Summary
Это исследование демонстрирует методику создания минимально инвазивной и легко воспроизводимой модели ишемии спинного мозга у крыс. Различные степени моторного дефицита задней конечности можно получить, контролируя время окклюзии аорты.
Abstract
Ишемия спинного мозга является фатальным осложнением после операции аортальной хирургии торакоабдоминальной аорты. Исследователи могут исследовать стратегии профилактики и лечения этого осложнения с использованием экспериментальных моделей ишемии спинного мозга. Описанная здесь модель демонстрирует различную степень параплегии, которая связана с длиной окклюзии после окклюзии грудной аорты в модели ишемии спинного мозга крысы.
A 2-Fr. Катетер с баллонным наконечником продвигался через бедренную артерию в нисходящую грудную аорту до тех пор, пока наконечник катетера не был помещен в левую подключичную артерию у анестезированных самцов крыс Sprague-Dawley. Ишемия спинного мозга была вызвана раздуванием баллона с катетером. После установленного периода окклюзии (9, 10 или 11 минут) баллон дефлировали. Неврологическая оценка проводилась с использованием показателя дефицита моторного аппарата через 24 ч после операции, а спинной мозг собирали для гистопатологического исследования.
Jous_content "> Крысы, прошедшие через 9 минут окклюзии аорты, проявляли умеренное и обратимое моторное нарушение в задней конечности. Крысы, подвергшиеся 10-минутной окклюзии аорты, были представлены умеренной, но обратимой моторной недостаточностью. Крысы, подвергшиеся 11-минутной окклюзии аорты, показали полную и постоянную Паралич. Моторные нейроны в отделах спинного мозга были более сохранены у крыс, подвергнутых более короткой продолжительности окклюзии аорты.Исследователи могут достичь воспроизводимого дефицита моторного нерва после окклюзии грудной аорты с использованием этой модели ишемии спинного мозга.
Introduction
Параплегия является фатальным осложнением хирургии аортальной хирургии торакоабдоминальной аорты. Это происходит из-за травмы ишемии спинного мозга и реперфузии, которая возникает во время поперечного зажима и разжимания аорты. 1 Несколько стратегий, включая системную гипотермию и цереброспинальный дренаж, были введены для защиты спинного мозга, 2 , 3 , 4, но многие пациенты по-прежнему страдают от травмы.
Были введены несколько моделей ишемии спинного мозга животных для исследования его патогенеза и разработки защитных стратегий против травмы. В настоящем исследовании мы описываем модель крысы ишемии спинного мозга, основанную на методе Таиры и Марсалы. 5 Система спинного кровообращения у крыс очень похожа на сосудистую и коллатеральную систему спинного мозга у людей, хотя существуют некоторые различия в размерах иместо нахождения. 6 , 7 Таким образом, крыса является анатомически подходящим животным для использования в экспериментальной модели, исследующей патогенез, осложнения и лечение ишемии спинного мозга. Более того, эта модель ишемии спинного мозга производит надежную окклюзию аорты с минимальным вмешательством, используя окклюзию внутрисосудистого баллона грудной аорты.
В этом исследовании мы продемонстрировали, что эта крысиная модель ишемии спинного мозга индуцирует воспроизводимые моторные дефициты в задних конечностях, которые различаются по степени тяжести в зависимости от времени окклюзии аорты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был одобрен Институтом по уходу за животными и его использованием в больнице Университета Будана в Сеуле. Уход за животными и эксперименты проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Хирургическая подготовка
- Перед операцией промойте катетеры стерильным физиологическим раствором для обеспечения проходимости.
- Положите нагревательный слой на рабочий стол и прикройте стол стерильной драпировкой.
- Поместите мужчин крыс Sprague-Dawley (270-330 г) в акриловую коробку с 3,0% -4,0% изофлурана в 100% кислороде.
- Нанесите смазку на глаза крысы.
- Поместите крысу на рабочий стол в лежачее положение и поддерживайте анестезию с помощью маски для лица с непрерывным введением ингаляционного изофлурана (1,0% -2,5 об.%).
- Поместите ректальный зонд для контроля и поддержания температуры тела между 37,0-38,0 ° C.
2. Катетеризация костной артерии
- Аккуратно вытрите правую паховую область, используя бетадин и 70% этанол.
- Сделайте 2-сантиметровый горизонтальный разрез кожи, используя ножницы на правой паховой области.
- Используя ретрактор, выведите хирургическое поле.
- Вырезать бедренную артерию из окружающей вены и нерва. Изолируйте 1-сантиметровый участок артерии, используя изогнутые щипцы и затупленные щипцы.
- Используя черный шелковый шов 4.0, поместите свободную галстук на проксимальном и дистальном концах артерии, чтобы максимально увеличить экспозицию.
- Сделайте разрез на бедренную артерию с помощью микро-ножниц.
- Вставьте 2-Fr. Катетер с баллонным наконечником в бедренную артерию с использованием микронапряжений. Закрепите катетер на сосуде примерно на 1 см от головки катетера с проксимальной лигатурой и затем привяжите дистальную лигатуру.
3. Катетеризация каротидной артерии
- Скраб правой передней шейки, используя бетадИ 70% этанола, а затем сделать разрез кожи.
- Используя ретрактор, выведите хирургическое поле. Изолируйте 1-сантиметровый участок артерии и осторожно свяжите его с помощью шелкового шва как на проксимальном, так и на дистальном концах артерии, чтобы максимизировать экспозицию.
- Проколите сонную артерию, используя 24 г внутривенного катетера, и проведите проксимальный 1 см катетера к сердцу.
- Закрепите катетер проксимальной лигатурой, а затем завяжите дистальную лигатуру.
- Используя трехходовой кран, подключите дистальный конец катетера к заполненной физиологическим раствором микротрубке и внешнему резервуару.
4. Катетеризация хвостовой артерии
- Скраб вентральной области хвоста, используя бетадин и 70% этанола, и сделайте 2-сантиметровый разрез кожи.
- Вырезать хвостовую артерию из окружающих структур и изолировать 1 см участок артерии, используя изогнутые щипцы и затупленные щипцы.
- Используя черный шелковый шов 4.0, поместите свободнуюСвяжите как на проксимальном, так и на дистальном концах артерии, чтобы максимизировать экспозицию.
- Проколите хвостовую артерию с помощью 24-литрового внутривенного катетера и продвиньте катетер в артерию.
- Закрепите катетер на сосуде (примерно на 1 см от головки катетера) с проксимальной лигатурой и привяжите дистальную лигатуру.
- Подключите дистальную часть катетера к устройству контроля артериального давления.
5. Индукция ишемии спинного мозга
- После завершения катетеризации продвиньте 2 Fr. Катетер с баллонным наконечником в нисходящую грудную аорту, так что кончик катетера достигает левой подключичной артерии.
- Вставьте на глубину 10 см от места вставки.
- Внесите 150 единиц гепарина в концентрации 100 единиц / мл в каротидный катетер.
- Надуйте баллон с катетером 0,05 мл физиологического раствора.
- Одновременно слейте кровь во внешний контейнер для крови из cАроидной артерии для регулирования проксимального артериального давления до 80 мм рт.ст.
- Подключение системы мониторинга артериального давления для остального просвета 3-ходового запорного крана, и контролировать количество дренажа крови с измерением артериального давления.
- Подтвердите успех окклюзии аорты резким уменьшением и постоянной потерей дистального артериального давления.
- После окклюзии аорты 9, 10 или 11 минут выкачайте воздушный шар катетера Фогарти и повторно используйте слитую кровь.
6. Послеоперационный уход и неврологическая оценка
- Контролируя артериальное давление через хвостовую артерию, удалите катетеры из бедренной и сонной артерий и закройте раны шелковыми швами.
- После подтверждения того, что артериальное давление восстанавливается до нормального диапазона, удалите катетер из хвостовой артерии и закройте рану.
- После выздоровления от анестезии верните крысу в клетку.
- Оцените приветИ через 24 ч после операции с использованием индекса дефицита моторного масла ( таблица 1 ). Индекс моторного дефицита определяется как сумма балла по ходьбе и оценка рефлексии размещения / шага. Индекс дефицита двигателя 6 указывает максимальный дефицит.
7. Гистопатологическая оценка
- После неврологической оценки обезболивают крыс с помощью изофлурана, доставшегося маске, жертвуют их каркасной перфузией 100 мл гепаринизированного солевого раствора под анестезией и выносят спинной мозг. 8
- Вставьте участки шнура от уровня поясничного позвонка 3-5 в парафине.
- Пятнообразные поперечные срезы с гематоксилином и эозином (H & E).
- Наблюдайте за травмой моторного нейрона под микроскопом. 9
8. Статистический анализ
- Выполнение статистического анализа с использованием статистического пакета для социальных наук, версия 20.Icit-индекс трех групп сравнивался с использованием теста Крускала-Уоллиса, а затем U -критерий Манна-Уитни. Значение P <0,05 считалось статистически значимым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В течение периода ишемии спинного мозга окклюзию аорты проводили в течение 9 минут (n = 3), 10 минут (n = 3) или 11 минут (n = 3). Индекс моторного дефицита у крыс представлен в Таблице 2. Крысы, которые прошли 9 минут окклюзии аорты, показали умеренное и обратимое моторное нарушение в задней конечности. Крыс, подвергшихся 10-минутной окклюзии аорты, представлены с умеренным моторным дефицитом, но не полным параличом. Крысам, которые прошли 11 минут окклюзии, показали полный и постоянный паралич.
Репрезентативные фотографии секций спинного мозга, окрашенных H & E, показаны на рисунке 1 . Моторные нейроны в отделах спинного мозга были более сохранены у крыс, подвергнутых более короткой продолжительности окклюзии аорты.
Рисунок 1 . Гистологический экзаменСекция спинного мозга
Моторные нейроны были более сохранены у крыс, подвергнутых более короткой продолжительности окклюзии аорты (первоначальное увеличение, 200X). Масштабная шкала во всех изображениях = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Амбулация (ходьба с нижними конечностями) | Размещение / шаговый рефлекс |
| 0: нормальная (симметричная и скоординированная амбулатория) | 0: нормальный |
| 1: пальцы ноги под телом при ходьбе, но атаксия присутствует | 1: слабый |
| 2: костяшка | 2: отсутствие степпинга |
| 3: движение в нижних конечностях, но неспособное к суставам | |
| 4: нет движения, тащит нижние конечности |
Таблица 1. Оценка амбулации и размещения / шагового рефлекса.
| Время окклюзии аорты | Через 24 часа после операции |
| 9 мин (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 мин (n = 3) | 4 (4 - 4) |
| 11 мин (n = 3) | 5 (5-6) |
Таблица 2. Индекс дефицита электроэнергии. Значения представлены как медианный (межквартильный диапазон).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании мы продемонстрировали модель крысы ишемии спинного мозга, основанную на методе Таиры и Марсалы 5, которая индуцирует переменные степени моторного дефицита в задней конечности в зависимости от времени окклюзии аорты.
Продолжительность окклюзии аорты может повлиять на степень дефицита двигателя. Если время окклюзии аорты больше, моторный дефицит становится более серьезным. Таким образом, исследователи могут достичь определенной степени моторного дефицита, контролируя время окклюзии аорты в этой модели.
Наша модель включает лигирование общей сонной артерии и бедренной артерии, а также возможность неврологического дефицита, возникающего в результате перевязки этих артерий, является потенциальной проблемой. Однако у крыс есть эффективные залоговые сетевые системы. Таким образом, когда сонная артерия или бедренная артерия лигируются, достаточный кровоток может быть обеспечен обширной сетью обеспечения. Односторонние кароти D артериальная окклюзия, как сообщается, производит лишь незначительные эффекты на мозговой кровоток. 10 , 11 Хотя односторонняя окклюзия сонной артерии может вызвать инсульт у крыс, это происходит только в сочетании с тяжелой системной гипоксией. 12 Во время нашего эксперимента не наблюдалось системной гипоксии, и ни у одной из крыс не было неврологического дефицита, указывающего на церебральный инфаркт. Кроме того, когда бедренная артерия крыс лигируется, коллатеральная циркуляция обеспечивает достаточный приток крови к мышцам задней конечности. 13 Эта коллатеральная циркуляция обеспечивает достаточный приток крови к мышцам задней конечности, когда они находятся в состоянии покоя, но не обеспечивает достаточного потока во время физических упражнений. 14
Кроме того, проксимальное артериальное давление во время ишемии спинного мозга влияет на развитие моторного дефицита. Согласно предыдущему исследованию,Ref "> 5, побочное кровоснабжение почти исчезло при проксимальном артериальном давлении 40 мм рт.ст. во время аортального зажима в модели ишемии позвоночника крысы. Таким образом, последующие исследования поддерживали проксимальное артериальное давление при 40 мм рт.ст. во время ишемии спинного мозга в их моделях спинного мозга крысы шнур ишемия. 9, 15, 16 , однако, в этом протоколе, мы поддерживали проксимальное артериальное давление при 80 мм ртутного столба в течение аорты окклюзии , потому что это рекомендуются , чтобы поддерживать среднее артериальное давление на 80 мм ртутного столба или более для сохранения адекватной спинного мозга перфузии во время спинного мозга Ишемия в клинической практике 17, хотя может быть разница в том, что представляет собой адекватное проксимальное артериальное давление между людьми и грызунами.
Сосудистая сосудистая система и коллатеральная система крыс и людей сходны, 6 , 7, что делает крыс подходящим выбором для экспериментальной модели ишемии спинного мозга. Однако не следует сбрасывать со счетов, что результаты могут быть разными в зависимости от вида, в котором происходит ишемия спинного мозга.
В заключение, исследователи могут легко принять эту модель крысы ишемии спинного мозга и получить очень воспроизводимые результаты. Кроме того, они могут модифицировать время окклюзии аорты, чтобы варьировать степень производимого моторного дефицита. Таким образом, эта модель может способствовать дальнейшим исследованиям, изучающим лежащую в основе патофизиологию неврологических осложнений после аневризмы торакоабдоминальной аорты, и позволяет разрабатывать нейропротективные стратегии против этих осложнений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов. Эта работа была поддержана грантом 2012R1A1A3014010 от Национального исследовательского фонда правительства Кореи.
Acknowledgments
У авторов нет подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S.
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
