Summary
Este estudio demuestra la técnica para hacer un modelo mínimamente invasivo y fácilmente reproducible de la isquemia de la médula espinal en ratas. Se pueden producir varios grados de déficit motor de la extremidad posterior controlando el tiempo de oclusión aórtica.
Abstract
La isquemia de la médula espinal es una complicación fatal después de la cirugía de aneurisma aórtico toracoabdominal. Los investigadores pueden investigar las estrategias para prevenir y tratar esta complicación utilizando modelos experimentales de isquemia de la médula espinal. El modelo descrito aquí demuestra los grados variables de la paraplegia que se relacionan con la longitud de la oclusión después de la oclusión aórtica torácica en un modelo de la isquemia de la médula espinal de la rata.
A 2-Fr. Se hizo avanzar el catéter con punta de globo a través de la arteria femoral en la aorta torácica descendente hasta que la punta del catéter se colocó en la arteria subclavia izquierda en ratas macho Sprague-Dawley anestesiadas. Se indujo isquemia de la médula espinal inflando el balón del catéter. Después de un periodo fijo de oclusión (9, 10 ó 11 min), se desinfla el balón. La evaluación neurológica se realizó utilizando el índice de déficit motor a las 24 h después de la cirugía, y la médula espinal fue cosechada para el examen histopatológico.
Las ratas a las que se les practicó 9 min de oclusión aórtica mostraron alteración motora leve y reversible en la extremidad posterior Las ratas sometidas a 10 minutos de oclusión aórtica presentaron un deterioro motor moderado pero reversible Las ratas sometidas a 11 minutos de oclusión aórtica mostraron completa y persistente Las neuronas motoras en las secciones de la médula espinal fueron más conservadas en ratas sometidas a una menor duración de la oclusión aórtica.Los investigadores pueden lograr un déficit motor reproducible después de la oclusión aórtica torácica utilizando este modelo de isquemia de la médula espinal.
Introduction
La paraplégia es una complicación fatal de la cirugía de aneurisma aórtico toracoabdominal. Es el resultado de una lesión de isquemia-reperfusión de la médula espinal que ocurre durante el pinzamiento cruzado y el desenclavamiento de la aorta. 1 Varias estrategias incluyendo la hipotermia sistémica y drenaje cerebroespinal se han introducido para proteger la médula espinal, 2 , 3 , 4 , pero muchos pacientes siguen afectados por la lesión.
Se han introducido varios modelos de isquemia de la médula espinal animal para investigar su patogénesis y diseñar estrategias protectoras contra la lesión. En el presente estudio, esbozamos un modelo de rata de la isquemia de la médula espinal basado en el método de Taira y Marsala. 5 El sistema de circulación espinal en ratas es muy similar al sistema vascular y colateral de la médula espinal en humanos, aunque hay algunas diferencias en el tamaño yubicación. 6 , 7 Por lo tanto, una rata es un animal anatómicamente adecuado para utilizar en un modelo experimental que investiga la patogénesis, las complicaciones y el tratamiento de la isquemia de la médula espinal. Además, este modelo de isquemia de la médula espinal produce una oclusión aórtica confiable con mínima intervención mediante la utilización de una oclusión intravascular de balón de la aorta torácica.
En este estudio, hemos demostrado que este modelo de rata de la isquemia de la médula espinal induce déficits motores repro- ducibles en las extremidades posteriores que varían en severidad dependiendo del tiempo de oclusión aórtica.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional de Seúl en el Hospital Bundang. El cuidado de los animales y los experimentos se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de los Estados Unidos de la Guía de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Preparación quirúrgica
- Antes de la cirugía, lave los catéteres con solución salina estéril para asegurar la permeabilidad.
- Coloque una manta de calefacción en la mesa de operaciones y cubra la mesa con un paño estéril.
- Colocar ratas macho Sprague-Dawley (270-330 g) en una caja de acrílico con 3,0% -4,0% de isoflurano en oxígeno al 100%.
- Aplique lubricante a los ojos de la rata.
- Colocar la rata sobre la mesa quirúrgica en decúbito supino y mantener la anestesia con una máscara facial con administración continua de isoflurano inhalado (1,0% -2,5% en volumen).
- Coloque una sonda rectal para monitorizar y mantener la temperatura corporal entre 37,0-38,0 ° C.
2. Cateterización de la arteria femoral
- Frote suavemente el área inguinal derecha usando Betadine y etanol al 70%.
- Haga una incisión cutánea horizontal de 2 cm usando tijeras en el área inguinal derecha.
- Usando un retractor, exponga el campo quirúrgico.
- Disecar la arteria femoral de la vena y el nervio circundantes. Aislar una sección de 1 cm de la arteria con fórceps curvos y fórceps embotados.
- Utilizando una sutura de seda negra 4.0, coloque una corbata suelta en los extremos proximal y distal de la arteria para maximizar la exposición.
- Haga una incisión en la arteria femoral con micro-tijeras.
- Inserte un 2-Fr. Con balón en la arteria femoral usando micro-fórceps. Asegure el catéter al vaso aproximadamente a 1 cm de la cabeza del catéter con la ligadura proximal, y luego ate la ligadura distal.
3. Cateterización de la arteria carótida
- Frote el cuello anterior derecho usando betadY 70% de etanol, y luego hacer una incisión en la piel.
- Usando un retractor, exponga el campo quirúrgico. Aislar una sección de 1 cm de la arteria y atarla sueltamente utilizando una sutura de seda en los extremos proximal y distal de la arteria para maximizar la exposición.
- Perfore la arteria carótida usando un catéter intravenoso de 24 G, y avance el proximal 1 cm del catéter hacia el corazón.
- Asegurar el catéter con la ligadura proximal, y luego atar la ligadura distal.
- Usando una llave de paso de 3 vías, conecte el extremo distal del catéter al micro-tubo relleno de solución salina y al depósito externo.
4. Cateterización de la Arteria de la Cola
- Frote la zona ventral de la cola con betadina y etanol al 70%, y realice una incisión cutánea de 2 cm.
- Disecar la arteria de la cola de las estructuras circundantes y aislar una sección de 1 cm de la arteria con pinzas curvas y fórceps rompió.
- Usando una sutura negra de seda 4.0, coloque unaAtar en los extremos proximal y distal de la arteria para maximizar la exposición.
- Perfore la arteria de la cola usando un catéter intravenoso de 24 G, y avance el catéter hacia la arteria.
- Asegurar el catéter en el vaso (aproximadamente 1 cm desde la cabeza del catéter) con la ligadura proximal, y atar la ligadura distal.
- Conecte la parte distal del catéter al dispositivo de monitorización de la presión arterial.
5. Inducción de la Isquemia de la Médula Espinal
- Una vez completada la cateterización, avance el 2 Fr. Con balón en la aorta torácica descendente de modo que la punta del catéter alcance la arteria subclavia izquierda.
- Insertar a una profundidad de 10 cm del sitio de inserción.
- Inyectar 150 unidades de heparina a una concentración de 100 unidades / ml en el catéter carotídeo.
- Inflar el globo del catéter con 0.05 ml de solución salina.
- Simultáneamente, drene la sangre en el recipiente de sangre externa de la cArotida para regular la presión arterial proximal a 80 mmHg.
- Conecte el sistema de control de la presión arterial al lumen restante de la válvula de parada de 3 vías y controle la cantidad de drenaje de sangre con el monitoreo de la presión arterial.
- Confirmar el éxito de la oclusión aórtica por una disminución abrupta y la pérdida continua de la presión arterial distal.
- Después de una oclusión aórtica de 9, 10 o 11 min, desinfle el globo del catéter Fogarty, y reinfuse la sangre drenada.
6. Cuidados Postquirúrgicos y Evaluación Neurológica
- Mientras se controla la presión arterial a través de la arteria de la cola, retire los catéteres de las arterias femoral y carótida y cierre las heridas con suturas de seda.
- Después de confirmar que la presión arterial se recupera al rango normal, retire el catéter de la arteria de cola y cierre la herida.
- Después de la recuperación de la anestesia, devolver la rata a su jaula.
- Evaluar holaY la función motora de la extremidad a las 24 h después de la cirugía usando el índice de déficit motriz ( Tabla 1 ). El índice de déficit motor se define como la suma de la puntuación de la ambulación y la puntuación del reflejo de colocación / escalonamiento. Un índice de déficit motor de 6 indica el déficit máximo.
7. Evaluación histopatológica
- Después de la evaluación neurológica, anestesiar las ratas con isoflurano administrado con máscara, sacrificarlas por perfusión transcardial con 100 ml de solución salina heparinizada bajo anestesia y extraer la médula espinal. 8
- Incruste las secciones del cordón del nivel de las vértebras lumbares 3-5 en parafina.
- Mancha las secciones transversales con hematoxilina y eosina (H & E).
- Observe la lesión de la motoneurona bajo un microscopio. 9
8. Análisis estadístico
- Realizar el análisis estadístico usando el Paquete Estadístico para la versión 20 de las Ciencias Sociales. El motor defIcit índice de los tres grupos se comparó utilizando el Kruskal-Wallis prueba, seguido de un Mann-Whitney U- prueba. Un valor P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.
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Representative Results
Durante un período de isquemia de la médula espinal, la oclusión aórtica se realizó durante 9 min (n = 3), 10 min (n = 3), o 11 min (n = 3). El índice de déficit motor en ratas se presenta en la Tabla 2. Las ratas que sufrieron 9 min de oclusión aórtica mostraron un deterioro leve y reversible del motor en la extremidad posterior. Las ratas sometidas a 10 min de oclusión aórtica presentaron déficit motor moderado, pero no parálisis completa. Las ratas que se sometieron a 11 minutos de tiempo de oclusión mostraron una parálisis completa y persistente.
En la Figura 1 se muestran fotografías representativas de secciones de la médula espinal teñidas con H & E. Las neuronas motoras en las secciones de la médula espinal fueron más conservadas en ratas sometidas a una menor duración de la oclusión aórtica.
Figura 1 . Examen histológicoCión de las secciones de la médula espinal
Las neuronas motoras estaban más conservadas en ratas sometidas a una menor duración de la oclusión aórtica (aumento original, 200X). Barra de escala en todas las imágenes = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ambulación (caminar con las extremidades inferiores) | Reflejo de colocación / retroceso |
| 0: normal (ambulación simétrica y coordinada) | 0: normal |
| 1: dedos de los pies planos bajo el cuerpo al caminar pero ataxia presente | 1: débil |
| 2: caminar con los nudillos | 2: sin escalonamiento |
| 3: movimiento en las extremidades inferiores pero incapaz de moverse con los nudillos | |
| 4: sin movimiento, arrastra las extremidades inferiores |
Tabla 1. Evaluación de la Ambulación y el Reflejo de Colocación / Pisada.
| Tiempo de oclusión aórtica | 24 h después de la cirugía |
| 9 min (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 min (n = 3) | 4 (4 - 4) |
| 11 min (n = 3) | 5 (5 - 6) |
Tabla 2. Índice de Déficit Motor. Los valores se presentan como mediana (rango intercuartílico).
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Discussion
En el presente estudio, hemos demostrado un modelo de rata de isquemia medular basado en el método de Taira y Marsala 5 que induce grados variables de déficit motor en la extremidad posterior en función del tiempo de oclusión aórtica.
La longitud de la oclusión aórtica puede afectar el grado de déficit motor. Si el tiempo de oclusión aórtica es más largo, el déficit motor se vuelve más grave. Así, los investigadores pueden lograr un cierto grado de déficit motor controlando el tiempo de oclusión aórtica en este modelo.
Nuestro modelo implica la ligadura de la arteria carótida común y la arteria femoral, y la posibilidad de déficits neurológicos resultantes de la ligadura de estas arterias es una preocupación potencial. Sin embargo, las ratas tienen sistemas eficaces de red colateral. Por lo tanto, cuando la arteria carótida o la arteria femoral está ligada, el flujo sanguíneo suficiente puede ser proporcionado por la extensa red colateral. Carot unilateral Se dice que la oclusión de la arteria sólo produce efectos menores en el flujo sanguíneo cerebral. 10, 11 Aunque oclusión de la arteria carótida unilateral puede producir accidente cerebrovascular en ratas, esto ocurre sólo cuando en combinación con la hipoxia sistémica grave. 12 Durante el experimento, sin hipoxia sistémica ocurrieron y ninguna de las ratas presentó con déficits neurológicos sugestivos de infarto cerebral. Además, cuando la arteria femoral de las ratas está ligada, la circulación colateral proporciona suficiente flujo sanguíneo a los músculos de las extremidades posteriores. 13 Esta circulación colateral proporciona suficiente flujo de sangre a los músculos de las extremidades traseras cuando están en reposo, pero no proporciona suficiente flujo durante el ejercicio. 14
Además, la presión arterial proximal durante la isquemia de la médula espinal afecta el desarrollo de déficits motores. Según un estudio previo,El suministro de sangre colateral casi desapareció a la presión arterial proximal de 40 mmHg durante el pinzamiento aórtico en un modelo de isquemia espinal de rata, por lo que los estudios subsiguientes mantuvieron la presión arterial proximal a 40 mmHg durante la isquemia medular en sus modelos de espina dorsal de rata cable de isquemia. 9, 15, 16 Sin embargo, en este protocolo, mantuvimos la presión arterial proximal a 80 mmHg durante la oclusión aórtica porque se recomienda para mantener la presión arterial media en 80 mmHg o mayores para preservar adecuada perfusión de la médula espinal durante la médula espinal Isquemia en la práctica clínica 17 , aunque podría haber una diferencia en lo que constituye una presión arterial proximal adecuada entre humanos y roedores.
La vasculatura de la médula espinal y el sistema colateral de ratas y seres humanos son similares, 6 , 7, lo que hace que las ratas sean una elección apropiada para un modelo experimental de isquemia de la médula espinal. Sin embargo, no debe descartarse que los resultados pueden ser diferentes de acuerdo con la especie en la que se produce la isquemia de la médula espinal.
En conclusión, los investigadores pueden adoptar fácilmente este modelo de rata de la isquemia de la médula espinal y lograr resultados altamente reproducibles. Además, pueden modificar el tiempo de oclusión aórtica para variar el grado de déficit motor producido. Como tal, este modelo puede facilitar estudios adicionales que examinan la fisiopatología subyacente de las complicaciones neurológicas después del aneurisma aórtico toracoabdominal, y permiten el desarrollo de estrategias neuroprotectoras contra estas complicaciones.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia. Este trabajo fue apoyado por la subvención 2012R1A1A3014010 de la Fundación Nacional de Investigación del Gobierno de Corea.
Acknowledgments
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
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