Summary
本研究显示了在大鼠中进行脊髓缺血的微创和易复制模型的技术。通过控制主动脉闭塞时间可以产生不同程度的后肢运动障碍。
Abstract
脊髓缺血是胸腹主动脉瘤手术后的致命并发症。研究人员可以使用脊髓缺血实验模型调查预防和治疗这种并发症的策略。这里描述的模型表明与大鼠脊髓缺血模型中胸主动脉闭塞后的闭塞长度有关的不同程度的截瘫。
2-Fr。气球导管通过股动脉进入下行胸主动脉，直到导管尖端置于麻醉的雄性Sprague-Dawley大鼠的左锁骨下动脉中。通过使导管气囊膨胀来诱导脊髓缺血。经过一段闭塞时间（9,10或11分钟）后，气囊放气。术后24 h采用运动缺陷指数进行神经病理学评估，收集脊髓进行组织病理学检查。
主动脉闭塞9分钟的大鼠在后肢显示出轻度且可逆的运动障碍，经受10分钟主动脉闭塞的大鼠出现中度但可逆运动障碍，经受主动脉闭塞11分钟的大鼠显示完全和持续瘫痪，大鼠主动脉闭塞持续时间较长的大鼠脊髓部分运动神经元更保守。使用这种脊髓缺血模型，研究人员可以在胸主动脉闭塞后达到可重现的后肢运动障碍。
Introduction
截瘫是胸腹主动脉瘤手术的致命并发症。这是由于在主动脉夹紧和松开过程中发生的脊髓缺血 - 再灌注损伤。 1个几种策略包括全身体温过低和脑脊液引流已被引入到保护脊髓，2，3，4，但许多患者仍然受到伤病影响。
引入了几种动物脊髓缺血模型来研究其发病机制，制定了对损伤的保护策略。在本研究中，我们概述了基于Taira和Marsala方法的脊髓缺血大鼠模型。 5大鼠的脊髓循环系统与人类脊髓血管和侧支系统非常相似，尽管大小和位置。 6,7因此，大鼠是解剖学上合适的动物，以利用用于实验模型调查发病，并发症和治疗脊髓缺血的。此外，这种脊髓缺血模型通过利用胸主动脉的血管内气囊闭塞以最小的干预产生可靠的主动脉闭塞。
在这项研究中，我们证明，这种脊髓缺血大鼠模型诱导后肢的可重复的运动缺陷，其严重程度随主动脉闭塞时间而变化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本议定书由首尔国立大学邦唐医院机构动物护理使用委员会批准。根据美国国家卫生研究院护理和使用实验动物的指南进行动物护理和实验。
手术准备
- 在手术前，用无菌盐水冲洗导管以确保通畅。
- 将加热毯放在手术台上，并用无菌悬垂盖住桌子。
- 将雄性Sprague-Dawley大鼠（270-330g）放入具有3.0％-4.0％异氟烷的丙烯酸盒中，在100％氧气中。
- 向大鼠的眼睛涂抹润滑剂。
- 将大鼠放在手术台上仰卧位，并使用面罩连续给药吸入异氟烷（1.0％-2.5体积％），维持麻醉。
- 放置直肠探针以监测和维持体温在37.0-38.0°C之间。
股动脉导管
- 使用Betadine和70％乙醇轻轻擦洗右腹股沟区域。
- 在右腹股沟区域使用剪刀做一个2厘米水平的皮肤切口。
- 使用牵开器，暴露外科手术。
- 从周围静脉和神经解剖股动脉。使用弯曲的镊子和钝的镊子分离1 cm的动脉部分。
- 使用4.0黑色丝线缝合，在动脉的近端和远端放置松绑，以最大化暴露。
- 使用微型剪刀在股动脉上进行切口。
- 插入2-Fr。气囊导管使用微镊子进入股动脉。将导管固定在离近端结扎导管头1厘米处的血管上，然后将远端结扎扎扎。
颈动脉导管
- 用betad擦洗右前颈ine和70％乙醇，然后做皮肤切口。
- 使用牵开器，暴露外科手术。分离动脉的1厘米部分，并用动脉近端和远端的丝线缝合松紧，以使暴露最大化。
- 使用24 G静脉导管穿刺颈动脉，并将导管的近端1 cm推向心脏。
- 用近端结扎固定导管，然后绑扎远端结扎。
- 使用三通旋塞阀，将导管的远端连接到盐水填充的微管和外部储存器。
4.尾动脉导管
- 使用betadine和70％乙醇洗涤尾巴的腹侧，并制成2厘米的皮肤切口。
- 从周围的结构解剖尾动脉，并使用弯曲的镊子和钝的镊子隔离1cm的动脉部分。
- 使用4.0黑色丝线缝合，放松绑在动脉的近端和远端，以最大化曝光。
- 使用24 G静脉导管穿刺尾动脉，并将导管推入动脉。
- 将导管固定到血管（距离导管头约1厘米）与近端结扎，并绑定远端结扎。
- 将导管的远端连接到动脉压监测装置。
5.脊髓缺血诱导
- 导管完成后，推进2气球导管进入下行胸主动脉，使得导管的尖端到达左锁骨下动脉。
- 插入距离插入位置10厘米的深度。
- 以100单位/ mL的浓度将150单位肝素注入颈动脉导管。
- 用0.05 mL盐水充气导管球囊。
- 同时从c排出血液进入外部血液容器颈动脉调节近端动脉压至80 mmHg。
- 将动脉压监测系统连接到三通止动阀的剩余腔，并通过监测动脉压来控制排尿量。
- 通过急性下降和远端动脉压力的持续丧失来确认主动脉闭塞的成功。
- 主动脉闭塞9,10或11分钟后，放血Fogarty导管球囊，并重新灌注排出的血液。
6.手术后护理和神经病学评估
- 在通过尾动脉监测动脉压时，从股骨和颈动脉中取出导管，用丝线缝合闭合伤口。
- 确认动脉压恢复到正常范围后，从尾动脉取出导管并闭合伤口。
- 从麻醉恢复后，将大鼠回笼。
- 评估你好在手术后24 h使用运动障碍指数（ 表1 ）检查肢体运动功能。运动赤字指数定义为步行分数与放置/步进反射分数之和。运动赤字指数为6表示最大赤字。
7.组织病理学评估
- 神经学评估后，用面罩递送的异氟烷麻醉大鼠，在麻醉下用100mL肝素化盐水经血流灌注处死，抽取脊髓。 8
- 将来自腰椎3-5级的绳索部分嵌入石蜡中。
- 用苏木精和伊红（H＆E）染色横断面。
- 在显微镜下观察运动神经元损伤。 9
8.统计分析
- 使用统计软件包进行社会科学版20的统计分析使用Kruskal-Wallis检验比较三组的icit指数，其次是Mann-Whitney U检验。 P值<0.05被认为具有统计学意义。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在脊髓缺血期间，主动脉闭塞9分钟（n = 3），10分钟（n = 3）或11分钟（n = 3）。大鼠的运动缺陷指数见表2.主动脉闭塞9分钟的大鼠在后肢显示轻度和可逆的运动障碍。大鼠经历10分钟的主动脉闭塞呈现中度运动缺陷，但不完全麻痹。经历11分钟闭塞时间的大鼠显示完全和持续性麻痹。
用H＆E染色的脊髓切片的代表性照片如图1所示。在经历较短持续时间的主动脉闭塞的大鼠中，脊髓切片中的运动神经元更保守。
图1 。组织学检查脊髓切片的入院
运动神经元在经历较短持续时间的主动脉闭塞（原始放大倍率，200倍）的大鼠中更保存。所有图像中的比例尺=50μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 行走（下肢行走） | 放置/步进反射 |
| 0：正常（对称协调行走） | 0：正常 |
| 1：行走时脚趾平坦，但共济失调存在 | 1：弱 |
| 2：指关节步行 | 2：没有步 |
| 3：运动在下肢，但无法指关节行走 | |
| 4：没有动作，拖下肢 |
表1.评估行走和放置/步进反射。
| 主动脉闭塞时间 | 手术后24小时 |
| 9分钟（n = 3） | 2（2 - 3） |
| 10分钟（n = 3） | 4（4 - 4） |
| 11分钟（n = 3） | 5（5 - 6） |
表2.运动缺陷指数。值以中位数（四分位数范围）表示。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在目前的研究中，我们展示了一种基于Taira和Marsala方法5的脊髓缺血大鼠模型，其根据主动脉闭塞时间在后肢中引起不同程度的运动障碍。
主动脉闭塞的长度可影响运动障碍的程度。如果主动脉闭塞时间较长，运动缺陷变得更加严重。因此，研究人员可以通过控制该模型中的主动脉闭塞时间来实现一定程度的运动障碍。
我们的模型涉及颈总动脉和股动脉的结扎，并且由这些动脉结扎引起的神经功能缺损的可能性是潜在的问题。然而，老鼠具有有效的抵押网络系统。因此，当颈动脉或股动脉结扎时，可以通过广泛的抵押网络提供足够的血流量。单侧胡萝卜据报道，d动脉闭塞仅对脑血流量产生微小的影响。 10,11尽管单方面颈动脉闭塞可生产大鼠中风，这仅在有严重全身缺氧组合时发生。 12在我们的实验中，没有全身缺氧发生，并且没有大鼠带有暗示性脑梗塞的神经功能缺损。此外，当大鼠的股动脉结扎时，侧支循环向后肢肌肉提供足够的血液流动。 13这侧支循环提供了足够的血流量，当他们在休息后肢肌肉，但运动时没有提供足够的流量。 14
此外，脊髓缺血期间的近端动脉压力影响运动缺陷的发展。根据以前的研究，在大鼠脊髓缺血模型主动脉夹钳期间，侧支血液供应在近端动脉压为40 mmHg时几乎消失，因此随后的研究在大鼠脊髓模型中将脊髓缺血期间的近端动脉压维持在40 mmHg脊髓缺血。9，15，16然而，在该协议中，我们维持在主动脉阻断时80毫米汞柱近端动脉压，因为它建议保持在80毫米汞柱或更大的平均动脉压为脊髓期间保持足够的脊髓灌注临床实践中的缺血17虽然在什么构成人与啮齿动物之间足够的近端动脉压力方面可能存在差异。
大鼠和人类的脊髓脉管系统和侧支系统相似， 6 ， 7 ，这使得大鼠成为实验性脊髓缺血模型的适当选择。然而，根据脊髓缺血发生的种类，结果可能不同，不应该被打折。
总之，研究人员可以很容易地采用这种大鼠脊髓缺血模型，达到高度可重复的发现。此外，它们可以改变主动脉闭塞时间，以改变产生的运动障碍的程度。因此，该模型可以促进进一步研究检查胸腹主动脉瘤后神经系统并发症的潜在病理生理学，并允许开发针对这些并发症的神经保护策略。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有竞争的经济利益。这项工作得到韩国政府国家研究基金会拨款2012R1A1A3014010的支持。
Acknowledgments
作者没有确认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S.
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
