Abstract
NK-cellecytotoksicitet er et meget anvendt foranstaltning at bestemme virkningen af intervention udefra på NK-celle funktion. Imidlertid kan nøjagtigheden og reproducerbarheden af denne assay anses ustabil, enten på grund af brugerens fejl eller på grund af følsomheden af NK-celler til eksperimentel manipulation. For at eliminere disse problemer, blev en arbejdsgang, der reducerer dem til et minimum etableret og præsenteres her. For at illustrere, vi opnåede blodprøver, på forskellige tidspunkter, fra løbere (n = 4), som blev underkastet en intens anfald af motion. Først NK-celler samtidigt identificeres og isoleres gennem CD56 tagging og magnetisk-baseret sortering, direkte fra fuldblod og fra så lidt som en milliliter. De sorterede NK-celler fjernes eventuelle reagenser eller capping antistoffer. De kan tælles for at etablere en nøjagtig NK celletal per milliliter blod. For det andet kan de sorterede NK-celler (effektorer celler eller E) blandes med 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine Perchloratmateriale (DIO) mærkede K562-celler (målceller eller T) ved en assay-optimal 1: 5 T: E ratio, og analyseret ved hjælp af en billeddannende flow-cytometer, der giver mulighed for visualisering af hvert arrangement og afskaffelsen af enhver falsk positiv eller falsk negative (såsom dublering eller effektorceller). Denne arbejdsproces kan være afsluttet i omkring 4 timer, og giver mulighed for meget stabile resultater selv ved arbejde med humane prøver. Når tilgængelig, kan forskerhold teste flere eksperimentelle indgreb i mennesker, og sammenligne målinger på tværs af flere tidspunkter uden at kompromittere data integritet.
Introduction
Naturlige dræberceller er et væsentligt element i det medfødte immunsystem. Mens de er meget reguleret, de har evnen til at genkende og eliminere unormale celler gennem celle-til-celle-kontakt og uden forudgående aktivering 1. Som sådan udgør de en hurtig linje i forsvaret mod infektioner. Motion, især intens, har vist sig at transient nedtrykke immunsystemet 2, 3, 4, 5. NK-celler er særligt udsatte for denne effekt 4, 6, 7, i realiteten skabe et vindue af forøget følsomhed over for sygdomme. Derfor studiet af indgreb før, under eller efter intens træning med det mål at reducere dens indvirkning på NK celle funktion er af særlig interesse for trivsel atleter post-konkurrencer.
8, på omkring 1% af de hvide blodlegemer rum; 2) NK-celler er meget følsomme over for stress og stole på konstant udsættelse for fysiologiske betingelser at forblive levedygtig og stabil under eksperimenter; og 3) standard assays til at bestemme NK celle cytotoksicitet, såsom Ficoll gradienter 9 og frigivelse assays 10, er upålidelige og inkonsekvent. Den iboende variation af humane prøver kun forværre disse problemer. Friske humane prøver indsamlet under interventioner er temmelig reguleret og vanskelige at skaffe, i hvert fald i forhold til dyr prøver eller immortaliserede cellelinjer. Dette reducerer mulighederne for at gentage eksperimenter eller tilføje deltagere til undersøgelsen kohorte at nå betydelige statistiske tærskler. Kollektivt, disse spørgsmål støtter behovet for en strømlinet protokol, der tillader foR både high-throughput og en høj pålidelighed analyse af NK-celle lytisk aktivitet i humane prøver.
Vi har etableret en arbejdsgang, der forkorter den nødvendige tid til at identificere, isolere og test NK-celler fra humant fuldblod og samtidig minimere udsættelse for udefra kommende faktorer. Metoden optimerer brugen af to instrumenter, en magnetisk-baserede celle sorteringsanlæg og en billeddannende flowcytometer, og en analyse-specifikke, optimeret T: E ratio for at tillade påvisning af fald eller stigninger på NK-celle cytotoksicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer indsamling blod blev gennemført i overensstemmelse med de retningslinjer fastsat af Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).
1. Hele Blodprøvetagning
- Har en certificeret bioanalytikeren trække blod ifølge WHO retningslinjer.
- Trække blod ind i en 4 ml blodopsamlingsrør indeholdende Di-Kalium ethylendiamintetraeddikesyre (K2 EDTA). Invert blodopsamlingsrør ifølge producentens anvisninger. Hold blodopsamlingsrør ved stuetemperatur på en bench-top rocker indtil adskillelse.
2. Fremstilling af DIO-mærkede målceller
- Grow K562-celler i komplet Iscoves Modificeret Dulbeccos medie (IMDM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin i flere uger før assayet for at sikre sundhed af cellerne. Juster koncentration af cellerne til 3 x 10 5 celler / ml dagligt gennem færdiggørelsen af en celletælling og efterfølgende passage af celler. Udføre en komplet medium skifter hver 2 til 3 dage.
- På dagen for assayet, udføre en celletælling under anvendelse af en 1: 1 hæmocytometer.
- Fjern 10 pi fra K562 kolbe og anbringes i 1,5 ml rør.
- Tilsæt 10 pi trypanblåt i den samme 1,5 ml rør til en fortyndingsfaktor på 1: 1.
- Knips forsigtigt på røret for at blande K562-celler og trypanblåt.
- Tillad K562 celle-trypanblåt at inkubere i 1 min ved stuetemperatur.
- Fjern 15 pi af farvede K562-celler fra røret.
- Pipette på hæmocytometer til celletælling.
- Tæl celler i de fire hjørne kvadrater samt det midterste kvadrat for i alt fem kvadrater.
- Beregn celletælling ved brug af ligningen:
Total celler / ml = Total celler tælles X (fortyndingsfaktor / antal pladser) X 10.000 / mL
- For ufarvede K562 målceller, der tilsættes 10 ml K562 målceller til en 15 ml rør ved en tæthed på 1 x 10 6 celler / ml for i alt 10 x 10 6 K562 celler. Placer i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 indtil den er klar til brug.
- For DiO farvede K562 målceller, tilsættes 10 ml K562 målretter celler til en 15 ml rør ved en tæthed på 1 x 10 6 celler / ml for i alt 10 x 10 6 K562 celler.
- Tilsæt 1 pi af DIO celle-mærkning opløsning pr ml cellesuspension i 15 ml rør udpeget til DiO farvning og forsigtigt vortex. For eksempel tilsættes 10 pi af DIO celle-mærkning løsning på 10 x 10 6 K562 celler / ml i et volumen på 1 x 10 6 celler / ml.
- Inkuber K562-DiO opløsning i 20 minutter ved 37 ° C med 5% CO2 i en 15 ml rør.
- Følge eftering inkubation tilsættes 3 ml stuetemperatur phosphatpufret saltvand (PBS) til K562-DiO opløsning indeholdende 15 ml rør.
- Centrifuger i 10 minutter ved 135 xg ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepelleten med en 1000 pi volumen-justerbar pipette.
- Tilsæt 10 ml frisk IMDM til celle pellet-holdige 15 ml rør.
- Forsigtigt vortex røret for at resuspendere cellerne.
- Gentag trin 2.7 til 2.10 to gange mere.
- Opbevar celler i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 indtil den er klar til brug.
BEMÆRK: Celler kan opbevares i inkubatoren i op til 24 timer, men det foretrækkes at anvende dem på samme dag.
3. Forberedelse af kontroller
- Overfør følgende i separate og hensigtsmæssigt mærkede 1,5 ml rør:
- Tilføj 500 pi frisk IMDM indeholdende resuspenderes DiO-mærkede K562-celler ind i "Double Positive" mærket 1,5 ml rør.
- Tilsæt 500 pi frisk IMDM indeholdende resuspenderet DiO-mærkede K562-celler i "DiO kun" mærket 1,5 ml rør.
- Tilsæt 500 pi frisk IMDM indeholdende resuspenderet umærkede K562-celler i "propidiumiodid (PI) kun" mærket 1,5 ml rør.
- Det dobbelte Positive og PI kun rør i en 55 ° C vandbad i 5 minutter.
- Efter 5 min er gået, fjerne rør og tørre ned med 70% ethanol.
- Tilsæt 10 l PI til Double Positive og PI kun 1,5 ml rør.
- Anbring alle tre K562 target cellekontroller i inkubatoren ved 37 ° C i 30 minutter.
- Efter 30 minutters inkubation er udløbet, centrifugeres alle tre K562 target cellekontroller i 2 min ved 163 x g.
- Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepelleten.
- Resuspender hver kontrol med 20 pi af frisk IMDM celledyrkningsmedier, og kolben anbringes i 37 ° C inkubator med 5% CO2 i mindst30 min for optimal DiO signal.
BEMÆRK: Kontrol er nu klar til at blive kørt gennem imaging flowcytometeret.
4. NK Cell Automatiseret Separation
- Tænd celle separator og lade opstart cyklus for at afslutte.
- Sørg for, at alle flydende flasker illuminationer er grønne og at flasken affald er tom.
- Anskaf en stuetemperatur 15 ml rør rack.
BEMÆRK: Valg er baseret på prøvevolumener. For eksempel til et volumen mindre end 3 ml bruge et 15 ml rør rack og for en mængde mere end 3 ml bruge en 50 ml rør rack. - Label prøverør i overensstemmelse hermed (Gentag per prøve / deltager): Deltager en fuldblodsprøve; Deltager 1 Negativ fraktion; Deltager 1 Positiv fraktion.
- Forsigtigt pipette 1,5 ml helblod fra trin 1.2 i "fuldblodsprøve" 15 ml rør.
- Placer behørigt mærket 15 ml "Whole Blood Sample" rør fra trin 4.5 og mærket 15 ml "Negative fraktion" og"Positiv fraktion" rør fra trin 4.4 i røret rack. Brug thefollowing prøve rack set-up: Række (R1) A: Whole blodprøve, Row (R2) B: Negativ, umærket fraktion, Row (R4) C: Positiv, magnetisk mærkede fraktion.
- Sæt separatoren rack på MiniSampler for autolabeling.
- Vælg "Reagent" i menuen og fremhæve den position, hvor hætteglasset vil blive placeret i separatoren rack.
- Vælg "Læs reagens" for at aktivere 2D kode læseren.
- Placer passende reagens hætteglas foran 2D-kodelæser mellem 0,5-2,5 cm fra kodelæser dækslet.
BEMÆRK: For eksempel nødvendigt reagens for NK-celle adskillelse er CD56. - Hold hætteglasset reagens i en vinkel foran 2D-kodelæser for optimal læsning.
- Placer hætteglasset reagens i den korrekte separator rack position.
- Fremhæv de ønskede positioner under fanen Separation på skærmen.
- Fra mærkning undermenuen, tildele en autolabeling program.
- Tildel Cell Separation Reagens CD56 mikroperler til rack position 1, 2, 3, og 4.
- Vælg "posselwb" adskillelse program.
- Vælg "Skyl" vaskeprogram.
- Indsæt en prøvemængde på 1.500 uL i "Volume" undermenuen på det numeriske tastatur.
- Vælg indstillingen på tastaturet "Enter".
- Vælg "Kør" for at starte celleseparation.
- Vælg "OK" for at bekræfte, at nok buffer er tilgængelig for behandling af alle prøver.
5. NK celletælling Efter Cell Separation
- Umiddelbart efter celleseparation med celleseparatoren, hente den positive fraktion. Efterlad ved stuetemperatur. Denne fraktion indeholder det ønskede rene NK-celle population.
- For hver enkelt prøve, udføre en celletælling under anvendelse af et hæmocytometer som pr Trin 2.2.
- Efter beregninger, optage celletal.
6. cytotoksicitetsanalyse Prøvefremstilling
- Forberede og mærke 1,5 ml rør for hver prøve / deltager i overensstemmelse hermed.
- Pipette ønskede forhold mellem NK-celler og DIO-labled K562-celler i hvert rør.
BEMÆRK: For eksempel det ønskede forhold mellem K562 målceller og NK-effektorceller er 1: 5. - Centrifuger i 5 minutter ved 135 x g.
- Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepelleten.
- Resuspender NK-DiO mærkede K562-blanding celle i 500 pi NK-celle medier uden interleukin-2 (IL-2) og 2-mercaptoethanol (2-ME) (ufuldstændig NK cellekulturmedier).
BEMÆRK: ufuldstændig NK celledyrkningsmedier er Minimum Essential Medium Eagle med natriumbicarbonat, uden L-glutamin, ribonukleosider og deoxyribonucleosider. - Tilsæt 5 pi af PI til hvert rør.
- Centrifuger i 2 minutter ved 163 x g.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
- Efter 2 timers inkubation centrifuge i 2 minutter ved 163 x g.
- Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepelleten.
- Resuspender celler i 25 pi ufuldstændig NK celledyrkningsmedier.
7. Fremstilling af Spontan ( "S") Prøve
- Pipette 500 pi af DIO-mærkede K562-celler (koncentration på 1 x 10 6 celler / ml) i 1,5 ml rør.
- Der tilsættes 10 pi af PI til hvert rør.
- Centrifugerør i 2 minutter ved 163 x g.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
- Efter 2 timers inkubation centrifugeres i 2 minutter ved 163 x g.
- Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepelleten.
- Resuspender celler i 25 pi ufuldstændig alfa-Minimum Essential Medium (α-MEM) celledyrkningsmedier.
8. dataopsamling med Imaging flowcytometer
- Tryk på den grønne knap inde foran døren til den billeddannende flowcytometer for at tænde instrumentet.
- Slå all computere forbundet med billeddannelse flowcytometer.
- Start imaging flowcytometer software.
- Klik på knappen "Start" for at skylle systemet og forberede prøven linje.
- Når "Idrifttagning" er færdig, lukkes ud "kalibreringer" vinduet.
- Tildel kanaler: på den øverste venstre side, klik på hver kanal for at tildele dem.
- På den højre side, skal du klikke på scatter plot-knappen for at oprette 4 scatterplots: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 og FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
- Begynd at analysere prøver ved først at bruge "Double Positiv" kontrol.
- Klik på "Load".
- Placer 1,5 ml rør med "Double Positive" prøve fra trin 3.4 til 3.9 i prøven loader.
- Vælg 40X målet under fanen "Forstørrelse".
- Tænd for 405 mW og642 mW lasere.
- Tænd "Lysfelt" kanal.
- Klik på "Select Intensitet."
- Baseret på "Double Positiv" kontrolprøve, fastlægge den ønskede intensitet for 405 mW laser, så detektoren ikke overbelastes.
Bemærk: For eksempel blev den optimale intensitet for dette eksperiment sat til 11 mW.
- Efter at den ønskede opsætning, erhverve data.
- Under fanebladet "File Acquisition", indtaste et brugerdefineret filnavn tekst. Vælg en mappe til at gemme data fil (er).
- Indtast antallet af celler til at erhverve ved siden af "Collect". Typisk dette antal varierer mellem 1.000 til 10.000.
- Klik på "Hent".
BEMÆRK: Når det ønskede antal celler er erhvervet, er datafilen gemmes automatisk i den tidligere valgte mappe.
- Efter overtagelsen er færdig, lægge næste kontrolprøve - DiO kun kontrol.
- Klik på "Load".
- Placer 1,5 ml rør med "DiO kun" prøve i prøven loader.
- Lad 40X mål under "Forstørrelse" fanen valgt.
- Lad 405 mW laser tændt.
- Sluk den 642 mW laser og "Lysfelt" kanal.
BEMÆRK: Nu at der er opnået den ønskede opsætning, kan data erhverves. - Under "File Acquisition" fanen, skal du indtaste i en brugerdefineret filnavn tekst, og vælg en mappe til at gemme data fil (er). Indtast antallet af celler til at erhverve ved siden af "Collect".. Typisk dette nummer er 1000.
- Klik på "Hent".
BEMÆRK: Når det ønskede antal celler er erhvervet datafilen gemmes automatisk i den tidligere valgte mappe.
- Gentag trin 8.10, til "PI kun" kontrolprøve. De eksperimentelle prøver er nu klar til at blive hentet.
- Håndter remaining eksperimentelle prøver, herunder de "Spontane" S "Samples" som følger:
- Lad 40X mål under "Forstørrelse" fanen valgt.
- Tænd for 405 mW og 642 mW lasere.
- Tænd for "Lysfelt" kanal.
- Klik på "Set Intensitet."
- Under "File Acquisition" fanen, skal du indtaste i en brugerdefineret filnavn tekst, og vælg en mappe til at gemme data fil (er). Indtast i en brugerdefineret filnavn tekst.
- Indtast antallet af celler til at erhverve ved siden af "Collect".
- Klik på "Hent" knappen.
BEMÆRK: Når det ønskede antal celler er erhvervet datafilen gemmes automatisk i den tidligere valgte mappe.
- Gentag trin 8,12 for alle eksperimentelle prøver.
- Efter alle eksperimentelle data og filer er blevet indsamlet, klik på "Luk" knappen for at sterilisere systemet.
9. imaging Flow Cytometer Sample Analysis
- Åbn imaging flowcytometeret analyse program.
- Under "File", åbne en eksperimentel .RIF fil.
- Byg en ny matrix ved hjælp af de enkelt farve .RIF filer (DIO-kun styre og PI-kun kontrol, oprettet under trin 8.10 og 8.11) ved at vælge "Opret en ny Matrix" under fanen Erstatning imaging flowcytometer software.
BEMÆRK: Softwaren vil bede for udvælgelse af de enkelte farvefiler og flette dem til at skabe en matrix-fil (.ctm filtypenavn), der skal vælges til at anvende kanal kompensation. - Opret dot plots ved at bruge "byggeklodser" funktionen af softwaren.
- Opret en dot-plot (BrightFieldGradient_RMS vs frekvens) til gate de fokuserede celler. Ring til gate "Focus" (figur 1A).
- Brug af "Focus" gate, oprette en dot plot af Bright Field Area vs Bright Field Aspect Ratio til g spiste singlet celler. Ring til gate "Single" (figur 1B).
- Brug af "Single" gate, oprette en dot plot af Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Brug denne plot til at identificere og gate DiO-positive kun celler (mål, levende) og PI-DiO dobbelt positive celler (mål, døde) (figur 1C).
BEMÆRK: Alle de parceller, der er beskrevet i trin 9.4.1, 9.4.2, og 9.4.3 kan skabes ved hjælp af "byggeklodser" funktionen af softwaren.
- Klik på statistik funktion af dot-plot for at få adgang til celle numre af hver port.
- Beregn procentdelen af døde mål i den spontane prøve og eksperimentelle prøver ved hjælp af følgende formel:
% døde mål i prøven = (#dead mål x 100) / (# levende mål + #dead mål) - Beregn cytotoksicitet ved hjælp af følgende formel:
% Cytotoksicitet = [(Eksperimentel dead-Spontan døde) / (100-Spontan døde)] x100
Figur 1: Repræsentative histogrammer, scatter plots og billeder til cytotoksisk aktivitet analyse. (A) fokus celle analyse. (B) enkelt celleanalyse. (C) målcelle farvning analyse. Alle afgørelser herom træffes ved hjælp af billede tilknyttet hver hændelse. Dette kan tilgås i analyse software ved blot at klikke på begivenheden på graferne. (D) repræsentativt billede af en dublet begivenhed, der viser en apoptotisk NK-celle og en levende K562 target. Ch01, Lysfelt. Ch02, Dio. Ch05, PI. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestemmelse af NK celletælling
Virkningen af tunge kører på NK-celler i fuldblod blev målt under anvendelse udøvelsen protokol beskrevet i figur 2. Blodprøver blev udtaget før motion, umiddelbart efter træning, 1,5 timer efter træning, og endelig 24 og 48 timer efter den indledende trække blod. Koncentrationen af NK-celler per milliliter af fuldblod blev målt for hver løber (figur 3A) og i gennemsnit (figur 3B) for hvert tidspunkt.
Vores resultater (figur 3A) viser, at løbere 1, 2, og 4 til stede et lignende mønster med en svag stigning på NK celletælling efter træning, umiddelbart efterfulgt af et kraftigt fald, før langsomt vendte tilbage til normal efter 24 og 48 timer. Denne tendens var særligt synligt ved at plotte NK celle gennemsnit for gruppen af løbere, men ingen signifikant forskel frapre-øvelse niveauer blev opdaget. Runner 3 præsenteret en meget høj tæller i første omgang, at faldt voldsomt efter træning og 1,5 time efter træning, før langsomt vendte tilbage til normal efter 24 og 48 timer. I gennemsnit NK celletal (figur 3B) faldt 1,5 timer efter træning (omend ikke signifikant) men var tilbage til næsten normale niveauer efter 24 timer.
Bestemmelse af NK-cellers cytotoksicitet
Efter beregning af NK celletal blev NK-celler straks sat op til at bestemme deres cytotoksiske aktivitet som beskrevet i afsnit 6 i protokollen. Resultaterne er vist i figur 4A for hver enkelt løber, med figur 4B afbilder den gennemsnitlige NK cytotoksicitet. Vores resultater viser, at gennemsnittet NK cytotoksicitet faldt lidt efter træning og 1,5 timer efter træning (omend ikke-signifikant), men steg betydeligt efter 24 timer. NK cytotoksicitet fortsat høj i forhold til før-Motion niveauer, omend ikke-signifikant (delvis på grund af det lille antal deltagere i dette pilotprojekt).
Figur 2: Motion protokol. Blodprøvetagning (røde pile) blev udført på n = 4 løbere.
Figur 3: NK-celler tæller pre-workout, post-workout, 1,5 timer og 21 timer efter træning. (A) NK celletal per milliliter af fuldblod for hver enkelt løber. (B) gennemsnitlig NK celletal per milliliter af fuldblod. N = 4; Scale barer = standard fejl.
Figur 4:NK celler cytotoksicitet pre-workout, post-workout, 1,5 timer og 21 timer efter træning. (A) NK-celle-cytotoksicitet (udtrykt i procent af døde målceller) for hver enkelt løber. (B) gennemsnitlig NK-celle-cytotoksicitet (udtrykt i procent af døde målceller). N = 4; Scale barer = standardafvigelse; *: P <0,05; **: P <0,005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den i dette studie metode direkte måler den specifikke aktivitet af et individs NK-celler som respons på stimuli (i dette særlige tilfælde, langvarig motion). Typisk NK-celler isoleret fra blod ved hjælp densitetsgradienter eller cellesortering ved anvendelse af en kombination af markører. Mens disse metoder i vidt omfang anvendes, de har mange ulemper: de er tidskrævende, involverer flere manipulationer, og er stærkt brugeren afhængig. Som følge heraf er unødig stress placeret på de isolerede NK celler, hvilket kan resultere i øget variabilitet fra eksperiment til eksperiment, eller selv inden for samme eksperiment. I dette papir, beskrev vi en protokol, der udnytter magnetisk-baseret isolation. Dette giver mulighed for hurtig og pålidelig sortering af et stort antal NK-celler i et individs fuldblod, samtidig minimere blod eller NK-celle manipulation.
Denne metode er særligt velegnet til humane studier, hvor prøver er sparsomme, menpå den bagside metoden bliver temmelig svært, når for meget prøver skal behandles sammen. Faktisk må vindue af anskaffelse i cytotoksisk assay typisk være inden for 30 min efter afslutningen af inkubationen som vores erfaring oversætte til 5 prøver ad gangen på det mest. Hvis mange prøver der skal bearbejdes, er det vigtigt at etablere en svimlende tidsplan for at give tilstrækkelig tid til flowcytometri erhvervelse. En anden ulempe ved denne metode kunne være prisen på reagenserne, der er temmelig høj, og kan indtages hurtigt, hvis mere mængden af blod behandles for højere NK udbytte. Vi mener imidlertid, at disse omkostninger opvejes af den betydelige mængde tid gemt.
De kritiske skridt i denne protokol er dem, der er de mest åbne over for ændringer. Det er afgørende at opretholde blodet ved stuetemperatur og behandle inden for en time, for at undgå NK celle stress. Efter isolering celletal er yderst kritisk forresultat nøjagtighed, så metoden til optælling skal være konstant: for eksempel til trypanblå assay sørge for, at flere pladser tælles på hæmocytometeret, og at brugeren eller laboratoriet anvender samme identifikationskrav parametre. Protokollen præsenteres her anvender 1,5 ml blod og test NK-cellers cytotoksicitet ved en T: E-forhold på 1: 5, men disse parametre kan optimeres afhængigt af det ønskede assay og den tilgængelige mængde blod: hvis mindre blod er tilgængelig så det er muligt at anvende lavere forhold, såsom 1: 4 eller endda 1: 3 til stadig har rimelig erhvervelse tid. Det er vores erfaring lavere forhold kunne være utilstrækkelig til at tillade en passende cytotoksisk aktivitet. Også på grund af prøven variation, sker det, at NK-celletal er meget lavere end forventet; som svar, er det nødvendigt at sænke mængden af målceller i reaktionsrørene at opretholde samme T: E ratio hele et eksperiment. Under resultat analyse, det mest kritiske skridt er at bruge så meget tid som nødvendigt for atopnå en god matrix. Dette kan kun opnås, hvis stor omhu for at forberede den kontrol, der er beskrevet i trin 3 i protokollen. Når portene er blevet etableret som beskrevet i trin 9, kan filerne for samling sammen og analyseret i serie med meget lidt variation. Er man i tvivl, skal brugeren altid henvise til billedgalleriet ved at klikke på alle omstændigheder afbildes på en graf (set på figur 1C), med henblik på at kontrollere, at alle relevante begivenheder indgår i den rigtige port.
De repræsentative resultater i figur 2A viste, at 3 løbere af 4 præsenteret en lignende mønster. Mønsteret af de 4 th runner var sandsynligvis specifik for, at de enkelte, og ikke repræsenterer en fejlagtig foranstaltning. NK celletal for denne person i den øvre ende af den accepterede område i humant fuldblod både præ-øvelse og 48 timer efter træning. Dette viser en af styrkerne ved den metode, der er beskrevet i dette dokument, hvor NK calen kan nøjagtigt opnås. Derudover evnen til at opnå native celler gennem et enkelt trin mærkning, giver mulighed for minimal stress og ændringer i de NK-celler. Dette er især kritisk, når NK-cellers cytotoksicitet bliver målt under fysiologiske stressbetingelser.
Efter isolering er NK-cellers cytotoksicitet typisk bestemt ved flowcytometri eller et assay radioaktiv frigivelse (krom assay for eksempel). Mens analyser release betragtes som en gold standard, de er afhængige af brugen af radioaktive isotoper og beslægtet udstyr, som er ekstremt dyrt. Derudover regler for anvendelse og bortskaffelse af radioaktive materialer tilføjer kompleksitet til eksperimenter, der kræver tid-effektivitet og præcision. Brugen af en flowcytometri tilgang giver mening, men typiske forholdsregler skal følges herunder laser indstillinger og fluorokrom kompensation og gating. Dette gælder især, når 2 forskellige typer celler er i sample, som det er tilfældet for cytotoksiske assays. Men i vores tilfælde brugen af et billeddannende flowcytometer tillader, et billede, som skal tages for hvert arrangement, og størrelsesforholdet parameter kan adskillelsen af dubletter fra enkeltceller. Dette er et kritisk punkt, idet det cytotoksiske assay er afhængig af den fysiske kontakt mellem effektor og mål; meget ofte disse 2 typer af celler vil stadig være sammen under flowmåling, indføre falsk dobbelt positiver i resultaterne. Denne meget punkt er illustreret i figur 1D, som viser en dublet dannet af en (døende, PI positive) NK-celle, og en (levende, Dio positive, PI negativ) K562-celler. I traditionel flowcytometri, ville denne begivenhed hvormed K562 celledød count men er i virkeligheden en falsk positiv. Fjernelse af data kan faktisk være problematisk, men det er ikke, hvis det bliver gjort konsekvent og bruge meget strenge parametre fra eksperiment til eksperiment (i dette tilfælde "billedformat" parameter). Til gengæld,de opnåede data vil være meget mere stabil. Derudover visualisere alle hændelser giver mulighed for præcis gating (og tælle) for hver begivenhed baseret på farve parametre, uden at støtte sig på stive porte, der traditionelt er etableret ved hjælp af kontrol, og som ikke tager hensyn til den naturlige "data drift", der kan forekomme i flowcytometri. Den ekstra kapacitet billeddannelse hvert enkelt mål hændelse under erhvervelse, giver mulighed for en forbedret gating af enkelt (kun Dio repræsenterer de levende målceller) og dobbelt-farvet population (DIO + PI farves, der repræsenterer de døde målceller).
Endvidere blev arbejdsgangen præsenteres her optimeret til at tage hensyn til knapheden på NK-celler i fuldblod og behovet for nøjagtige resultater. Mens traditionelle NK celle cytotoksicitetsassays udforske den lytiske aktivitet på flere T: E ratio, det er upraktisk for et par grunde: 1) mængden af tilgængelige NK-celler fra fuldblod er begrænset og yderst variable og 2) mængden af target-celler, der er nødvendige for analysen skal være stor nok til at give mulighed for forholdsvis hurtig erhvervelse af data. Flere tests i forskellige forhold (ikke vist her) viste, at en 1: 5 T: E-forhold, som omsætter i 4 x 10 4 T / 2 x 10 5 E giver en optimal balance, og giver mulighed for stor reproducerbarhed. Baseret på gentagne assays med prøver fra forskellige individer (ikke vist her), dette forhold tilvejebringer også en forventet cytotoksisk aktivitet på 50-70% i normale prøver, som giver en betydelig over og under vinduet for at måle effekten af interventioner.
NK celletal var magen til det, der blev fundet i andre værker 11, 12, 13, og in-line med den accepterede frekvensområde af NK-celler på blod 14. Imidlertid er fordelen ved dette ny arbejdsgang demonstreret i figur 3B, hvor vi registrerered en betydelig stigning i NK-cellers cytotoksicitet efter 24 timer sammenlignet med præ-workout trods en NK celletal, der var i gennemsnit (omend ikke væsentligt) lavere på det samme tidspunkt. Dette resultat adskiller sig fra andre offentliggjorte undersøgelser, hvor cytotoksiske niveauer var hovedsagelig identiske (eller endnu lavere) til de pre-workout niveauer. Den foreslår, at i stedet for at være deprimeret over en lang tidsperiode efter motion, kan NK-cellecytotoksicitet kunne "rebound" til endnu højere niveauer efter så lidt som 21 timer efter træning. Denne observation ved hjælp af en roman metode med rene, sunde NK-celler, hvis bekræftet i opfølgende undersøgelser, har potentiale til at ændre den nuværende perspektiv, at tung anstrengelse er immunosuppressiv. Når der opnås NK-celler under anvendelse af Ficoll gradienter eller flow-cytometri-baserede sortering, den resulterende population er enten blandet med andre celletyper, indeholde flere beskadigede NK-celler og / eller NK-celler med modificerede respons. Disse konsekvenser er kan forventes arrangemenEpoq længden, hårdhed og / eller er upræcise af de førnævnte metoder. Fjernelse af disse spørgsmål, og opholder sig tæt på fysiologiske betingelser til enhver tid, vil føre til eksperimentelle resultater mere repræsentative for de NK-celler in vivo adfærd.
For at opsummere, beskrev vi en integreret workflow, der giver mulighed for en hurtig, nøjagtig isolering og detektion af NK-celle cytotoksicitet fra små humane blodprøver, der undgår nogle af de begrænsninger, der er forbundet med andre metoder. Mens menneskeblod var i fokus i dette arbejde, er det bemærkelsesværdigt, at denne metode kan anvendes på dyr blodprøver. Denne arbejdsproces er ekstremt reproducerbar og kan detektere små variationer, hvilket er særligt værdifuldt for motion studier, hvor deltagerantal er begrænsede og serielle blod foranstaltninger erhvervet. Som understreget i de repræsentative resultater, denne forbedrede metode har potentiale til at udfordre og forbedre den nuværende viden i motion immunologi,og andre områder relateret til NK immuno-overvågning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , Garland Science. (2001).
