Summary
Bu çalışma sıçanlarda spinal kord iskemisinin minimal invaziv ve kolayca tekrarlanabilir bir model haline getirme tekniğini göstermektedir. Arka ekstremite motor defisitinin çeşitli dereceleri, aort kapanma zamanını kontrol ederek üretilebilir.
Abstract
Torakoabdominal aort anevrizması cerrahisini takiben omurilik iskemisi ölümcül bir komplikasyondur. Araştırmacılar, spinal kord iskemisinin deneysel modellerini kullanarak bu komplikasyonu önleme ve tedavi stratejilerini araştırabilir. Burada açıklanan model, sıçan omurilik iskemi modelinde torakal aortik tıkanmayı takiben oklüzyonun uzunluğuyla ilişkili değişik derecelerde paraplejiyi göstermektedir.
2-Fr. Balon uçlu kateter, anestezi altındaki erkek Sprague-Dawley sıçanlarında kateter ucu sol subklavyen artere yerleştirilinceye kadar, femoral arterden inen torasik aorta doğru ilerletildi. Omurilik iskemisi, kateter balonu şişirilerek indüklendi. Belirli bir oklüzyon periyodundan sonra (9, 10 veya 11 dakika), balon deflate edildi. Nörolojik değerlendirme ameliyattan 24 saat sonra motor defisit indeksi kullanılarak yapıldı ve spinal kord histopatolojik muayene için hasat edildi.
9 dk aortik oklüzyon geçiren sıçanlar arka bacakta hafif ve geri dönüşümlü motor bozukluklar gösterdi 10 dk aortik oklüzyona maruz kalan sıçanlar, ılımlı fakat tersinir motor bozukluk ile sunuldu 11 dk aortik oklüzyona maruz kalan sıçanlar tam ve kalıcı olarak sergilendi Felç omurilik bölümlerindeki motor nöronlar, aort kapanması süresine kısa süren sıçanlarda daha fazla korunmuştur.Araştırmacılar, omurilik iskemi modelini kullanarak torasik aortik tıkanmayı takiben tekrarlanabilir bir arka bacak motoru eksikliği elde edebiliyorlar.
Introduction
Parapleji torakoabdominal aort anevrizmasının cerrahi tedavisinde ölümcül bir komplikasyondur. Aortun çapraz sıkıştırılması ve açılması sırasında ortaya çıkan spinal kord iskemi-reperfüzyon hasarından kaynaklanır. Sistemik hipotermi ve beyin-omurilik drenaj dahil 1 Çeşitli stratejiler 2, 3, 4 omuriliği korumak için getirilmiştir ancak birçok hastada yaralanma etkilenir kalır.
Patogenezini araştırmak ve yaralanmaya karşı koruyucu stratejiler tasarlamak için birçok hayvan spinal kord iskemi modeli kullanılmıştır. Bu çalışmada, Taira ve Marsala yöntemine dayanan omurilik iskemisinin sıçan modelini özetledik. 5 Sıçanlardaki omurilik sirkülasyon sistemi, insanlardaki omurilik vasküler ve kollateral sistemine çok benzer, ancak boyutta bazı farklılıklar vardır veyer. 6 , 7 Dolayısıyla sıçan, spinal kord iskemisinin patogenezini, komplikasyonlarını ve tedavisini araştıran deneysel bir model için kullanılacak anatomik olarak uygun bir hayvandır. Dahası, bu omurilik iskemi modeli, torasik aortanın intravasküler balon oklüzyonunu kullanarak minimal müdahale ile güvenilir aortik oklüzyon üretir.
Bu çalışmada, omurilik iskemisinin bu sıçan modelinin aort kapanma zamanına bağlı olarak şiddeti değişen arka ekstremitede tekrarlanabilir motor defisitleri indüklediğini göstermiştik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol Seul Ulusal Üniversitesi Bundang Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Hayvan bakımı ve deneyleri, Birleşik Devletler Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Rehberine göre yürütülmüştür.
1. Cerrahi Hazırlık
- Ameliyat öncesi açıklığın sağlanması için kateteri steril tuzlu su ile yıkayın.
- Ameliyat masasına bir ısıtma battaniyesi koyun ve masayı steril bir örtüyle örtün.
- Erkek Sprague-Dawley sıçanını (270-330 g)% 3.0 oksijen içerisinde% 3.0 -% 4.0 izofluran içeren bir akrilik kutuya yerleştirin.
- Sıçanın gözlerine yağ uygulayın.
- Fareyi sırtüstü pozisyonda ameliyathaneye yerleştirin ve inhale izofluran sürekli olarak uygulandığında yüz maskesi kullanarak anestezi uygulayın (% 1.0 -2.5 hacim%).
- Vücut sıcaklığını 37.0-38.0 ° C arasında izlemek ve muhafaza etmek için bir rektal prob yerleştirin.
2. Femoral Arter Kateterizasyonu
- Betadine ve% 70 etanol kullanarak sağdaki inguinal alanı yavaşça ovun.
- Sağ inguinal bölgede makas kullanarak 2 cm'lik yatay cilt insizyonu yapın.
- Retraktör kullanarak cerrahi alanı ortaya çıkarın.
- Çevreleyen damardan ve sinirden femoral arteri ayırın. Kavisli forseps ve köreltilmiş forseps kullanarak arterin 1 cm'lik bölümünü ayırın.
- 4.0 siyah ipek dikiş kullanarak, pozlamayı en üst düzeye çıkarmak için arterin hem proksimal hem de distal uçlarına gevşek bir kravat yerleştirin.
- Mikro makas kullanarak femoral arter üzerinde bir kesi yapın.
- 2-Fr ekleyin. Mikro-forseps kullanarak femoral artere balon uçlu kateter yerleştirildi. Kateterin, proksimal ligatür ile kateter başından yaklaşık 1 cm'lik bir kapta sabitlenmesi ve sonra da distal ligatöre bağlanması.
3. Karotid Arter Kateterizasyonu
- Betad kullanarak sağ ön boynunu ovunIne ve% 70 etanol ile yıkayın ve daha sonra bir cilt insizyonu yapın.
- Retraktör kullanarak cerrahi alanı ortaya çıkarın. Arterin 1 cm'lik bölümünü ayırın ve pozlamayı en üst düzeye çıkarmak için arterin hem proksimal hem de distal uçlarında bir ipek dikiş kullanarak gevşekçe bağlayın.
- Karotid arteri 24 G intravenöz kateteri kullanarak delinir ve kateterin proksimal 1 cm'ini kalbe doğru ilerletir.
- Kateteri proksimal ligat ile sabitleyin ve sonra distal ligatöre bağlayın.
- 3 yönlü bir tıkaç kullanarak, kateterin distal ucunu salin dolu mikro boruya ve dış rezervuara bağlayın.
4. Tail Artery Kateterizasyonu
- Betadin ve% 70 etanol kullanarak kuyruğun ventral bölgesini ovun ve 2 cm'lik bir cilt insizyonu yapın.
- Kuyruk damarını çevredeki yapılardan ayırın ve kemerli forseps ve köreltilmiş forseps kullanarak arterin 1 cm'lik bölümünü ayırın.
- 4.0 siyah ipek dikiş kullanarak, gevşek bir yerPozlamayı en üst düzeye çıkarmak için arterin hem proksimal hem de distal uçlarında bağlayın.
- Kuyruk damarını 24 G intravenöz kateteri kullanarak delin ve kateteri artere ilerletin.
- Kateterin proksimal ligatür ile damara sabitleştirilmesi (kateter kafasından yaklaşık 1 cm) ve distal ligatöre bağlanması.
- Kateterin distal parçasını arteryal basınç izleme cihazına bağlayın.
5. Spinal Kord İskemisinin İndüksiyonu
- Kateterizasyon tamamlandıktan sonra, 2 Fr. Balon uçlu kateteri inen torakal aorta sokarak kateter ucunun sol subklavian artere ulaşmasını sağlayın.
- Yerleştirme yerinden 10 cm derinliğe yerleştirin.
- Karotid kateter içine 150 ünite heparin 100 ünite / mL konsantrasyonda enjekte edin.
- Kateter balonunu 0.05 mL tuzlu su ile şişirin.
- Eşzamanlı olarak, kandan dış kan konteynırına kanı boşaltınProksimal arter basıncını 80 mmHg'ye ayarlamak için arotid arter.
- Arteryal basınç izleme sistemini 3 yönlü durdurma musluğunun kalan lümenine bağlayın ve arteryal basıncı izleyerek kan drenajının miktarını kontrol edin.
- Aortik oklüzyonun başarısını, distal arter basıncının ani bir düşüşü ve sürekli kaybıyla onaylayın.
- 9, 10 veya 11 dakika aortik oklüzyonu takiben, Fogarty kateter balonunu deflate edin ve boşaltılan kanını tekrar inhinleyin.
6. Cerrahi sonrası bakım ve nörolojik değerlendirme
- Arteryel basıncı kuyruk arteri aracılığıyla izlerken kateterleri femoral ve karotid arterden çıkarın ve ipleri ipek dikişlerle kapatın.
- Arteryal basıncın normal aralığa geldiğini teyit ettikten sonra kateter kuyruk arterinden alınır ve yarayı kapatın.
- Anesteziden kurtulduktan sonra sıçanı kafese geri getirin.
- Merak et merhabaMotor eksiklik indeksi kullanılarak ameliyattan 24 saat sonra ekstremite motor fonksiyonu ( Tablo 1 ). Motor açık indeksi ambulasyon skoru ile yerleştirme / basamak refleks skoru toplamı olarak tanımlanır. Motor eksikliği endeksi 6, maksimum açığı belirtir.
7. Histopatolojik Değerlendirme
- Nörolojik değerlendirme yapıldıktan sonra, sıçanları maske ile beslenen isofluran ile anestezi altına alınız, bunları anesteziden 100 mL heparinize salin ile transkardiyal perfüzyon ile kurutunuz ve omuriliği çıkartınız. 8
- Kordon bölümlerini paralel olarak 3-5 bel omur seviyesinden gömün.
- Hematoksilin ve eozin ile lekelen enine kesitleri (H & E).
- Mikroskop altında motor nöron hasarına dikkat edin. 9
8. İstatistiksel Analiz
- Sosyal Bilimler sürüm 20 için İstatistiksel Paket kullanarak istatistiksel analiz yapın. Motor defBu üç grubun buzlanma indeksi Kruskal-Wallis testi ve ardından Mann-Whitney U testi ile karşılaştırıldı. P değeri 0.05'in altında ise istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spinal kord iskemi periyodunda 9 dak (n = 3), 10 dakika (n = 3) veya 11 dakika (n = 3) aortik oklüzyon uygulandı. Sıçanlardaki motor eksiklik indeksi Tablo 2'de verilmiştir. 9 dak aortik oklüzyon geçiren sıçanlar, arka bacakte hafif ve geri dönüşümlü bir motor bozukluk gösterdi. Sıçanlar, 10 dakikalık aortik oklüzyona maruz bırakıldı, ancak motor fakir orta derecedeydi, ancak felç tam değildi. Oklüzyon süresinin 11 dakikasını alan sıçanlar, tam ve kalıcı felç sergiledi.
H & E ile boyanmış omurilik bölümlerinin temsili fotoğrafları Şekil 1'de gösterilmektedir. Omurga bölümlerindeki motor nöronlar, aort kapanması süresine kısa süren sıçanlarda daha fazla korunmuştur.
Şekil 1 . Histolojik SınavOmurilik bölümlerinin inasyonu
Motor nöronlar, aortik oklüzyon süresi kısaltılmış sıçanlarda (orijinal büyütme, 200X) daha fazla korunmuştur. Tüm görüntülerde ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Ambulasyon (alt ekstremitelerle yürüme) | Yerleştirme / basamak refleksi |
| 0: normal (simetrik ve koordineli ambulasyon) | 0: normal |
| 1: ayak parmakları düz vücut altında yürürken ancak ataksi mevcut | 1: zayıf |
| 2: mafsal yürüyüşü | 2: basamak yok |
| 3: Alt ekstremitelerdeki hareket ancak knuckle-yürüyüşe | |
| 4: hareket yok, alt ekstremite sürüyor |
Tablo 1. Ambulasyon ve Yerleştirme / Basamak Refleksinin Değerlendirilmesi.
| Aort kapanma zamanı | Ameliyattan 24 saat sonra |
| 9 dak (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 dak (n = 3) | 4 (4-4) |
| 11 dak (n = 3) | 5 (5-6) |
Tablo 2. Motor Azlığı Endeksi. Değerler medyan (çeyrekler arası aralık) olarak sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, aort oklüzyon süresine bağlı olarak arka bacak motor açık değişken derecelerde indükleyen Taira ve Marsala yöntemine 5 göre omurilik iskemisi bir fare modeli göstermiştir.
Aortik tıkanıklığın uzunluğu motor yetersizlik derecesini etkileyebilir. Aort kapanma süresi daha uzun olursa, motor açık daha şiddetli hale gelir. Böylece, araştırmacılar, bu modelde aort kapanma süresini kontrol ederek belli düzeyde motor yetmezlik sağlayabilirler.
Modelimiz, ortak karotid arter ve femoral arter ligasyonunu içerir ve bu arterlerin ligasyonundan kaynaklanan nörolojik defisit olasılığı potansiyel bir endişedir. Bununla birlikte, farelerin etkin teminat ağı sistemleri vardır. Bu nedenle, karotid arter veya femoral arter ligandığında, geniş kollateral ağ tarafından yeterli kan akışı sağlanabilir. Tek taraflı karoti D arter oklüzyonunun serebral kan akımı üzerinde çok az etkisi olduğu bildirilmiştir. 10 , 11 Tek taraflı karotis arter oklüzyonu sıçanlarda inme üretse de, bu ciddi sistemik hipoksi ile kombinasyon halinde ortaya çıkar. 12 Deneyimiz sırasında hiç sistemik hipoksi oluşmadı ve serebral enfarktüs düşündüren sıçanlarda hiçbiri nörolojik defisit göstermedi. Ayrıca sıçanlarda femoral arter bağlandığında kollateral dolaşım, arka bacak kaslarına yeterli miktarda kan akışı sağlar. 13 Bu kollektör dolaşımı, dinlenme halindeyken arka bacak kaslarına yeterli miktarda kan akışı sağlar ancak egzersiz sırasında yeterli akış sağlamaz. 14
Ayrıca, omurilik iskemi sırasında proksimal arter basıncı motor defisitlerin gelişimini etkiler. Önceki bir araştırmaya göre,Ref "> 5, sıçan omurga iskemi modelinde aortik klempleme esnasında 40 mmHg'lik proksimal arteryal basınçta neredeyse kaybolmuştur.Böylece, daha sonraki çalışmalar sıçan spinal modellerinde spinal kord iskemi sırasında proksimal arter basıncını 40 mmHg'de korudu spinal kord sırasında yeterli omurilik perfüzyon korunması için 80 mmHg ya da daha fazla, ortalama arter basıncı korumak için tavsiye edilir, çünkü, omurilik iskemisi. 9, 15, 16 Bununla birlikte, bu protokolde, aort oklüzyon sırasında 80 mmHg'de yakın arter basıncı muhafaza Klinik uygulamada iskemi ( 17) , insan ve kemirgenler arasında yeterli proksimal arter basıncının neyin oluştuğu konusunda bir farklılık olmasına rağmen.
Sıçanların ve insanların spinal kord damar sistemi ve kolateral sistemi benzerdir, 6 , 7 , sıçanları deneysel bir spinal kord iskemi modeli için uygun bir seçim yapar. Bununla birlikte, spinal kord iskemisinin ortaya çıktığı türlere göre sonuçların farklı olabileceği düşünülmemelidir.
Sonuç olarak, araştırmacılar omurilik iskemisinin bu sıçan modelini kolaylıkla benimseyebilir ve oldukça tekrarlanabilir bulgular elde edebilir. Dahası, üretilen motor açıklığın derecesini değiştirmek için aort kapanma süresini değiştirebilirler. Bu nedenle, bu model torakoabdominal aort anevrizmalarını takiben nörolojik komplikasyonların altta yatan patofizyolojisini inceleyen ileri araştırmaları kolaylaştırabilir ve bu komplikasyonlara karşı nöroprotektif stratejilerin geliştirilmesine izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rekabette finansal çıkarları yoktur. Bu çalışma, Kore Hükümeti Ulusal Araştırma Vakfı tarafından 2012R1A1A3014010 hibe tarafından desteklenmiştir.
Acknowledgments
Yazarların onayları yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S.
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
