке трубки. Используйте thefollowing образец стойку Настройка: Row (R1) A: образец цельной крови, ряд (R2) B: Negative, непомеченная фракция, Row (R4) C: Положительный, магнитно-меченый фракции.
- Вставьте разделитель рейку на Минисамплером для autolabeling.
- Выберите "Реагент" в меню и выберите положение, в котором ампула будет помещен в стойку сепаратора.
- Выберите "Read Реагент", чтобы активировать читателя 2D кода.
- Поместите соответствующий флакон с реагентом перед кодом читателя 2D между 0,5-2,5 см от крышки считывателя кода.
Примечание: Например, требуемый реагент для разделения NK клеток является CD56. - Удерживая флакон реагента под углом перед 2D считывателя кода для оптимального чтения.
- Поместите флакон реагента в правильное положение сепаратора стойки.
- Выделите нужные позиции на вкладке Разделение на экране.
- В подменю обозначая, назначить а.е.tolabeling программа.
- Присвоить разделение клеток CD56 Реагент микрогранулы в стойку позиции 1, 2, 3 и 4.
- Выберите программу разделения "posselwb".
- Выберите "Полоскание" программу стирки.
- Вставьте объем образца в 1500 мкл в подменю "Volume" с помощью цифровой клавиатуры.
- Выберите опцию "Enter" на клавиатуре.
- Выберите "Выполнить", чтобы начать разделение клеток.
- Выберите "OK", чтобы подтвердить, что достаточно буфер доступен для обработки всех образцов.
5. NK Cell Count После разделение клеток
- Сразу же после разделения клеток с разделителем клеток, получить положительную фракцию. Оставить при комнатной температуре. Эта фракция содержит желаемый чистый популяции NK-клеток.
- Для каждого отдельного образца, выполнить подсчет клеток с использованием гемоцитометра в соответствии с шагом 2.2.
- После расчетов, записи количества клеток.
6. цитотоксичности Приготовление образца
- Подготовить и разметить 1,5 мл пробирки для каждого образца / участника соответственно.
- Пипетка желаемое соотношение количества клеток NK и DIO-labled K562 клеток в каждую пробирку.
Примечание: Например, желаемое соотношение клеток-мишеней K562 и эффекторных клеток NK 1: 5. - Центрифуга в течение 5 мин при 135 х г.
- Осторожно удалите супернатант, не нарушая клеточный осадок.
- Ресуспендируют NK-DiO меченый смесь К562 клеток в 500 мкл клеточных сред NK без интерлейкина-2 (ИЛ-2) и 2-меркаптоэтанол (2-ME) (неполной НК среды для культивирования клеток).
Примечание: Неполный НК среды для культивирования клеток является минимальной необходимой среде Eagle с помощью бикарбоната натрия, без L-глутамина, рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов. - Добавьте 5 мкл PI в каждую пробирку.
- Центрифуга в течение 2 мин при 163 х г.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 2 ч.
- После 2 ч инкубации, centrifuGE в течение 2 мин при 163 х г.
- Осторожно удалите супернатант, не нарушая клеточный осадок.
- Ресуспендируют клеток в 25 мкл неполного NK среды для культивирования клеток.
7. Получение спонтанных ( "S") Образец
- Пипеток 500 мкл DIO-меченых клеток К562 (концентрация 1 × 10 6 клеток / мл) в 1,5 мл пробирку.
- Добавьте 10 мкл PI в каждую пробирку.
- Центрифуга трубки в течение 2 мин при 163 х г.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 2 ч.
- После 2 ч инкубации, центрифуги в течение 2 мин при 163 х г.
- Осторожно удалите супернатант, не нарушая клеточный осадок.
- Ресуспендируют клеток в 25 мкл неполного альфа-Minimum Essential Medium (α-MEM) для культивирования клеток.
8. Сбор данных с изображениями проточный цитометр
- Нажмите на зеленую кнопку внутри передней двери визуализации потока цитометр, чтобы включить прибор.
- Включите альл компьютеры, связанные с изображениями проточном цитометре.
- Запуск потока изображений цитометра программного обеспечения.
- Нажмите кнопку "Ввод в эксплуатацию" для промывки системы и подготовить линию образца.
- После того, как "Запуск" завершена, закрыть окно "калибровок".
- Назначение каналов: на верхней стороне левой руки, нажмите на каждом канале, чтобы присвоить их.
- На правой стороне, нажмите на кнопку график рассеяния для создания 4: Raw диаграммы рассеяния Max Pixel _MC_6 против Area_M06, RAW Макс Pixel _MC_2 против Area_M02, RAW Макс Pixel _MC_5 против Area_M05 и FieldArea_M01 против AspectRatio_M01.
- Начало анализа образцов сначала с помощью регулятора "Двойной положительный результат ".
- Нажмите на кнопку "Load".
- Поместите 1,5 мл трубки с "Двойной Позитивный" образца из шагов 3,4 до 3,9 в загрузчиком образца.
- Выберите цель 40X на вкладке "увеличивающим".
- Включите 405 мВт и642 мВт лазеры.
- Включите "Светлое" канала.
- Нажмите на кнопку "Select Intensity".
- На основе "Двойной Позитивный" контрольного образца, определить желаемую интенсивность для 405 мВт лазер поэтому детектор не перегружена.
Примечание: Например, оптимальная интенсивность для этого эксперимента была установлена на уровне 11 мВт.
- После того, как требуемая настройка достигается, сбор данных.
- На вкладке "Файл" Приобретение, введите в тексте пользовательского имени файла. Выберите папку для сохранения файла (ов) данных.
- Введите число ячеек, чтобы приобрести рядом с "Collect". Как правило, это число колеблется в пределах от 1000 до 10000.
- Нажмите на кнопку "Acquire".
Примечание: После того, как желаемое количество клеток приобретается, файл данные автоматически сохраняются в ранее выбранной папке.
- После завершения приобретения, загрузите следующий контрольный образец - DIO только контроль.
- Нажмите на кнопку "Load".
- Поместите 1,5 мл трубки с "только DiO" образца в погрузчиком образца.
- Оставьте цель 40X на вкладке "увеличивающим" выбран.
- Оставьте 405 мВт лазер включен.
- Выключите мВт лазер 642 и "Светлое" канал.
Примечание: Теперь, когда требуемая настройка достигнута, данные могут быть получены. - На вкладке "Файл" Приобретение, введите в тексте пользовательского имени файла и выберите папку для сохранения файла (ов) данных. Введите число ячеек, чтобы приобрести рядом с "Collect.". Как правило, это число равно 1000.
- Нажмите на кнопку "Acquire".
Примечание: После того, как желаемое количество ячеек приобретает файл данные автоматически сохраняются в ранее выбранной папке.
- Повторите шаг 8,10 для "только ПИ" контрольного образца. Экспериментальные образцы теперь готовы быть собраны.
- Обращайтесь с remainiнг экспериментальных образцов, в том числе "Спонтанное Образцы 'S'" следующим образом:
- Оставьте цель 40X на вкладке "увеличивающим" выбран.
- Включите 405 мВт и 642 мВт лазеров.
- Включите "Светлое" канала.
- Нажмите на "Установить интенсивность."
- На вкладке "Файл" Приобретение, введите в тексте пользовательского имени файла и выберите папку для сохранения файла (ов) данных. Введите в тексте пользовательского имени файла.
- Введите число ячеек, чтобы приобрести рядом с "Collect".
- Нажмите на кнопку "Acquire".
Примечание: После того, как желаемое количество ячеек приобретает файл данные автоматически сохраняются в ранее выбранной папке.
- Повторите шаг 8,12 для всех экспериментальных образцов.
- После того, как будут собраны все экспериментальные данные и файлы, нажмите кнопку "Завершение работы" для стерилизации системы.
9. ImaginАнализ проб г Поток Цитометр
- Открыть поток изображений цитометра применения программного обеспечения для анализа.
- Под "Файл", открыть экспериментальный файл .RIF.
- Построить новую матрицу, используя .RIF файлы одного цвета (DIO-только контроль и PI-только контроль, созданный на этапах 8.10 и 8.11), выбрав "Создать новую матрицу" на вкладке компенсации в потоке изображений цитометра программного обеспечения.
Примечание: Программа запросит выбора одного цвета файлов и объединить их, чтобы создать файл матрицы (.ctm расширение файла), который должен быть выбран, чтобы применить компенсацию канала. - Создание точечных участков с помощью функции «строительных блоков» программного обеспечения.
- Создание точка-сюжет (BrightFieldGradient_RMS против частоты) до ворот сфокусированные клетки. Вызов ворота "Фокус" (рисунок 1А).
- Использование "Фокус" ворота, создать точечный участок светлого поля Площадь против светлого поля Соотношение сторон к г ели Синглетное клетки. Вызовите ворота "Single" (рис 1B).
- С помощью "Single" ворота, создать точечный участок Intensity_MC_Ch02 против Intensity_MC_Ch5. Используйте этот участок , чтобы идентифицировать и ворота DIO-положительным только клетки (цели, живой) и PI-DiO дважды положительные клетки (мишени, мертвые) (Рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все участки описано в пунктах 9.4.1, 9.4.2 и 9.4.3 могут быть созданы с помощью функции «строительных блоков» программного обеспечения.
- Нажмите на функцию статистики дот участка для доступа к номерам ячеек каждого ворот.
- Вычислить процент мертвых мишеней в образце спонтанной и экспериментальных образцов по следующей формуле:
% мертвые мишени в образце = (#dead мишени х 100) / (# живых целей + #dead цели) - Вычислить цитотоксичности, используя следующую формулу:
% Цитотоксичности = [(Экспериментальная мертвых Спонтанное мертвых) / (100-Спонтанное мертвых)] x100
Рисунок 1: Типичные гистограммы, диаграммы рассеяния и изображения для анализа цитотоксической активности. Анализ (A) фокус ячейки. (B) одного анализа клеток. (C) целевого окрашивания клеток анализ. Все измерения производятся с использованием изображения, прикрепленную к каждому событию. Это могут быть доступны в программное обеспечение для анализа, просто нажав на события на графиках. (D) представитель образ события дублета, показывая апоптический клетки NK и цель живого K562. CH01, Светлое. CH02, DIO. CH05, PI. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение подсчета NK клеток
Эффект тяжелого бега по учетным NK клеток в цельной крови измеряли, используя протокол упражнений , описанный на фиг.2. Образцы крови отбирали перед тренировкой, сразу после тренировки, 1,5 ч после физической нагрузки, и, наконец, 24 и 48 ч после первоначального сбора крови. Концентрация NK клеток на миллилитр цельной крови измеряли для каждого бегуна (Фиг.3А) , и в среднем (фиг.3В) для каждой временной точки.
Наши результаты (рис 3А) показывают , что бегуны 1, 2 и 4 представляют подобный образец с небольшим увеличением подсчета NK клеток после тренировки, сразу же с последующим резким снижением, прежде чем медленно возвращается в нормальное русло после того, как 24 и 48 ч. Эта тенденция была особенно заметна путем построения средних NK клеток для группы бегунов, но никакого существенного отличия отбыл обнаружен уровень предварительной тренировки. Бегунка 3 представлен очень высокое количество на начальном этапе, что резко уменьшается после физических упражнений и 1,5 ч после физических упражнений, прежде, чем медленно возвращается в нормальное состояние после того, как 24 и 48 ч. В среднем, количество NK клеток (рис 3B) снизился в 1,5 ч после физической нагрузки (хотя и не значительно) , но вернулся к почти нормальным уровням через 24 ч.
Определение цитотоксичности NK
После расчета количество NK клеток, NK-клетки были немедленно созданы, чтобы определить их цитотоксическую активность, как описано в разделе 6 протокола. Результаты представлены на фигуре 4A для каждого отдельного бегуна, с фиг.4В , изображающая среднюю цитотоксичность NK. Наши результаты показывают, что средняя цитотоксичность NK несколько снизилась после тренировки и 1,5 ч после физических нагрузок (хотя и не-значительно), но значительно увеличилось после 24 ч. Цитотоксичность NK остается высоким по сравнению с пре-exercise уровни, хотя и не-значительно (отчасти из-за небольшого количества участников данного пилотного проекта).
Рисунок 2: Протокол упражнения. Кровь рисует (красные стрелки) были выполнены на п = 4 бегунов.
Рисунок 3: NK - клетки подсчитывает перед тренировкой, после тренировки, 1,5 ч и 21 ч после тренировки. Рассчитывать (A) NK клеток на миллилитр цельной крови для каждого бегуна. Отсчет (В) средняя клетка NK на миллилитр цельной крови. N = 4; Масштабные полоски = стандартная ошибка.
Рисунок 4:NK - клетки цитотоксичность перед тренировкой, после тренировки, 1,5 ч и 21 ч после тренировки. Клеточной цитотоксичности (А) НК (выраженное в процентах от мертвых клеток - мишеней) для каждого отдельного бегуна. (В) средний цитотоксичности NK (выраженное в процентах от мертвых клеток - мишеней). N = 4; Масштабные полоски = стандартная ошибка; *: Р <0,05; **: Р <0,005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный в данном исследовании метод непосредственно измеряет удельную активность NK-клеток индивидуума в ответ на раздражители (в данном конкретном случае, продолжительные упражнения). Как правило, клетки NK изолированы от своей крови с использованием градиентов плотности или сортировки клеток с помощью комбинации маркеров. Хотя эти методы широко используются, они имеют множество недостатков: они много времени, включать в себя несколько манипуляций, и в значительной степени зависят пользователь. В результате чрезмерных нагрузок помещается на изолированных клетках NK, что может привести к увеличению изменчивости от эксперимента к эксперименту, или даже в том же самом эксперименте. В этой статье мы описали протокол, который использует магнитную изоляцию на основе. Это позволяет быстро и надежной сортировки большого количества клеток NK в цельной крови индивидуума, при сведении к минимуму крови или манипуляций NK-клеток.
Этот метод особенно подходит для исследований человека, где образцы редки, нона обратной стороне этот метод становится довольно сложным, когда слишком много образцов должны быть обработаны вместе. В самом деле, окно приобретения для цитотоксического анализа должны быть, как правило, в течение 30 мин после того, как в конце инкубации, что в нашем опыте перевести на 5 образцов в то время, в лучшем случае. Если многие образцы должны быть обработаны, важно установить ошеломляющие график, чтобы обеспечить достаточное время для приобретения цитометрии потока. Другим недостатком этого способа может быть стоимость реагентов, которые достаточно высоки и могут быть быстро разряжаются, если больше количество крови, обрабатывается для получения более высокого выхода NK. Тем не менее, мы считаем, что эти затраты компенсируются за счет значительного количества сэкономленного времени.
Критические шаги в этом протоколе, являются те, которые являются наиболее открытыми для модификаций. Это имеет решающее значение для поддержания крови при комнатной температуре и обрабатывать в течение часа рисования, чтобы избежать стресса клеток NK. После выделения, количество клеток чрезвычайно важно дляточность результата, поэтому метод подсчета должен быть постоянным: например, для трипанового синего убедитесь, что несколько квадратов рассчитывали на гемоцитометра, и что пользователь или лаборатории использует одни и те же параметры идентификации. Протокол, представленные здесь, использует 1,5 мл крови и цитотоксичность тест NK клеток при Т: соотношение Е 1: 5, однако эти параметры могут быть оптимизированы в зависимости от требуемого анализа и доступного количества крови: если меньше крови доступно тогда можно использовать более низкие коэффициенты, такие как 1: 4 или даже 1: 3 до сих пор имеют разумные времени обнаружения. В нашем опыте более низкие показатели могут быть недостаточными для обеспечения соответствующего цитотоксической активностью. Кроме того, из-за вариации выборки, это происходит, что счетчик НК клеток значительно ниже, чем ожидалось; в ответ, необходимо уменьшить количество клеток-мишеней в реакционных трубах, чтобы поддерживать тот же Т: отношение E на протяжении эксперимента. В ходе анализа результатов, наиболее важным шагом является потратить столько времени, сколько необходимополучить хорошую матрицу. Это может быть достигнуто только тогда, когда большое внимание уделяется подготовить элементы управления, описанные в шаге 3 протокола. После того, как ворота были установлены, как описано в шаге 9, файлы могут группироваться вместе и проанализированы в серии с очень небольшим изменением. В случае сомнений, пользователь должен всегда обращаться к галерее изображений, нажав на любом случае нанесены на график ( если смотреть на рис 1C) для того, чтобы проверить , что все соответствующие мероприятия включены в соответствующую ворота.
Представительные результаты на рисунке 2А показано , что 3 бегунов из 4 представили аналогичную картину. Схема 4 - го бегуна, вероятно , специально для этого человека и не представляет собой ошибочное измерение. Количество NK клеток для данного индивида была на верхнем конце допустимого диапазона в целом человеческой крови как до физических упражнений и 48 ч после физических упражнений. Это демонстрирует одну из сильных сторон метода, описанных в этой статье, где NK гргезов может быть определена точно. Кроме того, возможность получить родные клетки через одну стадию маркировки, позволяет минимальным стрессом и модификаций к клеткам NK. Это особенно важно, когда клетка цитотоксичность NK измеряется в физиологических условиях стресса.
После выделения, NK-клеток цитотоксичность обычно определяют с помощью проточной цитометрии или анализе радиоактивного выброса (проба хрома, например). В то время как анализы высвобождения считаются золотым стандартом, они основаны на использовании радиоактивных изотопов и сопутствующего оборудования, которые являются чрезвычайно дорогими. Кроме того, правила использования и утилизации радиоактивных материалов усложняет экспериментов, которые требуют временной эффективности и точности. Применение проточной цитометрии подход имеет смысл, но типичные меры предосторожности должны соблюдаться в том числе лазерных установок, а также компенсации Флуорохром и стробирования. Это особенно верно, когда 2 различных типов клеток в ЗНmple, как это имеет место для цитотоксических анализов. Тем не менее, в нашем случае использование потока изображений цитометр позволяет изображению быть захвачены для каждого события, а параметр соотношение размеров позволяет разделение дублетов из отдельных клеток. Это очень важный момент, так как анализ цитотоксический опирается на физический контакт между эффектора и мишени; Очень часто эти 2 типа клеток все еще будут вместе во время измерения расхода, вводя ложные двойные позитивы в результаты. Это очень точка показана на рис 1D, который показывает дублет , образованный (умирающего, PI положительной) NK клетки, и а (живой, DIO положительный, отрицательный PI) К562. В традиционной проточной цитометрии, это событие будет добавлено к отсчету гибели клеток К562, но на самом деле ложный положительный результат. Удаление данных действительно может быть проблематичным, однако это не так, если это делается последовательно и с использованием очень строгих параметров от эксперимента к эксперименту (в этом случае параметр "соотношение сторон"). В свою очередь,полученные данные будут гораздо более стабильной. Кроме того, визуализируя все события позволяет точно стробирования (и количество) каждого события на основе цветовых параметров, не полагаясь на жестких ворот, которые традиционно установленные с помощью элементов управления и которые не принимают во внимание естественный "дрейф данных", который может произойти в проточной цитометрии. Добавлена возможность визуализации каждого отдельного целевого события во время приобретения, позволяет улучшенной стробирования одного (только Dio, представляющий живых клеток-мишеней) и дважды окрашивают население (DIO + PI окрашивали, представляющий мертвые клетки-мишени).
Кроме того, рабочий процесс, представленный здесь был оптимизирован, чтобы принять во внимание дефицит клеток NK в цельной крови и необходимость точных результатов. В то время как традиционные NK клеток цитотоксичности исследовать литическую активность на нескольких Т: коэффициенты Е, это непрактично по нескольким причинам: 1) количество доступных клеток NK из цельной крови ограничены и крайне variable и 2) количество клеток-мишеней, необходимых для анализа должен быть достаточно большим, чтобы обеспечить достаточно быстрое приобретение данных. Несколько тестов при различных соотношениях (здесь не показано) , показали , что 1: 5 Т: соотношение Е, которое переводят в 4 х 10 4 Т / 2 х 10 5 Е дает оптимальный баланс, и обеспечивает большую воспроизводимостью. На основе повторных анализов с образцами из разных лиц (здесь не показано), это соотношение также обеспечивает ожидаемую цитотоксическую активность 50-70% в нормальных образцах, что обеспечивает значительное над и под окном для измерения эффекта вмешательств.
Количество натуральных киллеров было похоже на то , что было найдено в других работах 11, 12, 13, и на одной линии с общепринятом диапазоне частоты клеток NK на крови 14. Тем не менее, преимущество этого нового рабочего процесса демонстрируется на фигуре 3В, где мы определяеме изд значительное увеличение цитотоксичности NK через 24 ч по сравнению с уровнями перед тренировкой, несмотря на подсчет клеток NK, который был в среднем (хотя и существенно не) меньше, в то же момент времени. Этот результат отличается от других опубликованных исследований, в которых цитотоксические уровни были в основном идентичны (или даже ниже) до уровней перед тренировкой. Это говорит о том, что вместо того, чтобы быть подавленным в течение длительного периода времени после тренировки, цитотоксичности НК может быть в состоянии "отскока" на еще более высокий уровень после всего лишь 21 ч после физических упражнений. Это наблюдение с использованием новой методологии с чистыми, здоровыми клетками NK, если они будут подтверждены в последующих исследованиях, имеет потенциал, чтобы изменить текущую перспективу, что тяжелые нагрузки является иммунодепрессивным. Когда клетки NK, получены с использованием Ficoll градиенты или проточной цитометрии сортировки на основе, в результате популяция либо смешивают с другими типами клеток, содержат несколько поврежденных клеток NK и / или НК-клеток с измененной реакции. Эти последствия следует ожидать consiDering длину, жесткость и / или неточность указанных выше способов. Устранение этих проблем, и оставаясь близко к физиологическим условиям на протяжении всего времени, приведет к экспериментальным результатам более представительным клеток NK в естественных условиях поведения.
Подводя итог, мы описали интегрированный технологический процесс, который позволяет для быстрого и точного выделения и обнаружения цитотоксичности NK из малых образцов крови человека, что позволяет избежать некоторых ограничений, связанных с другими методами. В то время как человеческая кровь была в центре внимания данной работы, следует отметить, что эта методика может быть применена к образцам крови животных. Этот рабочий процесс является чрезвычайно воспроизводим и может обнаружить небольшие изменения, что особенно ценно для исследования физических упражнений, где число участников ограничены, а последовательные меры крови приобретаются. Как подчеркивается в представительных результатов, этот усовершенствованный метод имеет потенциал, чтобы бросить вызов и улучшить современные знания в физической области иммунологии,и других областях, связанных с НК иммунологического надзора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , Garland Science. (2001).
