Abstract
NK hücre sitotoksisite NK hücre fonksiyonu üzerindeki dış müdahale etkisini belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir ölçüdür. Ancak, bu testin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliği için kullanıcının hatalar nedeniyle ya da deneysel manipülasyon NK hücrelerinin duyarlılığının ya kararsız olarak kabul edilebilir. Bu sorunları ortadan kaldırmak için, en az bunları azaltan bir iş akışı kurulmuş ve sunulmuştur. Biz kaçak arasında, çeşitli zaman noktalarında kan örnekleri alındı, göstermek için (n = 4) egzersiz yoğun butik tabi ki. İlk olarak, NK hücreleri aynı anda tespit edilir ve doğrudan tam kandan ve gibi kısa bir sürede mililitre gelen CD56 etiketleme ve manyetik bazlı sıralama ile izole edilmiştir. kriteri NK hücreleri herhangi bir ayıraç veya kapatma antikorların kaldırılır. Bunlar kan mililitre başına doğru bir NK hücre sayısı tespit etmek için sayılabilir. İkinci olarak, kriteri NK hücrelerinin (efektör hücreleri ya da E) 3,3-Diotade karıştırılabilirHer olayın görselleştirme ve herhangi bir yanlış pozitif ortadan kaldırılması için izin veren bir görüntüleme akış Sitometreyi kullanarak E oranı ve analiz: 5 T: cyloxacarbocyanine perklorat (DIO) bir tahlil optimal 1 de K562 hücreleri (hedef hücreleri ya da T) etiketli ya da (örneğin çiftler veya efektör hücreleri gibi) yanlış negatif. Bu iş akışı yaklaşık 4 saat içinde tamamlandı ve hatta insan numuneleri ile çalışan çok kararlı sonuçlar sağlar edilebilir. Kullanılabilir olduğunda, araştırma ekipleri, insan deneklerde birkaç deneysel müdahaleleri test ve veri bütünlüğünü tehlikeye atmadan birkaç zaman noktaları arasında ölçümleri karşılaştırabilirsiniz.
Introduction
Doğal öldürücü hücreler doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir unsurdur. Çok düzenlenir olsa da, kabul ve hücre-hücre temas yoluyla önceki aktivasyonu 1 olmaksızın, anormal hücreleri ortadan kaldırmak için yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, bu enfeksiyonlara karşı savunma hızlı bir çizgi oluşturur. Özellikle yoğun egzersiz, geçici bağışıklık sistemini 2, 3, 4, 5 bastırmak için gösterilmiştir. NK hücreleri etkili bir şekilde hastalığa karşı duyarlılığın arttırılmasına bir pencere oluşturma bu etki, 4, 6, 7 için özellikle müsaittir. Bu nedenle, müdahalelerin çalışma öncesinde, sırasında veya NK hücre fonksiyonu üzerindeki etkisini azaltma amacı ile yoğun egzersizden sonra sporcular sonrası yarışmalar refahı için özellikle ilginçtir.
8 seyrek 1); 2) NK hücreleri strese karşı çok hassastır ve deney sırasında canlı ve sabit kalması fizyolojik koşullar sürekli maruz güveniyor; ve 3) standart tahliller gibi Ficoll geçişlerini 9 olarak, NK hücre sitotoksisitesini belirlemek ve analizleri 10 serbest bırakmak için, güvenilmez ve tutarsız. İnsan örneklerin doğal değişkenliği sadece bu konuları bileşik. müdahaleler sırasında toplanan taze insan örnekleri, en azından bir hayvan örnekleri veya ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına kıyasla, temin oldukça düzenlenmiş ve zordur. Bu deneyler tekrarlamak ya da istatistiksel olarak anlamlı eşiklere ulaşması çalışma kohort katılımcı eklemek için fırsat azaltır. Topluca, bu sorunlar fo izin veren bir aerodinamik protokolü ihtiyacını destekR hem de yüksek verimlilik ve insan örnekleri NK hücre litik faaliyetinin yüksek güvenilirlik analizi.
Biz, tespit yabancı etkenlere maruz kalmasını asgariye düşürür insan tam kandan izole ve test NK hücreleri için gerekli süreyi kısaltır bir iş akışı kurdu. azalırsa veya NK hücre sitotoksik artışların saptanmasına olanak tanınması için E oranı: Yöntem iki sensör, manyetik-bazlı hücre sıralayıcı ve sitometresi bir görüntüleme akışı ve bir deney özgü optimize edilmiş T kullanımı optimize eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm kan toplama prosedürleri Appalachian State University (ASU) Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yapılmıştır.
1. Tam Kan Toplama
- sertifikalı flebotomist Dünya Sağlık Örgütü kurallarına göre kanımı var.
- Di-Potasyum Etilendiamintetraasetik asit içeren bir 4 ml kan toplama tüpü (K 2 EDTA) içine kan çizin. üreticinin talimatlarına göre kan toplama tüpü ters çevirin. ayrılık kadar tezgah üstü rocker oda sıcaklığında kan toplama tüpü bulundurun.
DIO-etiketli hedef hücreler, 2. hazırlanması
- K562 hücrelerinin büyümeye Tam Iscove Modifiye Dulbecco Ortam hücrelerinin sağlık sağlamak için tahlil önce birkaç hafta,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş (IMDM). concentrat ayarlayın3 x 10 5 hücre hücrelerin iyon / ml her gün hücre tamamlanmasıyla sayısı ve hücrelerin daha sonra geçit. her 2 ila 3 gün tam bir medya bir değişiklik yapın.
- 1 hemasitometre: Analiz gününde, bir 1 kullanarak bir hücre sayımı yapar.
- K562 şişeden 10 uL çıkarın ve 1,5 ml tüp içine yerleştirin.
- 1 seyreltme faktörü için aynı 1.5 ml tüp içine tripan mavi boya 10 mcL ekleyin: 1.
- Yavaşça fiske tüp K562 hücreleri karıştırmak ve mavi boya tripan için.
- K562 hücre-tripan mavi boya, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübasyona izin verin.
- tüpten boyanmış K562 hücrelerinin 15 mcL çıkarın.
- hücre sayımı için hemasitometre üzerine Pipet.
- dört köşe meydanlarda hücrelerin yanı sıra beş kareler toplam orta kare güvenin.
- denklemi kullanılarak hücre sayısı hesaplanır:
Toplam hücre / ml = Toplam hücreler sayıldı X (seyreltme faktörü / kareler sayısı) x 10,000 / ml
- Boyanmamış K562 hedef hücrelere, 10 x 10 6 K562 hücrelerinin toplam 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda bir 15 ml tüp K562 hedef hücrelere 10 ml. Kullanıma hazır olana kadar,% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör içine yerleştirin.
- K562, bir 15 ml tüp hücrelerini hedef DIO lekeli K562 hedef hücrelere, 10 x 10 6 K562 hücrelerinin toplam 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda 10 ml.
- DIO boyama ve yavaşça girdap için belirlenen 15 ml tüp içinde hücre süspansiyonu, mL başına 1 uL DIO hücre etiketleme solüsyonu ekleyin. Örneğin, 1 x 10 6 hücre / ml bir hacimde 10 x 10 6 K562 hücre / ml DIO hücre işaretleme çözeltisinin 10 uL ekleyin.
- 15 ml'lik bir tüp içinde% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 20 dakika boyunca inkübe K562-dio çözeltisi.
- Takip etkuluçka ing 15 ml tüp ihtiva eden K562-dio çözeltisine oda sıcaklığında fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) 3 ilave edin.
- Oda sıcaklığında 135 x g'de 10 dakika süre ile santrifüjlenir.
- Dikkatle 1.000 ul hacim ayarlanabilir pipet yardımıyla hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak.
- Hücre pelet içeren 15 ml tüp taze IMDM 10 ml ekleyin.
- Yavaşça vorteks tüp hücreleri tekrar süspansiyon.
- Tekrarlayın 2.7 2.10 iki kez daha yineleyin.
- Kullanıma hazır olana kadar,% 5 CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde mağazası hücreleri.
Not: Hücreler kadar, 24 saat boyunca kuluçka makinesi içinde saklanabilir ancak aynı gün kullanmak tercih edilir.
Kontroller 3. hazırlanması
- Ayrı ve uygun şekilde etiketlenmiş 1.5 ml tüpler içine aşağıdaki aktarın:
- Taze IMDM 500 uL 1.5 mL tüp etiketli "Çift Pozitif" olarak K562 hücreleri Dio-etiketli yeniden süspanse içeren ekle.
- Taze IMDM 500 uL ekleyin "sadece dio" içine Dio-etiketli K562 hücreleri yeniden süspanse içeren 1.5 mL tüp etiketli.
- içine yeniden süspanse etiketsiz K562 hücreleri içeren taze IMDM 500 uL ekleyin "Propidium iyodür (PI) Sadece" 1.5 mL tüp etiketli.
- 5 dakika için 55 ° C su banyosu içinde çift pozitif ve PI yalnızca tüpler yerleştirin.
- 5 dakika geçtikten sonra, tüpleri kaldırmak ve% 70 etanol ile silin.
- Çift Pozitif için PI ve PI sadece 1.5 mL tüpler 10 L ekleyin.
- 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde üç K562 hedef hücre kontrolleri yerleştirin.
- 30 dakika inkübasyon 163 x g'de 2 dakika süre ile santrifüj üç K562 hedef hücre kontrolleri geçtikten sonra.
- Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak.
- Taze IMDM hücre kültür ortamının 20 uL, her kontrol tekrar süspansiyon ve en az% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör terkOptimum dio sinyali 30 dakika.
NOT: Kontroller artık sitometresi görüntüleme akışı ile çalıştırmak üzere hazırdır.
4. NK Hücre Otomatik Ayırma
- Hücre ayırıcının açma ve start-up döngüsü bitirmek için izin verir.
- Tüm sıvı şişeleri aydınlatmaları, yeşil ve atık şişesi boş olduğunu olduğundan emin olun.
- Bir oda sıcaklığı 15 ml tüp raf edinin.
NOT: Seçim örnek hacimleri dayalıdır. Örneğin, bir birim için az 3 mi, 15 ml tüp raf kullanımı ve hacim en fazla 3 mi, 50 ml tüp raf kullanımı. - Etiket örnek tüpleri buna göre (numune / katılımcı başına tekrarlayın): Katılımcı 1 Tam Kan Örneği; Katılımcı 1 Olumsuz kesir; Katılımcı 1 Pozitif kesir.
- Yavaşça "bütün bir kan örneğinden" 15 ml tüp içine Aşama 1.2'den tam kan 1.5 mL pipetle.
- Adım 4.5 den uygun şekilde etiketlenmiş 15 ml "Tam Kan Örneği" tüp yerleştirin ve 15 mL "Negatif Kesir" etiketli veTüp rafa Adım 4,4 "Pozitif Fraksiyonu" borular. Satır (R1) A: thefollowing örnek raf set-up kullanın Tam Kan Örneği, Satır (R2) B: Negatif, etiketsiz fraksiyon, Satır (R4) C: Pozitif, manyetik olarak etiketlenmiş fraksiyonu.
- autolabeling için MiniSampler üzerine ayırıcı raf yerleştirin.
- menüsünden "Reaktif" i seçin ve flakon ayırıcı rafa yerleştirilir konumunu vurgulamak.
- 2B kod okuyucu etkinleştirmek için "Reaktifini oku" seçiniz.
- kod okuyucu kapağının 0,5-2,5 cm arasında 2B kod okuyucu önünde uygun reaktif flakon yerleştirin.
Not: Örneğin, NK hücre ayrılması için gerekli olan reaktif CD56 olup. - uygun okuma 2B kod okuyucu önünde bir açı ile reaktif, tüp tutun.
- Uygun ayırıcı raf pozisyona reaktif flakon yerleştirin.
- Ekranda Ayırma sekmesi altında istenilen pozisyonları vurgulayın.
- Etiketleme alt menüsünden, bir au atamaktolabeling programı.
- pozisyonları 1, 2, 3, ve 4 rafa Hücre Ayırma Reaktif CD56 mikro kullanarak atayın.
- "Posselwb" ayrılık programını seçin.
- "Durulama" yıkama programını seçin.
- Sayısal tuş takımını kullanarak "Cilt" alt menüsünde 1500 uL numune hacmi yerleştirin.
- tuş takımı üzerindeki "Enter" seçeneğini seçiniz.
- Hücre ayrımı başlatmak için "Çalıştır" ı seçin.
- Bu yeterli tampon tüm örneklerin işlenmesi için kullanılabilir onaylamak için "Tamam" ı seçin.
5. NK Hücre Sayımı ardından Hücre Ayırma
- Hemen hücre ayırıcı ile hücre ayırma aşağıdaki pozitif fraksiyonu almak. oda sıcaklığında bekletin. Bu fraksiyon istenen saf NK hücre popülasyonu içerir.
- Her numune için, Adım 2.2 göre hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı gerçekleştirmek.
- hesaplamalar sonrasında hücre sayımı kaydedin.
6. Sitotoksisite Tahlili Numune Hazırlama
- Hazırlayın ve buna göre her bir numune / katılımcı için 1.5 ml tüpler etiket.
- Pipet Her tüpe NK hücreleri ve Dio-etiketli K562 hücrelerinin oranını istenen.
Not: Örneğin, K562 hedef hücrelere ve NK efektör hücrelerin arzu edilen oran 1: 5 arasındadır. - 135 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
- Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak.
- Süspanse NK-dio interlökin-2 (IL-2) ve 2-merkaptoetanol (2-Me) (kısmi NK hücre kültür ortamı olmadan) NK hücre ortamının 500 uL K562 hücre karışımı etiketli.
Not: tam olmayan NK hücre kültür ortamı, L-glutamin, olan ribonükleosidler ve deoksiribonükleosidler olmaksızın sodyum bikarbonat ile Essential Medium Eagle sınırı. - Her tüpe PI 5 mcL ekleyin.
- 163 x g'de 2 dakika süre ile santrifüje.
- 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- 2 saat inkübasyondan sonra, Santrifüj163 x g'de 2 dakika süre ile GE.
- Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak.
- 25 uL eksik NK hücre kültür ortamında yeniden süspanse hücreleri.
Spontan 7. Hazırlama ( "S") Örnek
- DIO-etiketli K562 hücrelerinin pipetle 500 ul 1.5 ml tüp içine (1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda).
- Her tüpe PI 10 mcL ekleyin.
- 163 x g'de 2 dakika süre ile santrifüj tüpü.
- 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- 2 saat kuluçkadan, 163 x g'de 2 dakika süre ile santrifüj sonrasında.
- Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak.
- 25 ul tam olmayan alfa-Minimum Esansiyel Medium (α-MEM) hücre kültür ortamı içinde yeniden süspanse hücreleri.
Görüntüleme Akış Sitometre 8. Veri Toplama
- enstrüman açmak için akış sitometresi görüntüleme ön kapı içinde yeşil düğmeye basın.
- al açıngörüntüleme ile ilişkili l bilgisayarlar akış sitometresi.
- Yazılımın sitometresi görüntüleme akışını başlatın.
- sistemini temizlemek ve örnek hattını hazırlamak için "Başlangıç" düğmesine tıklayın.
- "Başlangıç" tamamlandıktan sonra, "Kalibrasyon" penceresini kapatmak.
- Kanal atama: sol üst tarafta, bunları atamak için her kanalda tıklayın.
- Area_M06 vs Raw Max Piksel _MC_6, Area_M02 vs Raw Max Piksel _MC_2, AspectRatio_M01 vs Area_M05 ve FieldArea_M01 vs Raw Max Piksel _MC_5: Sağ tarafta, 4 saçılım oluşturmak için scatter plot butonuna tıklayın.
- İlk "Çift Pozitif" kontrolü kullanarak örnekleri analiz başlayın.
- tıklayın "Load".
- Numune Yükleyicisi'a 3.9 Adımlar 3,4 "Çift Pozitif" örnek ile 1.5 ml tüp yerleştirin.
- "Büyütme" sekmesi altında 40X hedefi seçin.
- 405 mW açın ve642 mW lazerler.
- "Aydınlık" bir kanal açın.
- tıklayın "Select Intensity."
- Dedektör aşırı değil yani "Çift Pozitif" kontrol numunesi dayanarak, 405 mW lazer için istenen yoğunluğunu belirlemek.
Not: Örneğin, bu deney için en uygun yoğunluk 11 mW ayarlandı.
- İstenilen set-up sağlandıktan sonra veri elde.
- "Toplama Dosya" sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girin. veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin.
- "Toplama" yanında kazanmak için hücrelerin sayısını girin. Genellikle bu sayı 10.000'e 1,000 arasında değişmektedir.
- Tıklayın "Edinme."
NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı elde edilir sonra, veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir.
- Satın alma tamamlandıktan sonra, bir sonraki kontrol örneği yükleyin - Dio sadece kontrol.
- tıklayın "Load".
- Numune Yükleyicisi'a "Dio sadece" örnek ile 1.5 ml tüp yerleştirin.
- Seçilen "Büyütme" sekmesi altında 40X objektif bırakın.
- 405 mW lazer açık bırakın.
- 642 mW lazer ve "aydınlık" kanalı kapatın.
NOT: Şimdi istenen set-up elde edildiğini, veri elde edilebilir. - "Toplama Dosya" sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girmek ve veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. yanında elde etmek için hücrelerin sayısını girin "toplayın.". Genellikle bu sayı 1000'dir.
- Tıklayın "Edinme."
NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı kazanılır sonra veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir.
- "PI sadece" kontrol numunesi için yineleyin 8.10. deney örnekleri şimdi tahsil edilecek hazırız.
- remaini Kolu"Kendiliğinden 'S' Örnekleri" şöyle de dahil olmak üzere, deneysel örnekleri ng:
- Seçilen "Büyütme" sekmesi altında 40X objektif bırakın.
- 405 mW ve 642 mW lazerler AÇIN.
- "Aydınlık" kanal AÇIN.
- tıklayın "Set Yoğunluk."
- "Toplama Dosya" sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girmek ve veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. Özel bir dosya adı metin girin.
- yanında elde etmek için hücrelerin sayısını girin "toplayın."
- "Edinme" butonuna tıklayın.
NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı kazanılır sonra veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir.
- tüm deneysel numuneler için yineleyin 8.12.
- tüm deneysel veriler ve dosyalar toplanan edildikten sonra, sistem sterilize etmek "kapatma" düğmesine tıklayın.
9. Imaging Akış Sitometre Numune Analizi
- analiz yazılım uygulaması sitometresi görüntüleme akışını açın.
- "File" altında, deneysel .RIF dosyasını açın.
- seçerek tek renk .RIF dosyaları (DIO-sadece kontrol etmek ve adım 8.10 ve 8.11 sırasında oluşturulan PI-sadece kontrol) kullanarak yeni bir matris inşa yazılımın sitometresi görüntüleme akışında Tazminat sekmesi altında "Yeni Matrix oluştur".
NOT: Yazılım tek renk dosyalarının seçimi için isteyecektir ve bir matris dosyası (.ctm dosya uzantısı) oluşturmak için bunları birleştirme, o kanal tazminat uygulamak için seçilmelidir. - Yazılımın "yapı taşları" fonksiyonunu kullanarak nokta araziler oluşturun.
- Bir nokta-arsa kapısına (frekansı vs BrightFieldGradient_RMS) odaklı hücreler oluşturun. Kapıyı "Focus" (Şekil 1A) arayın.
- "Focus" kapıyı kullanarak, g Parlak Alan Aspect Ratio vs Aydınlık Alan Alanı'nın bir nokta arsa oluşturmak tekli hücrelere yedik. Kapı "Single" (Şekil 1B) arayın.
- "Tek" kapısı kullanarak, Intensity_MC_Ch5 vs Intensity_MC_Ch02 bir nokta arsa oluşturun. Belirlemek ve kapı DIO-pozitif sadece hücreleri (hedefler, canlı) ve PI-Dio (ölü hedefler) çift pozitif hücreler (Şekil 1C) Bu arsa kullanın.
NOT: Tüm araziler adımlar 9.4.1, 9.4.2 açıklanan ve 9.4.3 yazılımı "yapı taşları" fonksiyonunu kullanarak oluşturulabilir.
- Her kapının hücre sayıları erişmek için nokta arsa istatistikleri fonksiyonu tıklayın.
- Aşağıdaki formülü kullanarak spontan numunede ölü hedefler ve deney örneklerinin yüzdesini hesaplayın:
numunedeki% ölü hedefler = (#dead hedefleri x 100) / (# hedefler + #dead hedefler canlı) - Aşağıdaki formül kullanılarak sitotoksisite hesaplayın:
% Sitotoksisite = [(Deneysel ölü Spontan ölü) / (100-Spontan ölü)] x100
Şekil 1: sitotoksik aktivite analizi için Temsilcisi histogram, saçılım grafikleri ve görüntüleri. (A) odak hücre analizi. (B) tek hücre analizi. (C), hedef hücre boyama analizi. Tüm tespitler her olaya bağlı görüntü kullanılarak yapılır. Bu sadece grafikler olay tıklayarak analiz yazılımı ulaşılabilir. Bir apoptotik NK hücre ve canlı bir K562 hedef gösteren (D) ikili olayın Örnek görüntüsü. Ch01'den, aydınlık. CH02, dio. Ch05 PI. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NK hücre sayısı tayini
Tam kan NK hücre sayımı ağır çalışan etkisi Şekil 2'de tarif edilen egzersiz protokolü kullanılarak ölçülmüştür. Kan örnekleri ilk kan çekildikten sonra nihayet 24 ve 48 saat 1.5 saat egzersiz sonrası, egzersizden hemen sonra, egzersiz öncesi çekilmiş ve bulundu. Tam kan mililitrede NK hücrelerinin konsantrasyonu her koşucu (Şekil 3A) ve her bir zaman noktası için ortalama (Şekil 3B) üzerinde ölçüldü.
Bizim sonuçlarımız (Şekil 3A), 1 2 ikincisi göstermek ve 4 mevcut hemen önce yavaş yavaş 24 ve 48 saat sonra normale dönüyor, keskin bir azalma ardından egzersiz sonrası NK hücre sayısı hafif bir artış ile benzer bir model. Bu eğilim özellikle koşucu grubu için NK hücre ortalamaları çizerek görünür, ancak anlamlı bir fark olduegzersiz öncesi seviyeleri tespit edildi. Runner 3 önce yavaşça 24 ve 48 saat sonra normale dönüyor, keskin egzersiz ve egzersiz sonrası 1.5 saat sonra azaldı başlangıçta çok yüksek sayımı, sundu. Ortalama olarak, NK hücre sayımı (Şekil 3B) (anlamlı olmayan olsa) egzersiz sonrası 1.5 saat azalmış fakat 24 saat sonra geri normale yakın düzeylere oldu.
NK hücre sitotoksisite belirlenmesi
NK hücre sayımı hesaplandıktan sonra, NK hücreleri, hemen protokol bölüm 6'da tarif edildiği gibi sitotoksik aktivitesini belirlemek için kurulmuştur. Sonuçlar Şekil 4B ortalama NK sitotoksisite tasvir, her bir atlet Şekil 4A'da sunulmaktadır. Bizim sonuçlarımız ortalama NK sitotoksisite egzersiz ve egzersiz sonrası 1.5 saat (non-önemli ölçüde de olsa) sonra biraz azaldı, ancak önemli ölçüde 24 saat sonra arttığını göstermektedir. NK sitotoksisite öncesi ile karşılaştırıldığında yüksek kaldı(Nedeniyle bu pilot projede katılımcıların az sayıda kısmen) olmayan ölçüde de olsa -Egzersiz seviyeleri.
Şekil 2: Egzersiz protokolü. Kan (kırmızı oklar) n = 4 koşucular uygulandı çekiyor.
Şekil 3: NK hücrelerinin öncesi egzersiz sonrası egzersiz, 1.5 saat ve 21 saat sonrası egzersiz sayar. (A), NK hücreleri, her bir koşucu için tam kan sayımı mililitre başına. (B) ortalama NK hücre tam kan mililitrede sayılır. N = 4; Ölçek çubukları = standart hata.
Şekil 4:NK hücreleri sitotoksisite Antrenman öncesi, egzersiz sonrası, 1.5 saat ve 21 saat sonrası egzersiz. Her bir koşucu için (ölü hedef hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir) (A), NK hücre sitotoksisite. (B) (ölü hedef hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir), ortalama NK hücre sitotoksisite. N = 4; Ölçek çubukları = standart hata; *: P <0.05; **: P <0.005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada tarif edilen yöntem ile doğrudan (bu özel durumda, uzun süreli egzersiz) uyaranlara yanıt olarak, bir bireyin NK hücrelerinin spesifik aktivitesini ölçer. Tipik haliyle, NK hücreleri belirteçlerin bir kombinasyonu kullanılarak sıralama yoğunluk gradyanları ya da hücre kullanılarak bir kanından izole edilmektedir. bunlar, zaman alıcı olan birden çok manipülasyonlar içerir ve ağır kullanım bağlıdır: Bu yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, pek çok sakıncaları vardır. Bunun bir sonucu olarak, aşırı stres, hatta aynı deneyde deney için deney yükselmiştir değişkenlik neden olabilir izole edilmiş NK hücreleri, yerleştirilir. Bu yazıda manyetik tabanlı izolasyon kullanan bir protokol nitelendirdi. kan ya da NK hücre manipülasyonu en aza indirerek bu bireyin tam kan NK hücrelerinin sayısının yüksek hızlı ve güvenilir bir sıralamayı sağlar.
Bu yöntem, numuneler seyrek insan çalışmaları için uygundur, ancakÇok fazla numuneler bir araya işlenmesi gereken zaman Flipside yöntem oldukça zor hale gelir. Gerçekten de, sitotoksik deneyi için alım penceresi Deneyimlerimize göre, en fazla bir seferde 5 numune tercüme inkübasyon sonunda, tipik olarak 30 dakika içinde olmalıdır. Birçok örnekleri işlenecek ise, akış sitometri edinimi için yeterli zamanı vermek için şaşırtıcı bir program kurmak için kritik öneme sahiptir. Bu yöntemin diğer bir sakıncası, oldukça yüksektir ve kan fazla miktar daha yüksek NK verimi için işlemden geçirilmekte ise hızlı bir şekilde tüketilebilir reaktiflerin maliyeti olabilir. Ancak, bu maliyetler kaydedilen zamanın önemli miktarda göre dengeli olduğuna inanıyoruz.
Bu protokol kritik adımlar değişiklikler en açık olanlardır. Oda sıcaklığında kan korumak ve NK hücresi stresi önlemek için çizim bir saat içinde işlemek için çok önemlidir. İzolasyondan sonra, hücre sayısı, son derece önemlidirSonuç doğruluğu, yani sayım yöntemi sabit olmalıdır: tripan mavisi tahlil için, örneğin birden kareler hemasitometre sayılır emin olun, ve kullanıcı veya laboratuar aynı tanımlama parametreleri kullanarak emin olun. Burada sunulan protokol bir T kan ve test NK hücre sitotoksisite 1.5 mL kullanır: 1 E oranı: 5, ancak bu parametreler optimize edilebilir istenen tahlil ve kan mevcut miktarı bağlı olarak: daha az kan o varsa 4 ya da 1: 3 yine de makul bir edinim süresine sahip düşük oranları 1 gibi kullanmak mümkündür. Bizim tecrübelerimize göre daha düşük oranlar uygun bir sitotoksik aktiviteye izin için yeterli olabilir. Ayrıca için örnek varyasyonu, NK hücresi sayısı beklenenden çok daha düşük olur; E oranı, bir deney boyunca: karşılık olarak, aynı T korumak için reaksiyon tüpleri içindeki hedef hücrelerin miktarını azaltmak için gereklidir. Sonuç analizi sırasında, en kritik adım için gerekli olduğunca fazla zaman geçirmek içinİyi bir matrisi elde. Büyük bakım protokolü Adım 3'te açıklanan kontroller hazırlamak için alınır Bu sadece elde edilebilir. Aşama 9'da tarif edildiği gibi girişler oluşturulmuştur sonra, dosya birlikte Toplu ve çok az bir değişiklik ile seri olarak analiz edilebilir. Şüphe, kullanıcı her zaman herhangi bir olay tıklayarak resim galerisi bakmalıdır eğer tüm uygun olayları doğru kapısı dahil olduğunu kontrol etmek için, (Şekil 1C görülen) bir grafik üzerinde çizilen.
Şekil 2A temsilcisi sonuçları 4 takım 3 koşucu benzer bir model sundu gösterdi. 4. koşucunun desen muhtemelen bu bireye özgü ve hatalı ölçü temsil etmiyor. Bu birey için NK hücre sayısı tam insan kanı egzersiz öncesi hem de 48 saat sonrası egzersiz kabul aralığın üst sonunda oldu. Bu çalışmadaki NK c açıklanan yöntemin güçlü yönlerinden birini gösterirarşın doğru elde edilebilir. Buna ek olarak, tek bir etiketleme adımından yerli hücreleri elde etmek yeteneği, NK hücreleri minimal stres ve değişiklikler için izin verir. NK hücre sitotoksisite, fizyolojik stres koşulları altında ölçülmüştür olduğu durumlarda özellikle önemlidir.
izolasyonundan sonra, NK hücre sitotoksisite tipik olarak akış sitometrisi veya radyoaktif salım deneyi (örneğin, krom deneyi) ile tespit edilir. salım deneyleri altın standart olarak kabul edilirken, son derece pahalı olan radyoaktif izotoplar ve ilgili ekipmanların kullanımına dayanır. Buna ek olarak, radyoaktif maddelerin kullanımı ve bertarafı için düzenlemeler zaman verimlilik ve hassasiyet gerektiren deneylere karmaşıklığı ekleyin. yaklaşımı sitometri bir akış kullanılması mantıklı ama tipik önlemler florokrom tazminat ve yolluk lazer ayarları dahil takip ve edilmelidir. Hücrelerin 2 farklı tipte sa olduğunda bu özellikle doğruduryapıldığı Örnek, bu sitotoksik deneyleri için olduğu gibi. Ancak, bizim durumumuzda bir görüntüleme akışının kullanılması sitometresi bir görüntü her olay için yakalanan sağlar ve boyut oranı parametre tek hücrelerden çiftlerin ayrılmasını sağlar. sitotoksik tahlil efektör ve hedef arasındaki fiziksel temas dayandığı Bu, kritik bir noktadır; çok sık hücrelerin bu 2 tip hala sonuçlarına yanlış çift pozitif tanıtan, akış ölçümü sırasında birlikte olacak. Bu noktada, bir (boyama, PI pozitif), NK hücreleri tarafından oluşturulan bir dublet göstermektedir, Şekil 1D, gösterilmiş ve (canlı, DIO pozitif PI negatif) K562 hücreleri. geleneksel akış sitometri, bu olay K562 hücre ölümü sayısına eklenir ama aslında bir yalancı pozitiftir. Çıkarma veriler gerçekten de sürekli yapılması ve deneme (bu durumda, "en-boy oranı" parametresi) için deneyden çok sıkı parametreleri kullanarak eğer ancak, değil, sorunlu olabilir. Buna karşılık,Elde edilen veriler çok daha istikrarlı olacaktır. Ayrıca, tüm olayları görselleştirme renk parametrelere dayalı her olayın, geleneksel hesaba oluşabilir doğal "veri kayması" yapmayız kontrolleri kullanarak kurulmuş ve bu bükülmez kapıları dayanarak olmadan (ve sayım) hassas gating sağlar akım sitometri. edinimi sırasında her hedef etkinliği görüntüleme katma yeteneği, tek geliştirilmiş bir gating sağlar (Dio, sadece canlı hedef hücreleri temsil eden) ve çift lekeli nüfus (DIO + PI ölü hedef hücrelerini temsil lekeli).
Buna ek olarak, burada sunulan iş akışı dikkate tam kanda NK hücrelerinin azlığı ve doğru sonuçlar için ihtiyaç almak için optimize edilmiştir. Geleneksel NK hücre sitotoksisite testleri birkaç T'de litik aktivite keşfetmek ise: 1) tam kan edinilebilir NK hücrelerinin miktarı sınırlı ve son derece v: E oranları, bu nedenlerle bir çift için kullanışsız olduğuAnaliz için gereken hedef hücrelerin ariable ve 2) bir miktar veri oldukça hızlı alımı için izin vermek için yeterince büyük olmalıdır. 5 T: 4 x 10 4 T / 2 x 10 5 E çevirmek E oranı, optimum bir denge verir ve büyük tekrarlanabilirlik sağlar değişik oranlarda (burada gösterilen) birkaç testler 1 olduğunu gösterdi. çeşitli bireyler (burada gösterilen), bu oran aynı zamanda müdahalelerin etkisini ölçmek için üzerinde ve pencerenin altında önemli bir sunan normal örneklem içinde% 50-70 beklenen sitotoksik aktivitesini sağlar örneklerle tekrarlanan deneylere dayalı.
NK hücre sayısı diğer çalışmalar, 11, 12, 13 tespit edilmiştir için benzer olduğunu ve in-line kan 14 NK hücrelerinin frekansının kabul edilen aralığı. Ancak, bu yeni iş akışının avantajı tespit Şekil 3B, gösterilmiştirEd aynı zaman noktasında alt (anlamlı olmayan olsa) ortalama bir NK hücre sayısı rağmen, önceden çalışma seviyelerine göre, 24 saat sonra NK hücre sitotoksisite önemli bir artış. Bu sonuç sitotoksik seviyeleri Antrenman öncesi seviyelere çoğunlukla aynı (hatta daha düşük) olduğu, diğer yayınlanmış çalışmalarda farklıdır. Bunun yerine zaman sonrası egzersiz uzun süre depresyonda olma, NK hücre sitotoksisite "geri tepme" kadar az 21 h sonrası egzersiz sonrası daha yüksek seviyelere mümkün olabileceğini düşündürmektedir. izlem çalışmalarında teyit eğer saf, sağlıklı NK hücreleri ile yeni bir metodoloji kullanarak Bu gözlem, ağır efor immünosupresif olduğunu anki bakış açısını değiştirme potansiyeline sahiptir. NK hücreleri, Ficoll gradyanları veya akış sitometri bazlı sıralama ile elde edilir, ortaya çıkan popülasyon, diğer hücre tipleri ile karışık olarak bir modifiye edilmiş yanıt çok zarar NK hücreleri ve / veya NK hücreleri içermektedir. Bu sonuçlar consi beklenemezYukarıda bahsedilen yöntemlerin uzunluğu, sertliğini ve / veya belirsizlik dering. Bu sorunları Çıkarma ve her zaman fizyolojik koşullara yakın kalmak, deneysel sonuçlara in vivo davranış NK hücrelerinin daha fazla temsilcisine yol açacaktır.
Özetlemek gerekirse, biz diğer yöntemler ile ilişkili bazı sınırlamaları önler küçük insan kan örneklerinden NK hücre sitotoksisite hızlı, kesin bir izolasyon ve tespiti için izin veren entegre bir iş akışı nitelendirdi. insan kanı Bu araştırmalara konu iken, yöntem, hayvan, kan örnekleri uygulanabilir dikkat çekicidir. Bu iş akışı son derece tekrarlanabilir ve katılımcı sayıları elde edilen sınırlı ve seri kan tedbirler egzersiz çalışmaları için özellikle değerlidir küçük varyasyonlar, algılayabilir. temsilcisi sonuçları altını gibi, bu geliştirilmiş bir yöntem meydan ve egzersiz immünoloji güncel bilgilerini geliştirmek için bir potansiyele sahiptir,ve diğer alanlar NK immün gözetim ile ilgili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , Garland Science. (2001).
