Summary
Este estudo demonstra a técnica para fazer um modelo minimamente invasivo e facilmente reprodutível de isquemia da medula espinhal em ratos. Vários graus de déficit motor do membro traseiro podem ser produzidos controlando o tempo de oclusão aórtica.
Abstract
A isquemia da medula espinal é uma complicação fatal após a cirurgia de aneurisma aórtico toracoabdominal. Os pesquisadores podem investigar as estratégias para prevenir e tratar esta complicação usando modelos experimentais de isquemia da medula espinhal. O modelo aqui descrito demonstra vários graus de paraplegia que se relacionam com o comprimento da oclusão após a oclusão da aorta torácica em um modelo de isquemia da medula espinhal do rato.
A 2-Fr. O cateter com ponta de balão avançou através da artéria femoral para a aorta torácica descendente até a ponta do cateter foi colocada na artéria subclávia esquerda em ratos Sprague-Dawley machos anestesiados. A isquemia da medula espinal foi induzida por inflar o balão do cateter. Após um período definido de oclusão (9, 10 ou 11 min), o balão foi desinflado. A avaliação neurológica foi realizada utilizando o índice de déficit motor às 24 h após a cirurgia e a medula espinhal foi colhida para exame histopatológico.
Jove_content "> Os ratos que sofreram 9 min de oclusão aórtica apresentaram comprometimento motor leve e reversível no membro posterior. Os ratos submetidos a 10 min de oclusão aórtica apresentaram comprometimento motor moderado mas reversível. Os ratos submetidos a 11 min de oclusão aórtica exibida completa e persistente Paralisia. Os neurônios motores nas seções da medula espinhal foram mais preservados em ratos sujeitos a menor duração da oclusão aórtica.Os pesquisadores podem alcançar um déficit motor reprodutor traseiro após a oclusão da aorta torácica usando este modelo de isquemia da medula espinhal.
Introduction
A paraplégia é uma complicação fatal da cirurgia de aneurisma aórtico toracoabdominal. Isso resulta da lesão da isquemia-reperfusão da medula espinhal que ocorre durante o aperto cruzado e o desbloqueio da aorta. 1 Várias estratégias, incluindo hipotermia sistêmica e drenagem cefalorraquidiana, foram introduzidas para proteger a medula espinhal, 2 , 3 , 4 , mas muitos pacientes permanecem afetados pela lesão.
Vários modelos de isquemia da medula espinhal animal foram introduzidos para investigar sua patogênese e desenvolver estratégias de proteção contra a lesão. No presente estudo, descrevemos um modelo de rato da isquemia da medula espinhal com base no método de Taira e Marsala. 5 O sistema de circulação espinhal em ratos é muito semelhante ao sistema vascular e colateral da medula espinhal em seres humanos, embora existam algumas diferenças no tamanho elocalização. 6 , 7 Assim, um rato é um animal anatomicamente adequado para utilizar para um modelo experimental que investiga a patogênese, complicações e tratamento da isquemia da medula espinhal. Além disso, este modelo de isquemia da medula espinhal produz oclusão aórtica confiável com intervenção mínima utilizando uma oclusão intravascular do balão da aorta torácica.
Neste estudo, demonstramos que este modelo de rato da isquemia da medula espinhal induz déficits motor reproduzíveis nos membros traseiros que variam em gravidade dependendo do tempo de oclusão aórtica.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Nacional de Seul, Hospital Bundang. Os cuidados com os animais e os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia Nacional de Institutos de Saúde dos Estados Unidos para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Preparação cirúrgica
- Antes da cirurgia, elimine os cateteres com solução salina estéril para garantir a permeabilidade.
- Coloque um cobertor de aquecimento na mesa de operação e cubra a mesa com uma camada estéril.
- Coloque ratos ratos Sprague-Dawley (270-330 g) em uma caixa acrílica com 3,0% -4,0% de isoflurano em 100% de oxigênio.
- Aplique lubrificante nos olhos do rato.
- Coloque o rato na mesa de operação na posição supina, e mantenha a anestesia usando uma máscara facial com administração contínua de isoflurano inalado (1,0% -2,5% vol).
- Coloque uma sonda retal para monitorar e manter a temperatura corporal entre 37,0-38,0 ° C.
2. Cateterização da artéria femoral
- Lavar suavemente a área inguinal direita usando Betadine e 70% de etanol.
- Faça uma incisão horizontal da pele de 2 cm usando uma tesoura na área inguinal direita.
- Usando um retractor, exponha o campo cirúrgico.
- Dissecar a artéria femoral da veia circundante e do nervo. Isolar uma seção de 1 cm da artéria usando fórceps curvados e fórceps embotados.
- Usando uma sutura de seda preto 4,0, coloque uma gravata solta nas extremidades proximal e distal da artéria para maximizar a exposição.
- Faça uma incisão na artéria femoral usando micro-tesoura.
- Insira um 2-Fr. Cateter com ponta de balão na artéria femoral usando micro-fórceps. Fixe o cateter ao vaso a cerca de 1 cm da cabeça do cateter com a ligadura proximal e, em seguida, amarre a ligadura distal.
3. Cateterização da artéria carótida
- Esfolie o pescoço anterior direito usando betadEI e 70% de etanol e, em seguida, faça uma incisão na pele.
- Usando um retractor, exponha o campo cirúrgico. Isolar uma seção de 1 cm da artéria e amarrá-la com uma sutura de seda nas extremidades proximal e distal da artéria para maximizar a exposição.
- Puncionar a artéria carótida usando um cateter intravenoso de 24 G e avançar o 1 cm proximal do cateter para o coração.
- Fixe o cateter com a ligadura proximal e, em seguida, amarre a ligadura distal.
- Usando uma torneira de 3 vias, conecte a extremidade distal do cateter ao micro-tubo com solução salina e ao reservatório externo.
4. Cateterização da artéria caudal
- Esfregue a área ventral da cauda com betadina e 70% de etanol e faça uma incisão da pele de 2 cm.
- Dissecar a artéria da cauda das estruturas circundantes e isolar uma seção de 1 cm da artéria usando fórceps curvados e fórceps embotados.
- Usando uma sutura de seda preto 4.0, solteAmarre as extremidades proximal e distal da artéria para maximizar a exposição.
- Puntar a artéria da cauda usando um cateter intravenoso 24 G e avançar o cateter para a artéria.
- Fixe o cateter ao vaso (cerca de 1 cm da cabeça do cateter) com a ligadura proximal e amarre a ligadura distal.
- Conecte a parte distal do cateter ao dispositivo de monitoramento da pressão arterial.
5. Indução da isquemia da medula espinhal
- Após a conclusão do cateterismo, avance o 2 Fr. Cateter com ponta de balão na aorta torácica descendente de modo que a ponta do cateter atinja a artéria subclávia esquerda.
- Inserir a uma profundidade de 10 cm do local de inserção.
- Injectar 150 unidades de heparina a uma concentração de 100 unidades / mL no cateter carotídeo.
- Inflar o balão do cateter com 0,05 mL de solução salina.
- Simultaneamente, drenar o sangue para o recipiente de sangue externo do cArtéria de artéria para regular a pressão arterial proximal para 80 mmHg.
- Conecte o sistema de monitoramento da pressão arterial ao lúmen restante do galo de parada de 3 vias e controle a quantidade de drenagem sangüínea com monitoramento da pressão arterial.
- Confirme o sucesso da oclusão aórtica por uma diminuição abrupta e perda contínua de pressão arterial distal.
- Após a oclusão aórtica de 9, 10 ou 11 min, esvazie o balão do cateter Fogarty e reinfuse o sangue drenado.
6. Cuidados Pós-cirúrgicos e Avaliação Neurológica
- Ao monitorar a pressão arterial através da artéria da cauda, remova os cateteres das artérias femorais e carótidas e feche as feridas com suturas de seda.
- Depois de confirmar que a pressão arterial é recuperada para o intervalo normal, retire o cateter da artéria da cauda e feche a ferida.
- Após a recuperação da anestesia, devolva o rato à sua gaiola.
- Avalie oiFunção do motor do membro e nas 24 h após a cirurgia com o índice de déficit motor ( Tabela 1 ). O índice de déficit motor é definido como a soma do escore de ambulação e o escore reflexo de colocação / passo. Um índice de déficit motor de 6 indica o déficit máximo.
7. Avaliação histopatológica
- Após a avaliação neurológica, anestesiar ratos com isoflurano administrado com máscara, sacrificá-los por perfusão transcardial com 100 mL de solução salina heparinizada sob anestesia e extrair a medula espinhal. 8
- Incorporar as seções do cordão do nível das vértebras lombares 3-5 na parafina.
- Mancha secções transversais com hematoxilina e eosina (H & E).
- Observe a lesão do neurônio motor sob um microscópio. 9
8. Análise estatística
- Execute análise estatística utilizando o Pacote Estatístico para a Ciência Social, versão 20. O motor defO índice icit dos três grupos foi comparado usando o teste de Kruskal-Wallis, seguido de um teste U de Mann-Whitney. Um valor de P <0,05 foi considerado estatisticamente significante.
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Representative Results
Durante um período de isquemia da medula espinal, a oclusão aórtica foi realizada durante 9 minutos (n = 3), 10 min (n = 3) ou 11 min (n = 3). O índice de déficit motor em ratos é apresentado na Tabela 2. Os ratos submetidos a 9 min de oclusão aórtica mostraram comprometimento motor leve e reversível no membro traseiro. Ratos submetidos a 10 min de oclusão aórtica apresentaram déficit motor moderado, mas não paralisia completa. Os ratos que sofreram 11 minutos de tempo de oclusão apresentaram paralisia completa e persistente.
Fotografias representativas das secções da medula espinhal coradas com H & E são mostradas na Figura 1 . Os neurônios motores nas seções da medula espinhal foram mais preservados em ratos submetidos a uma menor duração da oclusão aórtica.
Figura 1 . Exame histológicoNas secções da medula espinhal
Os neurônios motores foram mais preservados em ratos submetidos a uma menor duração da oclusão aórtica (ampliação original, 200X). Barra de escala em todas as imagens = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ambulação (andar com extremidades inferiores) | Placa de reflexão |
| 0: normal (ambulação simétrica e coordenada) | 0: normal |
| 1: toes plana abaixo do corpo ao caminhar, mas ataxia presente | 1: fraco |
| 2: caminhar | 2: não pisar |
| 3: movimento nas extremidades inferiores, mas incapaz de caminhar | |
| 4: nenhum movimento, arrasa as extremidades inferiores |
Tabela 1. Avaliação da Ambulação e Reflexão de Posicionamento / Passo.
| Tempo de oclusão aórtica | 24 h após a cirurgia |
| 9 min (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 min (n = 3) | 4 (4 - 4) |
| 11 min (n = 3) | 5 (5 - 6) |
Tabela 2. Índice de Défice Motorizado. Os valores são apresentados como médios (intervalo intercuartil).
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Discussion
No presente estudo, demonstramos um modelo de rato da isquemia da medula espinhal com base no método 5 de Taira e Marsala que induz graus variáveis de déficit motor no membro posterior dependendo do tempo de oclusão aórtica.
O comprimento da oclusão aórtica pode afetar o grau de déficit motor. Se o tempo de oclusão aórtica for maior, o déficit do motor fica mais severo. Assim, os pesquisadores podem atingir um certo grau de déficit motor ao controlar o tempo de oclusão aórtica neste modelo.
Nosso modelo envolve a ligação da artéria carótida comum e da artéria femoral, e a possibilidade de déficits neurológicos resultantes da ligação dessas artérias é uma preocupação potencial. No entanto, os ratos possuem sistemas de rede colateral eficientes. Assim, quando a artéria carótida ou a artéria femoral é ligada, o fluxo sanguíneo suficiente pode ser fornecido pela extensa rede colateral. Caroti unilateral A oclusão da arteria é relatada para produzir apenas efeitos menores no fluxo sangüíneo cerebral. 10 , 11 Embora a oclusão unilateral da artéria carótida possa produzir acidente vascular cerebral em ratos, isso ocorre somente quando em combinação com hipoxia sistêmica grave. 12 Durante o nosso experimento, não ocorreu hipoxia sistêmica e nenhum dos ratos apresentou déficits neurológicos sugestivos de infarto cerebral. Além disso, quando a artéria femoral dos ratos é ligada, a circulação colateral fornece fluxo sanguíneo suficiente para os músculos do membro traseiro. 13 Esta circulação colateral fornece fluxo sanguíneo suficiente para os músculos do membro traseiro quando estão em repouso, mas não fornece fluxo suficiente durante o exercício. 14
Além disso, a pressão arterial proximal durante a isquemia da medula espinhal afeta o desenvolvimento de déficits motores. De acordo com um estudo anterior,O fornecimento colateral de sangue quase desapareceu na pressão arterial proximal de 40 mmHg durante o aperto aórtico em um modelo de isquemia da coluna vertebral. Assim, estudos subsequentes mantiveram a pressão arterial proximal a 40 mmHg durante a isquemia da medula espinhal em seus modelos de raça do rato Isquemia do cordão 9 , 15 , 16 No entanto, neste protocolo, mantivemos a pressão arterial proximal a 80 mmHg durante a oclusão aórtica, pois recomenda-se manter a pressão arterial média com 80 mmHg ou mais para preservar a perfusão adequada da medula espinhal durante a medula espinhal Isquemia na prática clínica 17 , embora possa haver uma diferença no que constitui uma pressão arterial proximal adequada entre humanos e roedores.
A vasculatura da medula espinhal e o sistema colateral de ratos e humanos são semelhantes 6 , 7, o que torna os ratos uma escolha apropriada para um modelo experimental de isquemia da medula espinhal. No entanto, não deve ser descontado que os resultados podem ser diferentes de acordo com a espécie em que ocorre isquemia da medula espinhal.
Em conclusão, os pesquisadores podem facilmente adotar esse modelo de ratos da isquemia da medula espinhal e obter achados altamente reprodutíveis. Além disso, eles podem modificar o tempo de oclusão aórtica para variar o grau de déficit motor produzido. Como tal, este modelo pode facilitar estudos adicionais que examinam a fisiopatologia subjacente das complicações neurológicas após o aneurisma aórtico toracoabdominal e permitem o desenvolvimento de estratégias neuroprotetivas contra essas complicações.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes. Este trabalho foi apoiado pela concessão 2012R1A1A3014010 da Fundação Nacional de Pesquisa do Governo coreano.
Acknowledgments
Os autores não têm reconhecimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
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