Summary
이 연구는 쥐에서 척수 허혈의 최소 침습적이고 쉽게 재현 가능한 모델을 만드는 기술을 보여줍니다. 대동맥 폐색 시간을 조절하여 다양한 정도의 뒷다리 운동 장애를 일으킬 수 있습니다.
Abstract
척수 허혈은 흉 복부 대 동맥류 수술 후 치명적인 합병증입니다. 연구원은 척수 허혈의 실험 모델을 사용하여이 합병증을 예방하고 치료하기위한 전략을 조사 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 모델은 쥐의 척수 허혈 모델에서 흉부 대동맥 폐색 후 교합 길이와 관련된 다양한 마비 정도를 보여줍니다.
2-Fr. 카테터 팁이 마취 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐의 왼쪽 쇄골 하 동맥에 위치 할 때까지 풍선 팁 카테터를 대퇴 동맥을 통해 하행 흉부 대동맥으로 전진시켰다. 카테터 풍선을 팽창시켜 척수 허혈을 유도 하였다. 설정된 폐색 후 (9, 10, 또는 11 분), 풍선은 수축되었다. 수술 후 24 시간에 운동 부족 지수를 이용하여 신경 학적 검사를 시행하고 조직 병리학 적 검사를 위해 척수를 수확 하였다.
jove_content "> 대동맥 폐쇄 9 분을받은 쥐는 뒷다리에서 가벼우면서 가역적 인 운동 장애를 보였습니다. 대동맥 차단 10 분을받은 쥐는 중등도이지만 가역적 인 운동 장애를 보였습니다. 대동맥 차단 11 분을받은 쥐는 완전하고 영구적이었습니다 척수 절편의 운동 신경 세포는 대동맥 폐색 기간이 짧은 래트에서 더 많이 보존되었다.연구원은이 척수 허혈 모델을 사용하여 흉부 대동맥 폐쇄 후 재현 가능한 뒷다리 운동 장애를 달성 할 수 있습니다.
Introduction
Paraplegia는 흉 복부 대동맥 동맥류 수술의 치명적인 합병증입니다. 이것은 대동맥의 교차 클램핑 및 언 클램핑 중에 발생하는 척수 허혈 - 재관류 손상으로 발생합니다. 1 , 2 , 3 , 4 척수를 보호하기 위해 전신 저체온 및 뇌척수액 배출을 포함한 몇 가지 전략이 도입되었지만 부상을 입은 환자는 많습니다.
몇 가지 동물성 척수 허혈 모델이 병인 발생을 조사하고 손상에 대한 방호 전략을 고안하기 위해 도입되었습니다. 본 연구에서는 Taira와 Marsala의 방법을 바탕으로 척수 허혈 모델을 제시 하였다. 5 쥐의 척수 순환 시스템은 인간의 척수 혈관 및 담보 시스템과 매우 유사, 크기에 약간의 차이가 있지만 및위치. 도 6,도 7은 이와 같이, 래트 척수 허혈의 발병, 합병증 치료를 조사하는 실험 모델 활용 해부학 적합한 동물이다. 또한,이 척수 허혈 모델은 흉부 대동맥의 혈관 내 풍선 폐쇄를 이용하여 최소한의 개입으로 신뢰할 수있는 대동맥 폐쇄를 생성합니다.
본 연구에서 우리는이 척수 허혈 모델이 대동맥 폐색 시간에 따라 다르게 나타나는 재현성 운동 장애를 뒷다리에서 유도한다는 것을 보여 주었다.
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Protocol
이 프로토콜은 분당 서울 대학교 병원 동물 실험 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 동물 보호 및 실험은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 미국 국립 보건원 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 수술 준비
- 수술하기 전에, 개통을 보장하기 위해 멸균 식염수로 카테터를 플러시하십시오.
- 수술대 위에 난방 담요를 놓고 멸균 드레이프로 테이블을 덮으십시오.
- 수컷 Sprague-Dawley 흰쥐 (270-330g)를 100 % 산소 중 이소 플루 란 3.0 % -4.0 %를 함유 한 아크릴 상자에 넣으십시오.
- 쥐의 눈에 윤활유를 바르십시오.
- 쥐를 수술 자세로 누운 자세로 놓고 얼굴 마스크를 사용하여 흡입 된 isoflurane (1.0 % -2.5 vol. %)을 지속적으로 투여하면서 마취를 유지하십시오.
- 직장 프로브를 배치하여 37.0-38.0 ° C 사이의 체온을 모니터링하고 유지하십시오.
2. 대퇴 동맥 카테터 삽입술
- 부드럽게 Betadine과 70 % 에탄올을 사용하여 오른쪽 사타구니 부분을 문질러 서.
- 오른쪽 사타구니 부분에 가위를 사용하여 2cm 수평 피부 절개를하십시오.
- 견인기를 사용하여 수술 부위를 노출시킵니다.
- 주변 정맥과 신경에서 대퇴 동맥을 해부하십시오. 곡선 포셉과 무딘 포셉을 사용하여 동맥의 1cm 섹션을 분리.
- 4.0 검은 실크 봉합사를 사용하여 노출을 최대화하기 위해 동맥의 근위와 말단 양쪽에 느슨한 타이를 놓습니다.
- 마이크로 가위를 사용하여 대퇴 동맥을 절개하십시오.
- 2-Fr. 마이크로 포셉 (micro-forceps)을 사용하여 풍선 팁 카테터를 대퇴 동맥에 삽입 하였다. 근위 결찰이있는 카테터 헤드에서 약 1cm 정도 혈관에 카테터를 고정시킨 다음 원위부 결절을 묶습니다.
3. 경동맥 카테터 삽입술
- betad를 사용하여 오른쪽 앞목을 문질러 내십시오.ine, 70 % ethanol을 넣은 후 피부 절개를하십시오.
- 견인기를 사용하여 수술 부위를 노출시킵니다. 동맥의 1cm 부분을 분리하고 노출을 최대화하기 위해 동맥의 근위 및 말단 양쪽에 실크 봉합을 사용하여 느슨하게 묶습니다.
- 24 G 정맥 카테터를 사용하여 경동맥을 찔러 카테터 근위 1 cm를 심장쪽으로 전진시킵니다.
- 근위 결찰로 카테터를 고정한 다음 원위 결찰을 묶습니다.
- 3 방향 스톱 콕을 사용하여 카테터의 말단부를 식염수가 채워진 마이크로 튜브와 외부 저장소에 연결하십시오.
4. 꼬리 동맥 카테 테르 테이션
- betadine과 70 % 에탄올을 사용하여 꼬리의 복부 부위를 문질러 2 cm 피부 절개를하십시오.
- 주위 구조에서 꼬리 동맥을 해부하고 곡선 포셉과 무딘 포셉을 사용하여 동맥의 1cm 섹션을 분리.
- 4.0 검정색 실크 봉합사를 사용하여 느슨한 곳에 놓습니다.노출을 최대화하기 위해 동맥의 근위 및 말단 모두를 연결합니다.
- 24 G 정맥 카테터를 사용하여 꼬리 동맥을 찔러 카테터를 동맥 내로 전진시킵니다.
- 근위 결찰과 함께 카테터를 카테터 헤드 (카테터 헤드에서 약 1cm)에 고정하고 먼쪽 결찰을 묶습니다.
- 카테터의 말초 부분을 동맥 압력 모니터링 장치에 연결하십시오.
5. 척수 허혈 유도
- 도뇨관 검사가 끝나면 2 Fr. 카테 테르의 팁이 왼쪽 쇄골 하 동맥에 도달하도록 하강 흉부 대동맥으로 풍선 팁 카테터를 삽입한다.
- 삽입 사이트에서 10cm 깊이에 삽입하십시오.
- 경동맥 카테터에 100 units / mL의 농도로 헤파린 150 단위를 주입하십시오.
- 0.05 mL의 식염수로 도뇨관 풍선을 팽창시킵니다.
- 동시에, 외부 혈액 용기로 혈액을 배출하고경동맥 동맥은 근위부 동맥압을 80 mmHg로 조절한다.
- 동맥 압력 모니터링 시스템을 3 방향 스톱 코크의 나머지 루멘에 연결하고 동맥압을 모니터링하여 혈액 배출량을 제어하십시오.
- 갑작스런 감소와 말초 동맥압의 지속적인 상실로 대동맥 폐색의 성공을 확인하십시오.
- 9, 10, 또는 11 분의 대동맥 폐색 후 Fogarty 카테터 풍선을 수축시키고 배액 한 혈액을 다시 주입하십시오.
6. 수술 후 관리 및 신경 학적 평가
- 꼬리 동맥을 통해 동맥압을 모니터링하면서 대퇴 동맥과 경동맥에서 카테터를 제거하고 실크 봉합으로 상처를 닫습니다.
- 동맥압이 정상 범위로 회복되었는지 확인한 후 꼬리 동맥에서 카테터를 제거하고 상처를 닫습니다.
- 마취에서 회복 후, 그 케이지에 쥐를 반환합니다.
- 안녕 평가수술 후 24 시간에 운동 부족 지수를 이용하여 사지 운동 기능을 평가 하였다 ( Table 1 ). 운동 결핍 지수는 보행 점수와 배치 / 스테핑 반사 점수의 합으로 정의됩니다. 6의 모터 적자 지수는 최대 적자를 나타냅니다.
7. 조직 병리학 적 평가
- 신경 학적 평가 후 마스크가 달린 이소 플루 란으로 쥐를 마취시키고 마취 하에서 헤파린 처리 된 식염수 100 mL로 심근 관류로 희생시키고 척수를 추출한다. 8
- 요추 3 ~ 5 단계의 코드 부분을 파라핀으로 채 웁니다.
- 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E)으로 횡단면을 염색합니다.
- 현미경으로 운동 뉴런 손상을 관찰하십시오. 9
8. 통계 분석
- 사회 과학 버전 20에 대한 통계 패키지를 사용하여 통계 분석을 수행하십시오. 모터 def세 그룹의 지수를 Kruskal-Wallis 테스트와 Mann-Whitney U 테스트를 통해 비교했다. P 값 <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
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Representative Results
척수 허혈의 기간 동안 9 분 (n = 3), 10 분 (n = 3) 또는 11 분 (n = 3) 동안 대동맥 폐쇄가 수행되었다. 쥐의 운동 결핍 지수를 표 2에 나타내었다. 대동맥 폐색 9 분을받은 랫드는 뒷다리에서 경미하고 가역적 인 운동 장애를 보였다. 10 분간 대동맥 폐색을받은 래트는 중등도의 운동 장애를 보였으 나 완전한 마비가 아님. 11 분간의 폐색 시간을 보인 쥐는 완전하고 지속적인 마비를 보였다.
H & E로 염색 된 척수 절편의 대표 사진이 그림 1에 나와 있습니다. 척수 절편의 운동 신경 세포는 대동맥 폐색 기간이 짧은 래트에서 더 많이 보존되었다.
그림 1 . 조직 검사척수 절의 입술
운동 신경은 더 짧은 대동맥 폐쇄 기간 (원래 배율, 200X)을받은 래트에서 더 보존되었다. 모든 이미지의 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Ambulation (하지 말단 걷기) | 반사 배치 / 스테핑 |
| 0 : 정상 (대칭 및 조화 된 보행) | 0 : 정상 |
| 1 : 걷는 동안 몸 아래 평평한 발가락이지만 운동 장애는 있습니다. | 1 : 약함 |
| 2 : 너클 워킹 | 2 : 스테핑 없음 |
| 3 :하지의 움직임은 너클 걷지 못함 | |
| 4 : 움직이지 않고,하지를 끕니다. |
표 1. 앰뷸 레이션 및 배치 / 스테핑 반사 평가.
| 대동맥 폐색 시간 | 수술 후 24 시간 |
| 9 분 (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 분 (n = 3) | 4 (4 - 4) |
| 11 분 (n = 3) | 5 (5-6) |
표 2. 모터 적자 지수. 값은 중간 값 (사 분위수 범위)으로 표시됩니다.
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Discussion
본 연구에서는 대동맥 폐색 시간에 따라 뒷다리에서 운동 부족의 정도를 다양하게 유도하는 Taira와 Marsala의 방법 5 에 근거한 척수 허혈 모델을 시연했다.
대동맥 폐쇄의 길이는 운동 부족의 정도에 영향을 줄 수 있습니다. 대동맥 폐색 시간이 길면 모터 결손이 더욱 심해집니다. 따라서 연구자들은이 모델에서 대동맥 폐색 시간을 조절함으로써 어느 정도의 운동 부족을 달성 할 수있다.
우리의 모델은 총 경동맥과 대퇴 동맥의 연결을 포함하며, 이러한 동맥의 결찰로 인한 신경 학적 결손의 가능성은 잠재적 인 관심사입니다. 그러나 쥐는 효율적인 부수적 인 네트워크 시스템을 가지고 있습니다. 따라서, 경동맥 또는 대퇴 동맥이 연결될 때, 충분한 혈류가 광범위한 부수적 네트워크에 의해 제공 될 수있다. 일 측성 카로티 d 동맥 폐색은 뇌 혈류에 약간의 영향을 미친다 고보고되었다. 일방적 경동맥 폐색 쥐에서 스트로크를 생성 할 수 있지만 경우에만 심한 전신 저산소증과 함께 10, 11,이 발생합니다. (12) 우리의 실험을하는 동안, 어떤 조직 저산소증가 발생해서 쥐의 아무도는 뇌경색의 암시 신경 학적 결손이 표시되지 않습니다. 또한, 쥐의 대퇴 동맥을 결찰하면, 부수적 인 순환이 뒷다리 근육에 충분한 혈류를 제공합니다. 13이 담보 순환은 나머지에있는 뒷다리 근육에 충분한 혈액의 흐름을 제공하지만, 운동을하는 동안 충분한 흐름을 제공하지 않습니다. 14
또한, 척수 허혈 중 근위부 동맥압은 운동 부족의 발달에 영향을 미친다. 이전 연구에 따르면,척수 허혈 모델에서 대동맥 클램핑시 40 mmHg의 근위부 동맥압에서 측부 혈액 공급이 거의 사라져서 척수 허혈 모델에서 근위부 동맥압이 40 mmHg로 유지되었다 이 척수 동안 적절한 척수 관류를 유지하여 80 mmHg로 이상에서의 평균 동맥압을 유지하도록 권장하기 때문에 코드 허혈. 9, 15, 16 그러나,이 프로토콜에서, 우리는 동맥 폐색 동안 80 mmHg로의 근위 동맥압 유지 임상 연습에 허혈, 17 비록 인간과 설치류 사이의 적절한 근위부 동맥 압력을 구성하는 것에 차이가있을 수 있습니다.
쥐와 인간의 척수 혈관 및 담보 시스템은 6, 비슷 7 . 그러나 척수 허혈이 발생하는 종에 따라 결과가 다를 수 있다는 점을 할인해서는 안됩니다.
결론적으로, 연구자들은이 척수 허혈 모델을 쉽게 채택 할 수 있고 매우 재현성있는 결과를 얻을 수 있습니다. 또한 대동맥 폐색 시간을 수정하여 생성 된 적자의 정도를 변경할 수 있습니다. 따라서,이 모델은 흉 복부 대동맥 동맥류에 뒤 따르는 신경 학적 합병증의 근본적인 병태 생리학을 조사하고 이러한 합병증에 대한 신경 보호 전략의 개발을 허용하는 추가 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다. 이 연구는 한국 정부 연구 재단의 보조금 2012R1A1A3014010의 지원을 받았다.
Acknowledgments
저자는 인정하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
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