Summary
Denna studie visar tekniken för att göra en minimalt invasiv och lätt reproducerbar modell för ryggmärgsischemi hos råttor. Olika grader av motorns underskott mot bakbenet kan framställas genom att reglera aorta ocklusionstiden.
Abstract
Ryggmärgs ischemi är en dödlig komplikation efter thoracoabdominal aorta-aneurysmoperation. Forskare kan undersöka strategierna för att förebygga och behandla denna komplikation med hjälp av experimentella modeller av ryggmärgsischemi. Modellen som beskrivs här visar varierande grader av paraplegi som hänför sig till längden av ocklusion efter bröst-aorta ocklusion i en ryggmärgs ischemi-modell.
En 2-Fr. Ballong-tippade kateteren avancerades genom lårbenären i den nedåtgående bröstkärlen aorta tills kateterns spets placerades i vänster subklaviär artär i bedövade Sprague-Dawley råttor av man. Ryggmärgs-ischemi inducerades genom uppblåsning av kateterballongen. Efter en bestämd period av ocklusion (9, 10 eller 11 min) deflaterades ballongen. Neurologisk bedömning utfördes med användning av motorunderskottets index vid 24 timmar efter operationen och ryggmärgen skördades för histopatologisk undersökning.
Råttor som genomgick 9 min av aortisk ocklusion uppvisade mild och reversibel motorisk försämring i bakbenen. Råttor utsatta för 10 min aorta ocklusion uppvisade med måttlig men reversibel motorisk försämring. Råttor utsatta för 11 min aorta ocklusion uppvisade fullständiga och ihållande Paralyserna i ryggmärgsektionerna var mer bevarade hos råttor utsatta för kortare varaktighet av aorta ocklusion.Forskare kan uppnå ett reproducerbart underskott mot bakbenet efter bröstcancer-aorta ocklusion med hjälp av denna ryggmärgs ischemimodell.
Introduction
Paraplegi är en dödlig komplikation av thoracoabdominal aorta-aneurysmoperation. Det härrör från ryggmärgs ischemia-reperfusionsskada som uppstår vid tvärklämning och avklämning av aortan. 1 Flera strategier inklusive systemisk hypotermi och cerebrospinal dränering har införts för att skydda ryggmärgen, 2 , 3 , 4, men många patienter förblir drabbade av skadan.
Flera djur ryggmärgs ischemi modeller har införts för att undersöka dess patogenes och utforma skyddande strategier mot skadan. I den aktuella studien skisserar vi en råttmodell av ryggmärgs ischemi baserat på Taira och Marsalas metod. 5 Ryggmärgscirkulationen hos råttor är väldigt lik ryggmärgsvaskulär- och säkerhetssystemet hos människor, även om det finns vissa skillnader i storlek ochplats. 6 , 7 Således är en råtta ett anatomiskt lämpligt djur att utnyttja för en experimentell modell som undersöker patogenesen, komplikationerna och behandlingen av ryggmärgsischemi. Dessutom ger denna ryggmärgsischimodell tillförlitlig aortisk ocklusion med minimal intervention genom att utnyttja en intravaskulär ballong ocklusion av bröstkörteln.
I denna studie visade vi att denna råttmodell av ryggmärgsischemi inducerar reproducerbara motoriska underskott i bakbenen som varierar i svårighetsgrad beroende på aorta ocklusionstiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av Institutionen för djurhälsa och användning av Seoul National University Bundang Hospital. Djurvård och experiment utfördes enligt Förenta nationernas nationella institut för hälsoguide för vård och användning av laboratoriedjur.
1. kirurgisk beredning
- Skölj katetrarna med steril saltlösning före operationen för att säkerställa patensen.
- Sätt ett värmevilt på operationsbordet och täck bordet med en steril draperi.
- Placera manliga Sprague-Dawley-råttor (270-330 g) i en akryllådan med 3,0% -4,0% isofluran i 100% syre.
- Applicera smörjmedel på råttans ögon.
- Placera råttan på operationsbordet i det bakre läget och bibehålla anestesi med hjälp av ansiktsmask med kontinuerlig administrering av isofluraninhalat (1,0% -2,5 volym%).
- Placera en rektal sond för att övervaka och upprätthålla kroppstemperatur mellan 37,0-38,0 ° C.
2. Femoral arteriekateterisering
- Skruva försiktigt rätt inutiområdet med Betadine och 70% etanol.
- Gör en 2 cm horisontell hudinsats med hjälp av sax på höger inguinalområde.
- Använd en retraktor, exponera det kirurgiska fältet.
- Dissect femoral artery från den omgivande venen och nerven. Isolera en 1 cm sektion av artären med hjälp av krökta tångar och trubbiga tångar.
- Använd en 4,0 sorts silke sutur, placera ett löst slips på både proximal och distal änden av artären för att maximera exponeringen.
- Gör ett snitt på lårbensartären med hjälp av mikro-sax.
- Sätt in en 2-Fr. Ballongtippad kateter in i lårbensartären med hjälp av mikropingrar. Säkra katetern till kärlet ca 1 cm från kateterhuvudet med den proximala ligaturen och bind sedan den distala ligaturen.
3. Carotidartisk kateterisering
- Skruva den högra främre nacken med betadIne och 70% etanol, och gör sedan ett snitt av huden.
- Använd en retraktor, exponera det kirurgiska fältet. Isolera en 1 cm-sektion av artären och binda den löst med en silkesutur på både proximal och distal ända av artären för att maximera exponeringen.
- Punktera halspulsådern med hjälp av en 24 G intravenös kateter och förflytta den proximala 1 cm av katetern mot hjärtat.
- Säkra katetern med den proximala ligaturen och bind sedan den distala ligaturen.
- Anslut den distala änden av katetern till det saltlösande mikroröret och den yttre reservoaren med en 3-vägs stoppkrok.
4. Tail Artery Catheterization
- Skruva av ventralområdet i svansen med betadin och 70% etanol, och gör en 2 cm hudinsats.
- Dissektera svansartären från de omgivande strukturerna och isolera en 1 cm sektion av artären med hjälp av krökta tångar och trubbiga tångar.
- Använd en 4,0 sorts silke sutur, sätt en lösBinda på både proximal och distala ändarna av artären för att maximera exponeringen.
- Punktera svansartären med en 24 G intravenös kateter och förflytta katetern in i artären.
- Säkra katetern till kärlet (ca 1 cm från kateterhuvudet) med den proximala ligaturen och binda den distala ligaturen.
- Anslut kateterets distala del till övervakningsanordningen för artärtryck.
5. Induktion av ryggmärgsischemi
- Efter kateterisering är klar, fortsätt 2 Fr. Ballong-tippad kateter in i nedstigande bröstkörteln, så att kateterns spets når den vänstra subklaviska artären.
- Sätt i ett djup på 10 cm från insättningsstället.
- Injicera 150 enheter heparin i en koncentration av 100 enheter / ml i karotidkatetern.
- Uppblåsa kateterballongen med 0,05 ml saltlösning.
- Töm samtidigt blodet i den yttre blodbehållaren från cArotidartären för att reglera det proximala artärtrycket till 80 mmHg.
- Anslut det arteriella trycksövervakningssystemet till den återstående lumen i 3-vägs stoppkranen och kontrollera mängden bloddränering med övervakning av artärtrycket.
- Bekräfta framgången med aorta ocklusion med en abrupt minskning och kontinuerlig förlust av distalt arteriellt tryck.
- Efter aorta ocklusion av 9, 10 eller 11 min, deflaterar Fogarty-kateterballongen och återfyller det dränerade blodet.
6. Postkirurgisk vård och neurologisk bedömning
- Medan du övervakar arterietrycket genom svansartären, ta bort katetrarna från lårbenen och halshålorna och stäng såren med silkesuturer.
- Efter att ha bekräftat att artärtrycket återvinns till det normala området, ta bort katetern från svansartären och stäng såret.
- Efter återhämtning från anestesen, returnera råttan till sin bur.
- Bedöma hejNd limmotorfunktion vid 24 timmar efter operation med användning av motorunderskottets index ( tabell 1 ). Motorns underskottindex definieras som summan av ambulationspoängen och placerings / stegningsreflexresultatet. Ett motorunderskott på 6 anger det maximala underskottet.
7. Histopatologisk utvärdering
- Efter den neurologiska bedömningen bedövar råttor med maskeavgiven isofluran, offra dem genom transkardiell perfusion med 100 ml hepariniserad saltlösning under anestesi och extrahera ryggmärgen. 8
- Bädda in snoddsektionerna från nivån på ryggraden 3-5 i paraffin.
- Färg tvärsnitt med hematoxylin och eosin (H & E).
- Observera motor neuron skada under ett mikroskop. 9
8. Statistisk analys
- Utför statistisk analys med statistiskt paket för Social Sciences version 20. Motor defIcit-index för de tre grupperna jämfördes med användning av Kruskal-Wallis-testet, följt av en Mann-Whitney U- test. Ett P- värde <0,05 ansågs statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under en period av ryggmärgsischemi utfördes aortisk ocklusion under 9 minuter (n = 3), 10 min (n = 3) eller 11 min (n = 3). Motorns underskottindex hos råttor presenteras i tabell 2. Råttor som genomgick 9 min av aorta ocklusion uppvisade en mild och reversibel motorisk försämring i bakbenen. Råttor utsatta för 10 min aorta ocklusion uppvisade med måttligt motorunderskott, men inte fullständig förlamning. Råttor som genomgick 11 min ocklusionstid visade fullständig och ihållande förlamning.
Representativa fotografier av ryggmärgsektioner färgade med H & E visas i Figur 1 . Motorneuronerna i ryggradssektionerna var mer bevarade hos råttor utsatta för en kortare varaktighet av aorta ocklusion.
Figur 1 . Histologisk examenInation av ryggradssektioner
Motor neuronerna var mer bevarade hos råttor utsatt för kortare varaktighet av aorta ocklusion (original förstoring, 200X). Skala i alla bilder = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Ambulation (gå med nedre extremiteterna) | Placering / stegreflex |
| 0: normal (symmetrisk och koordinerad ambulation) | 0: normal |
| 1: tårna platt under kroppen när man går men ataxi är närvarande | 1: svag |
| 2: Knokbana | 2: ingen stegning |
| 3: Förflyttning i nedre extremiteter, men kan inte gå i gång | |
| 4: ingen rörelse, drar nedre extremiteter |
Tabell 1. Utvärdering av Ambulation och Placing / Stepping Reflex.
| Aortisk ocklusionstid | 24 h efter operationen |
| 9 min (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 min (n = 3) | 4 (4-4) |
| 11 min (n = 3) | 5 (5-6) |
Tabell 2. Motorunderskottets index. Värden presenteras som median (interkvartilintervall).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den aktuella studien demonstrerade vi en råttmodell av ryggmärgsischemi baserat på Taira och Marsalas metod 5 som inducerar variabla grader av motorunderskott i bakbenen beroende på aorta ocklusionstiden.
Längden av aortisk ocklusion kan påverka graden av motorunderskott. Om aorta ocklusionstiden är längre blir motorns underskott svårare. Således kan forskare uppnå en viss grad av motorunderskott genom att kontrollera aorta ocklusionstiden i denna modell.
Vår modell involverar ligering av den gemensamma halspulsådern och lårbensartären, och möjligheten att neurologiska underskott som härrör från ligering av dessa artärer är ett potentiellt problem. Råttor har dock effektiva nätverkssystem för säkerheter. När sålunda halspulsådern eller lårartären är ligerad kan tillräckligt blodflöde tillhandahållas av det omfattande säkerhetsnätet. Unilateral caroti D arteriell ocklusion rapporteras att producera endast mindre effekter på cerebralt blodflöde. 10 , 11 Även om ensidig karotid-ocklusion kan producera stroke hos råttor, sker detta endast i kombination med svår systemisk hypoxi. 12 Under vårt experiment inträffade ingen systemisk hypoxi och ingen av råttorna presenterades med neurologiska underskott som tyder på cerebralt infarkt. Vidare, när den femorala artären hos råttor är ligerad, ger säkerhetscirkulationen tillräckligt blodflöde till bakre extremmusklerna. 13 Denna säkerhetscirkulation ger tillräckligt med blodflöde till bakre extremmusklerna när de vilar, men ger inte tillräckligt flöde under träning. 14
Vidare påverkar det proximala arteriella trycket under ryggmärgsischemi utvecklingen av motorunderskott. Enligt en tidigare studie,Ref "> 5 försörjdes blodsäkerheten vid säkerheten vid det proximala artärtrycket på 40 mmHg under aorta-spänningen i en råttor-spinalischimodell. Följande studier upprätthöll det proximala arteriella trycket vid 40 mmHg under ryggmärgsischemi i deras råttor sladden ischemi. 9, 15, 16 emellertid, i detta protokoll, vi upprätthållit den proximala arteriella trycket på 80 mmHg under aorta ocklusion eftersom det rekommenderas att bibehålla medelartärtrycket på 80 mm Hg eller högre för att bevara tillräcklig ryggmärgs perfusion under ryggmärgen Ischemi i klinisk praxis, 17 fastän det kan finnas en skillnad i vad som utgör ett adekvat proximalt arteriellt tryck mellan människor och gnagare.
Ryggmärgsvaskulaturen och säkerhetssystemet hos råttor och människor är liknande, 6 , 7 som gör råttor ett lämpligt val för en experimentell ryggmärgsischemimodell. Det bör emellertid inte diskonteras att resultaten kan vara olika beroende på arten där ryggmärgs iskemi uppträder.
Sammanfattningsvis kan forskare enkelt adoptera denna råttmodell av ryggmärgsischemi och uppnå starkt reproducerbara fynd. Dessutom kan de ändra aorta ocklusionstiden för att variera graden av motorbortfall som produceras. Som sådan kan denna modell underlätta ytterligare studier som undersöker den underliggande patofysiologin av neurologiska komplikationer efter thoracoabdominal aorta-aneurysm och tillåter utveckling av neuroprotektiva strategier mot dessa komplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen. Detta arbete stöddes av beviljande 2012R1A1A3014010 från National Research Foundation of Korean Government.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S.
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
