Summary
Cilium העיקרי הוא גורם קריטי ב התפשטות תאים ובתאים עצבית, בידול עצבי, ואת תפקוד עצבי בוגרת. כאן, אנו מתארים שיטה ללמוד ciliogenesis וסחר איתות חלבונים כדי ריסים בתאי גזע / ובתאים עצביים נוירונים בדיל באמצעות תרבויות neurosphere עיקריות.
Introduction
Cilium העיקרי הוא תא התת-תאי דינמי המבוסס microtubule שמתפקד אנטנה חושית בתיאום מסלולי איתות הסלולר, כולל סוניק הקיפוד (ששש) מסלול במהלך ההתפתחות העצבית עובריים 1, 2, ו איתות התת-תאי ממודרת פונקציה 3 העצבית מבוגר, 4 . איתות רכיבים של מסלולים אלה, כגון קולטן ששש טלוא 5; מסלול מפעיל smoothened (SMO) 6; ו Gpr161 7, גידול G יתום חלבון בשילוב קולטן (GPCR) כי באופן שלילי מסדיר את מסלול ששש, למקם את הריסים באופן דינמי. GPCRs המרובה דווח למקם את הריסים בנוירונים במוח 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. פגמי ריסי מסלולי איתות שנוצר ריסים להשפיע רקמות מרובות נקראים ביחד כמו ciliopathies 17, 18, 19. הספקטרום המחלה ciliopathy קרובות כולל ליקויים נוירו-התפתחותיות, כגון הפרעות craniofacial 20, 21, 22. בנוסף, cilia העיקרי בנוירונים ההיפותלמוס לווסת מסלולי שובע מרכזיים, ופגמים לגרום להשמנה מרכזית 23, שיקוף השמנת ciliopathies syndromic כגון תסמונת Bardet Biedel 24. בנוסף, קולטן ונוירופפטידים איתות הריסים מסדיר centrשובע אל מסלולי 11, 14. לוקליזציה ריסי adenylyl cyclase III (ACIII) ו GPCRs כגון קולטן סומטוסטטין 3 ב נוירונים בהיפוקמפוס לגרום למומים זיהוי האובייקט הרומן וגירעונות זיכרון 25, 26 ו- Parallels חוסר שלמות ריסי 27. היבטים התפתחותיים של איתות שנוצר הריסים קשורות בטבורן הומאוסטזיס רקמות; בפרט, הריסים חשובים להתקדמות ומדולובלסטומות ששש-תת הנובעים אבות גרגיר של 28 המוחון, 29. לפיכך, cilia העיקרי ממלא תפקידים חשובים במהלך עוברית, לאחר הלידה, ואת ההתפתחות עצבית מבוגרת ותפקוד.
בתאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים באזור subventricular (SVZ) של החדר הלטרלי, אזור subgranular של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס, ואתאזור חדרית של החדר השלישי בהיפותלמוס ביונקים 30, 31, 32. NSCs הם מולטיפוטנטיים, בעלי יכולת התחדשות עצמית, והם חשובים להתפתחות המוח ורפואה רגנרטיבית 30. רוב NSCs ב SVZ הם שקטים ובעלי cilium העיקרי בודד כי, במקרים רבים, משתרע אל החדר לרוחב 33. אותות cilium העיקריים באמצעות הלוקליזציה של קולטנים שונים, להמרצת תגובה תאית במורד זרם, במיוחד ביחס ששש, TGFβ, ומסלולי טירוזין קינאז קולטן 2, 34, 35, 36. מאז cilia העיקרי להאריך לתוך החדר לרוחב, משערים כי cilia העיקרי לזהות ציטוקינים בנוזל השדרה (CSF) כדי להפעיל NSCs 37 38, 39, 40, 41. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם CSF מתקשר עם NSCs והאם cilia העיקרי מעורבים אינם ידועים. NSCs החסיד בתרבות הוא ריסים; למקם רכיבים מסלולים ששש, כגון SMO ו Gpr161 ב ריסים; והם ששישה 42 תגובה. לפיכך, NSCs יכול לשמש כמערכת מודל חשובה ללמוד את המסלול שהשישה, סחר ריסים, ומסלולי בידול עצביים. בנוסף, נוירונים נבדלים NSCs יכולים לשמש גם עבור מבחני סחר ריסים.
Neurospheres הם היוו של צבירי תאי "פנויות" הנובעים מההפצה של neural גזע / ובתאי תאים שגדלים בנוכחות גורמי גדילה ספציפיות ומשטחי nonadhesive 43, 44. Neurospheres לשמש חשובה דגמים בתרבות במבחנה ללמוד גזע עצביים / ובתאים בפיתוח נורמלי למחלה 31, 45, 46, 47. כאן, אנו מתארים assay מבוסס-neurosphere עבור culturing גזע עצביים / ובתאים ו לבידול לתוך הנוירונים / גליה. אנחנו במיוחד להדגיש את הסחר של איתות רכיבי ריסים של גזע עצבי / ובתאים נוירונים בדיל (איור 1). בניגוד נוירונים culturing העיקרי, neurospheres העיקרי הם יחסית קל תרבות, ניתנים קטעים מרובים להקפיא להפשיר מחזורים, והוא יכול לעבור התמיינות לתוך הנוירונים / גליה. חשוב לציין, קבענו כי עצבי נגזר neurosphereתאי גזע / ובתאים נוירונים בדיל הם ריסים בתרבות LOCALIZE מולקולות איתות רלוונטיות לתפקוד ריסים בתאים אלה. Neurosphere מבוסס שיטות culturing יכולות לשמש כמערכת מודל אידיאלית ללימוד סחר ciliogenesis ואת הריסים ב NSCs נוירונים בדיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ניתוק של Neurospheres ממוח העכבר למבוגרים
- להרדים עכבר מבוגר (סביב 2 חודשים) ממנת יתר של isoflurane. בדוק היטב כי העכבר הפסיק נשימה לנתח מיד לאחר מותו.
- בעזרת מספריים, לעשות חתך קו האמצע כדי לפתוח את הגולגולת. הסר את המוח.
- מניחים את המוח קר PBS בצלחת 10 ס"מ על הקרח. בצע את השיטה לנתיחה כל ההר להשיג את SVZ מן החדר לרוחב 48.
- מניחים את החדר לרוחב לתוך צינור מ"ל 1.5, להוסיף 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA ב PBS, ו דגירה הצינור במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- אחרי 15 דקות, להוסיף 500 μL של המדיום לעצור בעדינות pipet 20 - 30 פעמים עם טיפ מ"ל 1. הימנע ויוצרים בועות אוויר במהלך בפיפטה.
הערה: שלב זה הוא קריטי להישרדות התא. - לסובב את התאים ב 500 XG במשך 8 דקות. בטל supernatant, להוסיף 1 מ"ל של PBS, ו גלולה tהוא התאים על ידי pipetting 5x בעדינות עם קצה מ"ל 1.
- ספין למטה XG ב 500 במשך 8 דקות. בטל supernatant באמצעות טיפ 1 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הבסיס.
- (אופציונלי) אם פסולת הסלולר הם נצפו, עוברים התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
- ספירת תאים עם hemocytometer; באופן כללי, על 30,000 - 60,000 תאים / SVZ מתקבלים.
- פלייט התאים מן SVZ אחד לתוך צלחת 10 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיום ותרבות המל"ל על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- (אופציונלי) כדי למנוע היתוך בין תחומי 49, לשים 1000 תאים הבאר אחד של צלחת אולטרה-נמוכה מחייב 6-היטב, כי הוא מלא מראש עם 1.5 מ"ל של מדיום ותרבות המל"ל על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
הערה: לאחר 5-7 ימים, neurospheres ניתן לראות (איור 2A). תקופת culturing עשויה להיות שונה עם הגיל של עכבר או הרקע הגנטי. - להוסיף 2 מ"ל של מדיום NSC כל 3-4 ימים כדי לשמור על התרבות(לא להסיר את המדיום הקיים).
ניתוח 2. לחוק הכשרות דיפרנציאציה של בדיקות Neurospheres ו Ciliogenesis
- כדי לנתח את יכולת הבידול, לנתח את neurospheres בתנאים חסידים במדיום בידול.
- לעקר 12 מ"מ עגול coverslips ידי מעוקר או עם חשיפה UV לפני השימוש. לקבלת תרבית תאים חסידה, לשים מכסת זכוכית עגולה מעוקרת 12 מ"מ לתוך באר של צלחת 24-היטב בתנאים מזוהמים.
- מעיל זכוכית המכסה עבור 10 s עם 500 μL של 0.002% פולי- L- ליזין (PLL). לשאוב את הפתרון ולייבש אותו במשך 10-15 דקות.
- הוספת 500 μL של פתרון laminin (5 מיקרוגרם / μL). דגירת זכוכית הכיסוי עבור 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס.
- לשאוב את laminin ולהוסיף 500 μL של מדיום בידול או בינוני NSC (שליטה מובחנת).
- עבור assay בידול, להרים 100 - כדור מיקרומטר 200 עם טיפ 200 μL תחת מיקרוסקופ. לְהוֹסִיף5-10 neurospheres היטב בכל צלחת 24-היטב בתרבות במשך 7-10 ימים במדיום בידול.
- כדי לנתח neurospheres מובחן, להוסיף 5-10 neurospheres היטב בכל צלחת 24-היטב בתרבות במשך 1-2 ימים במדיום המל"ל. Neurospheres Attached להתפשט ולגדול כמו בשכבה (2B איור).
- לאחר הסרת בינוני בקפידה, לתקן את התאים עם 4 paraformaldehyde% (PFA) ב PBS עבור 15 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף עם PBS פעמיים עבור 5 דקות ב RT. הצלחת ניתן לאחסן 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים.
הערה: כדי להמחיש תאי גזע / ובתאים עצביים במדיום NSC ותאי בדיל במדיום בידול, לבצע immunostaining נגד Nestin (גזע עצבי / ובתאי סמן תא), β טובולין III (monoclonal Tuj1, סמן עצבי), GFAP (חלבון גליה fibrillary חומצי astrocyte, סמן), ולאחר O4 (סמן oligodendrocyte) (איור 2B-E). כדי לנתח את הריסים, לבצע immunostaining נגד Arl13b (CI העיקריליה סמן) ו Gpr161 (GPCR ריסי) (איור 3). - הר מכסה זכוכית עם פתרון הרכבה על גבי זכוכית שקופית. הטה את הכוס השקופית להסיר פתרון עודף.
3. ניתוח של Ciliogenesis ב Neurospheres
- כדי לנתח תאים neurospheres שלמים ידי immunostaining, העברת 1 מ"ל של מדיום culturing המכיל neurospheres מרובים כדי צינור 1.5 מ"ל ומסובב ב XG 500 עבור 8 דקות. תקן את התחומים עם 4% (PFA) לאחר ההסרה הבינונית עבור 15 דקות ולשטוף עם PBS. ספין למטה תחומי XG ב 500 במשך 8 דקות, להסיר supernatant, דגירה בתחומי O / N עם סוכרוז 30% ב 4 מעלות צלזיוס.
- בטל supernatant באמצעות קצה מ"ל 1 ולהוסיף 500 μL של פתרון אוקטובר באמצעות קצה מ"ל קיצוץ 1. חותך את קצה הקצה כדי להרחיב את הפתח, כמו אוקטובר הוא צמיג.
- מעבירים את הפתרון אוקטובר המכיל את neurospheres לתוך תבנית הקפאה פלסטיק חד פעמיות (10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ).
- להקפיא את מ 'הישן על קרח יבש דקות 15 לפחות.
- (אופציונלי) הפסק את הניסוי ולאחסן את התבנית במקפיא C -80 ° עד 1 שנה.
- חותכים את החלקים עם cryostat; עובי סעיפים צריך להיות 15-30 מיקרומטר.
- כדי להמחיש את הריסים העיקריים בתוך neurosphere, לבצע immunostaining נגד Arl13b (איור 4).
תרבות Passage 4. Neurospheres ו NSCs חסיד
- המסדרון, neurospheres בעוד בגודל כדור הוא בין 100-200 מיקרומטר; כאשר neurospheres גדול מדי (300 מיקרומטר ומעלה), הם לא אידיאליים עבור ניסויים.
- העברת neurospheres לתוך צינור 50 מ"ל באמצעות קצה מ"ל 1 ומסובב ב XG 500 עבור 8 דקות.
- בטל supernatant באמצעות aspirator, להוסיף 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA ב PBS, דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כמות טריפסין משתנה בהתאם למספר תחומים.
- הוספת 500 μL של המדיום בסרום בעדינות צינורt 20 פעמים עם טיפ מ"ל 1.
- ספין למטה XG ב 500 במשך 8 דקות. בטל supernatant באמצעות טיפ 1 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הבסיס.
- (אופציונלי) אם neurospheres פסולת או undissociated הסלולר נראים, עוברים התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
- מעבר התאים בצלחת 10 ס"מ בצפיפות של 10,000 תאים / ס"מ 2 במדיום המל"ל; התא יהיה מוכן לקטע הבא אחרי שבוע.
- (אופציונלי) כדי להקפיא את התאים, להוסיף מקפיא בינוני לייצר 500,000 עד 1,000,000 תאים / מ"ל ההשעיה. להקפיא את התאים באמצעות מכולות מקפיאות-קריו; neurospheres undissociated אפשר להקפיא גם.
- עבור התרבות החסידה, dillute לתאי 50,000 תאים / סנטימטר 2 על PLL- ו Laminin מצופה coverslips עם מדיום NSC, ותרבות במשך 1-2 ימים.
5. רעב וניתוח של צילה
- כן בינוני רעב (לוח 1).
- 1-2 ימים לאחר pl הראשוניתating של תאים חסידים לאחר ניתוק, שינוי המדיום המל"ל גם אחד (שליטה) ובינוני לרעב אחר היטב (ניסוי).
- תרבות התאים החסידים עבור 24 h.
- תקן את התאים עם 4% PFA ב PBS עבור 15 דקות ב RT ולשטוף פעמיים עם PBS עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
- (אופציונלי) הפסק את הניסוי ולאחסן את צלחות 24-היטב עם coverslips PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים.
- בצע פרוטוקול immunofluorescence מכתים 7, 50.
- הר coverslips באמצעות פתרון גובר. יבש את O זכוכית שקופית / N ב RT בחושך.
- לרכוש תמונות על מיקרוסקופ מתחם בהגדלה ההכרחית. שימוש במיקרוסקופ, מצלמה, ויעדים (40X / 1.3 נפט 63X / 1.4 נפט), הנשלט באמצעות התוכנה המלווה. קח z-סעיפים מספיק על 0.5-0.8 מיקרומטר במרווחים (איור 5).
- לניתוח כמותי של לוקליזציה ריסים בתאים חסידים, לרכוש ערימות של תמונות מתוך 3-8 שדות רצופים עם תאים ומחוברים ע"י הסתכלות לתוך ערוץ DAPI. לכמת את מספר הריסים העיקריים באמצעות ImageJ / פיג'י. בדרך כלל, להשתמש בכלי "מונה Cell" של תוספי ImageJ> לנתח בתיבת הדו-שיח כדי לספור את התאים עם ריסי GPCR חיוביים; תחזיות מקסימליים מארובות של תמונות ניתן גם לייצא מ עוצמת תמונה ופרמטרי ניגוד דומה ImageJ / Fiji.Use עבור כל תמונות מאותו הניסוי לספירה ועניין יצוא.
6. Transfection של Neurospheres
- צמד תאים ניתק כדי coverslips עבור 24 h. השתמש צפיפות תאים בדרך כלל בין 75,000 ו 150,000 תאים 500 μL של המל"ל בינוני באר אחד של צלחת 24-היטב.
- מערבבים 25 μL של המדיום סרום מופחת 1.5 μL של מגיב transfection בתוך microtube 0.5 מ"ל על ידי vortexing עבור 5 ים.
- להוסיף 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד דנ"א רעלן פנימי חופשית microtub 0.5 מ"ל נפרדדואר המכיל 25 μL של תקשורת סרום המופחתת ומערבבים ידי vortexing עבור 5 ימים.
- להוסיף 1 μL של מגיב transfection ל- DNA המכיל שני microtube ומערבב ידי vortexing עבור 5 ימים.
- מוסיפים את תערובת מהצינור המכילים DNA אל microtube הראשון ומערבבים ידי pipetting.
- דגירה את התערובת במשך 10-15 דקות ב RT. לאחר הדגירה, בעדינות ומוסיפים את תערובת transfection dropwise אל בארות על גבי מדיום NSC (500 μL / טוב).
- שינוי המדיום 24 h-transfection פוסט לשלוט (מדיום NSC) בינוני או בינוני רעב (500 μL / טוב).
- תקן את התאים על ידי שינוי בינוני עד 4% PFA לאחר 24 h ולבצע immunostaining; בדרך כלל, עד יעילות transfection 10% מתקבל באמצעות פרוטוקול זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר ציפוי התאים מן SVZ במדיום המל"ל במשך שבוע, neurospheres צף נצפו (איור 2 א). הגדלים של התחום נעים בין 50 לבין 200 מיקרומטר. כדי לבחון אם הספירות היו שמקורם בתאי גזע / ובתאים עצביים, את neurospheres היה מצופה על PLL- ו Laminin מצופה coverslips במדיום NSC עבור 2 ימים. לאחר מכן הם היו immunostained נגד סמן תא גזע / ובתאים העצביים, Nestin. יומיים נדרשו כדי לאפשר את הכדורים אל לצרף את coverslips לגדול כמו בשכבה של תאים. בשכבה של תאים היתה חיובית עבור Nestin (איור 2B). כדי לבחון את יכולת ההבחנה של neurospheres, אנו מצופה מהם ביצוע השלבים המפורטים בסעיף 2 על PLL- ו Laminin מצופים coverslips במדיום בידול ללא ניתוק למשך 7-10 ימים. זה לוקח לפחות שבוע לבידול. Neurospheres מצורפת coverslips ולהרחיבאד לגדול כמו בשכבה של תאים. אנחנו תיקנו את התאים immunostained נגד נוירון, astrocyte, וסמנים oligodendrocyte. הבחנו neurospheres חסיד שהבדילו לתוך β טובולין נוירונים III-חיובי, האסטרוציטים GFAP חיובי, ו oligodendrocytes O4-חיובי (איור 2C-E). לפיכך, ניתן לגזור neurospheres מולטיפוטנטיים מן SVZ עכבר מבוגר.
כדי לקבוע אם neurospheres החסיד נוירונים בדיל יש cilia העיקרי, אנו immunostained נגד Arl13b (סמן cilium העיקרי) 51 ו Gpr161 (GPCR-מקומי ריסים) 7. מניסיוננו, בעכברי מודל זמין להביע ARL13B-mCherry, ובמחקרים עם קליפת עכבר מתפתחת, רוב (אם לא כל) ריסים עצביים במוח להביע Arl13b, בעוד כל הנוירונים אינם ACIII חיובי 52, 53, 54. ה הים, אנחנו בעיקר מסתמכים על Arl13b לזהות ריסים עצביים. אנחנו הבחנו cilia העיקרי ואת הלוקליזציה של Gpr161 אל הריסים של ובתאים ב neurospheres הדבק (איור 3A) ו בנוירונים בדיל (איור 3B). לפיכך, neurospheres חסיד שושלות בדיל הם ריסים בתרבות בתרגום מולקולות איתות.
כדי לקבוע אם neurospheres צף יש cilia העיקרי, אנו cryosectioned neurospheres צף לאחר קיבוע, כמפורט בסעיף 3. הבחנו cilia העיקרי גזע עצביים / ובתאים התאים neurospheres מחולק (איור 4 א-ב). חשוב לרכוש z-סעיפים ברחבי neurospheres לדמיין מלא cilia העיקרי, משום שקשה לבחון את הריסים העיקריים z-מטוס בודד. לסיכום, neurospheres המובחן יש אוכלוסיות הטרוגניות של תאי ריסים ולא ריסים.
: לשמור-together.within-page = "1"> כדי לנתח את ciliogenesis של תאי גזע / ובתאים עצביים, אנו ניתקים neurospheres ו מצופים בתאים על PLL- ו coverslips מצופה Laminin. לאחר culturing אותם במדיום רעב, צפינו גידול באחוז הריסים, כפי שזוהו על ידי Arl13b, לעומת אלה בתרבית בינוני NSC (% ciliation) (איור 5 א-ב). בנוסף, אנו ציינו מספר גדל של ריסי Gpr161 החיוביים על הרעבה (% ריסי Gpr161 חיובי / Arl13b חיובי cilia) (איור 5 א-ב). מעניין, במחקר קודם באמצעות שורות תאי גזע אנושיים מובחן עובריים הוכיח כי תאי גזע עובריים ממקור אנושי בתרבות גם להחזיק את השיער הראשוני 55. מספר ואורך עלייה הריסים על רעב סרום אלה שורות תאים, ואת הריסים אלה גם בעלי רכיבים של מכונות ששש.
גם אנחנו טרנספקציה חסיד גזע עצביים / progenitor תאים, כמתואר בסעיף 6. בדרך כלל אנחנו הבחנו יעילות transfection של עד 10%, בדומה תרבויות נוירון העיקרי במעבדה (איור 6).
| פִּתָרוֹן | רְכִיב |
| 1x PBS | לדלל 10x PBS עם מים autoclaved |
| מדיום NSC | 2 מ"ל 50x B27 |
| 1 מ"ל 100x N2 | |
| 1 מ"ל 200 מ"מ L- גלוטמין | |
| 1 מ"ל 100x פן / סטרפטוקוקוס | |
| FGF-בסיסי (אדם bFGF) (נ"ג 25 פתרון במלאי / מ"ל במדיום Neurobasal): 20 ng / mL או 2 סך מ"ג עבור 100 מ"ל התקשורת | |
| EGF (פתרון במלאי 25 ng / mL בינוני Neurobasal): 20 ng / mL או 2 סך מ"ג עבור 100 מ"ל התקשורת | |
| 95 בינוני בסיסי מיליליטר | |
| FGF-יסוד האדם (האדם bFGF) | 1 בינוני הבסיסי מ"ל בבקבוק מיקרוגרם מסחרי האדם bFGF 25 |
| חנות microtubes סטרילי ב- C ° -20 או נמוך. השתמש aliquot יחיד 80 μL או 2 מיקרוגרם / 100 מ"ל התקשורת המל"ל. | |
| EGF | להוסיף 8 בינוני הבסיסי מ"ל בבקבוק מיקרוגרם מסחרי EGF 20 |
| אחסן microtubes סטרילי כמו C -20 ° או נמוך. השתמש aliquot יחיד 80 מיקרוגרם / 100 מיליליטר תקשורת. | |
| מדיום עצירה | 1 מ"ל FBS |
| 75 U DNase אני (75 U / uL ב PBS) | |
| 9 מ"ל PBS | |
| מדיום סרום | 1 מ"ל FBS |
| בינוני 9 מ"ל בסל | |
| מדיום הקפאה | 4 מ"ל DMSO |
| 24 בינוני בסיסי מיליליטר | |
| 12 מ"ל 30% FBS | |
| בינוני בידול | 90 בינוני בסיסי מיליליטר |
| 5 מ"ל 5% FBS | |
| 1 מ"ל 100x פן / סטרפטוקוקוס | |
| 1 מ"ל 200 מ"מ L- גלוטמין | |
| 1 מ"ל 100x N2 | |
| 2 מ"ל 50x B27 | |
| FGF-בסיסי (אדם bFGF) (פתרון במלאי של 25 ng / mL בינוני Neurobasal): 10 ng / mL או 1 הכולל מ"ג עבור 100 מ"ל | |
| מדיום רעב | 95 בינוני בסיסי מיליליטר |
| 1 מ"ל 100x פן / סטרפטוקוקוס | |
| 1 מ"ל 200 מ"מ L- גלוטמין | |
| 1 מ"ל 100x N2 | |
| 2 מ"ל 50x B27 |
טבלה 1: מתכון של פתרונות.
ve_content" FO: keep-together.within-page = "1">
איור 1: תרשים סכמטי של neurosphere התרבות והתמיינות הפרוטוקולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: קיבולת בידול לתצוגות Neurospheres. (א) neurospheres נציג מוצג. (ב) Neurospheres היה מצופה על PLL- ו Laminin מצופה coverslips במדיום NSC עבור 2 ימים היו immunostained נגד Nestin (גזע עצבי / סמן תא אב). (CE) Neurospheres היו מצופה ביצוע השלבים המפורטים בסעיף 2 על PLL- ו Laminin מצופים coverslips במדיום בידול עבור 7 ימים withoניתוק UT; תוקן; ו immunostained נגד β טובולין III (סמן עצבי), GFAP (סמן astrocyte), ו O4 (סמן oligodendrocyte). הגרעינים הוכתמו על ידי DAPI. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Neurospheres ו נוירונים החסיד Differentiated Neurospheres הם ריסים. (א) neurospheres Undissociated היו מצופה על coverslips מצופה במדיום NSC עבור 2 ד; תוקן; ו immunostained נגד Gpr161 (ירוק), Arl13b (אדום), ו- DNA (כחול). (ב) נוירונים הבדיל היו immunostained נגד Gpr161 (ירוק), Arl13b (אדום, א) או β טובולין III (אדום, B), ואת ה- DNA (כחול). חיצים לבנים מצביעים לוקליזציה Gpr161 ב ריסים.הפנלים ממש (א ') הם נופים מוגדלים של cilium העיקרי מצוין על ידי החץ הלבן. Cilium Gpr161 חיובי הנוירון לבן-התאגרף מוצג בצד ימין (B). סולם = 10 מיקרומטר (א); 50 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: צפים, מובחן Neurospheres להחזיק תאי ריסים. neurospheres צף תוקנו, מוטבע אוקטובר, cryosectioned, ומעובד immunofluorescence נגד Arl13b (אדום) ו DNA. ריסים עיקריים Arl13b חיוביים בתוך neurosphere מוצגים. הפאנל ב (א) הוא היטל מירבי בעוצמה של 14 z-סעיפים ב 0.8 מיקרומטר במרווחים של neurosphere. הפנלים ב (ב) להציג את התצוגה המוגדלת גתאי iliated באזור הלבן-התאגרף (א). דימוי ההקרנה המקסימאלי מכל Z- הקטעים מוצג כערימה, ואילו מספרים 1 עד 14 מצביעי z-חלקים בודדים. החצים הלבנים מצביעים cilia העיקרי. בר סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: רעב הגורם Ciliogenesis ב גזע ניתק חסיד עצבי / ובתאים. (א) תאים ניתקים היו מצופים על coverslips מצופה במדיום NSC או בינוני רעב במשך 24 h; תוקן; ו immunostained נגד Gpr161 (ירוק), Arl13b (אדום), ו- DNA (כחול). ריסי Gpr161 חיובי נצפים בשליטה (משמאל) מורעב (מימין) תאים. הפנלים התחתונים נופים מוגדלים של קופסות הלבנות המצוינות בהתאמהלוחות עליונים. החצים וראשי חצי לבנים מצביעים Gpr161-חיובי -שלילית ריסים, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) כימות של תאי ריסי Arl13b חיוביים (גרף משמאל) Gpr161 לוקליזציה ב ריסי Arl13b החיוביים (מימין גרף) בשליטה ותאי מורעבים. האחוזים של שני Arl13b חיוב תאי ריסי Gpr161 לוקליזציה ב Arl13b חיובי ריסים גדלו על הרעבה. הכימות מבוצע משני שדות מבט אחד משני משכפל טכני של ניסוי בודד. הנתונים מיוצגים כממוצע מכל 4 שדות הראיה ± סטיית התקן. *, P <0.05; **, P <0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: Transfection בגזע ניתק חסיד עצבי / ובתאים. תאים ניתקים מצופים על coverslips המצופה היו transfected עם סופית N-LAP-TULP3 (1-183 aa) mut12 מבנה שאינו להיקשר IFT-A הליבה 56 מורכבים. המדיום שונה-transfection פוסט h 24 בינוני רעב. התאים היו קבועים לאחר 24 שעות ולאחר immunostained נגד GFP (ירוק), Gpr161 (אדום), Arl13b (מג'נטה), ו- DNA (כחול). תא טרנספקציה עם Gpr161- ו cilium Arl13b החיובי מסומן על ידי חץ לבן, ואילו תא טרנספקציה ללא ריסים מוצג עם ראש חץ לבן. חיצים וראשי חצים צהובים מצביעים לתאי untransfected עם או בלי Gpr161 / Arl13b, בהתאמה. בר סולם = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים שיטה להפקה ולשמור תרבויות neurosphere מן SVZ עכבר המבוגר. כמה נקודות רלוונטיות לגבי התרבויות הן כדלקמן. ראשית, בגדלים של הספירות הם בדרך כלל בין 50 ל - 200 מיקרומטר. מניסיוננו, כאשר neurosphere מקבל גדול יותר 300 מיקרומטר קוטר, הזמן האופטימלי עבור passaging הוחמץ. תחומים גדולים אלה מכילים תאים מתים בתוך הליבה. שנית, כפי neurospheres משמשת ללמוד בתאי גזע / ובתאים עצביים, חשוב להשתמש EGF ו FGF-בסיסי (bFGF) כדי לשמור על stemness של תאים אלה. לכן, הגורמים להשרות התמיינות, כגון FBS, יש להימנע במהלך התחזוקה של neurospheres. הוכח כי 10% FBS יכול להבדיל neurospheres לתוך האסטרוציטים 47. שלישית, מידת הבידול עצבי עלולה להיות תלויה בגיל העכבר. אם אחד רצונות בידול עצבי יותר מ neurospheres, עכברים צעירים (da לאחר הלידהy 0) יכול לשמש. רביעית, אם מתחילים תרבויות חדשות, זה טוב תמיד לבחון את יכולת ההבחנה של neurospheres. החמישית, השיטה שלנו מאפשרת גם הקפאה להפשרה מתרבויות neurosphere הוקמו לשימוש הניסיון בעתיד. לאחר הפשרה, תאים בדרך כלל גדלי תאים חסידים כמו בצורת כישור ללא פולי- L- ליזין או laminin. זו עלולה להיגרם על ידי פגיעה להקפיא להפשיר את התאים. חשוב לשמור על התאים גדלו עד שהם הופכים 60 - 80% ומחוברות לפני המעבר. לאחר חלוף, התאים בדרך כלל גדלים כמו neurospheres וניתן passaged למעלה בדרך כלל 5 - 10 פעמים.
Neurosphere מבוסס שיטות התרבות מאפשרות לנו ללמוד סחר ריסים ו מסלולי איתות גזע עצבי / ובתאים נוירונים בדיל. בחנו cilia העיקרי צף / neurospheres חסיד הבדיל. חשוב לרכוש z-מספר סעיפים לדמיין ריסים לאורך ההיקף המלא של neurospheres. יתר על כן, ומאחוראה יצירת תרבויות חסידות של neurospheres אלה, ולהרעיב עבור 24 h, רוב תאי ריסים (איור 5) והעשר את היתום GPCR, Gpr161. עם זאת, ממושכת רעבה של תוצאות תרבויות החסידות במבנים התת-תאי vacuolar. לפיכך, חשוב לייעל תקופות רעבות בקפידה למטרות ניסוי בפרט.
נכון לעכשיו, מחקרים על ciliogenesis מבוצעים בעיקר כמה ריסים, הונצח שורות תאים 57. שורות תאים אלה אינן תמיד בנאמנות לשחזר נוירונים ותאי גזע / ובתאים עצביים בהבעת רכיבי איתות, כגון GPCRs או מכונה מסלול ששישה, מה שהופכים את זה הכרחי כדי לפתח שיטות חדשות יותר כדי ללמוד את התפקיד של ריסים בתהליכים ביולוגיים. השיטות מבוססות neurosphere המתואר כאן מאפשרות לנו ללמוד מסלולי הסלולר מוסדר ריסים, כולל GPCR איתות ששישה בהקשר של תאי גזע / ובתאים עצביים diffנוירונים erentiated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
References
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
- Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
- Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
- Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
- Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
- Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
- Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
- Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
- Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
- Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
- Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
- Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
- Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G.
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
- Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
- Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
- Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
- Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
- Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
- Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
- Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
- Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
- Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
- Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
- Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
- Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
- Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
- Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
- Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
- Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
- Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).
