Summary
Aquí presentamos gotita direccionable microarrays (ADMs), un método de arreglo de discos basado en la gota capaces de determinar la abundancia absoluta de proteínas en las células. Demostramos la capacidad de ADMs para caracterizar la heterogeneidad en la expresión de la proteína p53 supresora tumoral en una línea celular de cáncer en humanos.
Abstract
Comportamiento a menudo celular y respuestas celulares se analizan a nivel de población donde se agruparon las respuestas de muchas células como resultado promedio enmascara el comportamiento rico sola célula dentro de una población compleja. Tecnologías de detección y cuantificación de la proteína unicelular han hecho un impacto notable en los últimos años. Aquí describimos una plataforma de análisis práctico y flexible única célula basada en microarrays gotita direccionable. Este estudio describe cómo los números de copia absoluta de proteínas objetivo pueden medirse con una resolución de única célula. El tumor supresor p53 es el gen más comúnmente mutado en el cáncer humano, con más del 50% total de casos de cáncer exhibiendo un patrón de expresión de p53 no saludables. El protocolo describe los pasos para crear 10 gotitas de nL en el que las células cancerosas humanas solo son aisladas y se mide el número de copias de la proteína p53 con la resolución sola molécula para determinar precisamente la variabilidad en la expresión. El método puede aplicarse a cualquier tipo de células incluyendo el material principal para determinar el número de copia absoluta de cualquier proteínas target de interés.
Introduction
El objetivo de este método es determinar la variación en la abundancia de una proteína de la blanco en una población de células con una resolución de única célula. Análisis de célula proporciona una serie de beneficios que no están disponibles con métodos bioquímicos de formación tradicional. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 en primer lugar, trabajar en el nivel unicelular puede capturar la rica heterogeneidad de una población celular que de lo contrario se perdería por el promedio que se produce con técnicas bioquímicas de formación tradicional. La mayoría de los métodos bioquímicos de caballo de trabajo trabaja con la mayor parte, que requieren, como a menudo lo hacen, millones de células para producir un resultado. Por supuesto, las consecuencias de la evaluación de las poblaciones de toda la célula depende de varios factores, por ejemplo, la heterogeneidad en la expresión de la proteína donde pueden perderse algunas características importantes de la distribución de la abundancia de la proteína. Desde una perspectiva práctica, la sensibilidad requiere de técnicas unicelular hacerlos capaces de trabajar con cantidades de material biológico que no es suficiente para incluso las más sensibles a granel técnicas de función. Un ejemplo clave de esto es el estudio de tipos raros de la célula tales como células del tumor (CTC) donde incluso para los pacientes con un pronóstico desalentador pronóstico menos 10 CTC puede estar presente en la sangre solo 7,5 mL sacar de circulación. 6 aquí presentamos la metodología necesaria para realizar las mediciones de proteína unicelular mediante un volumen reducido ensayo basados en anticuerpos empleando gotas aceite tapa impresa en un microarray de anticuerpo.
Plataformas de gota microfluídicos son alto rendimiento, capaz de generar miles de gotas por segundo y capaz de aislar y cultivar incluso, las células en gotas individuales a realizar una amplia gama de Ensayos bioquímicos. Técnicas basadas en la gota son adecuadas para el análisis unicelular,7,8,9 con notables ejemplos recientes incluyendo DropSeq10 y inDrop11, que han sido ayudados grandemente por el poder de técnicas de amplificación. La limitada cantidad de material y no métodos de amplificación para las proteínas hacen única célula proteómica especialmente desafiante.
Gotas pueden ser analizadas por una serie de métodos y microscopía de fluorescencia ha sido ampliamente utilizado. Sola molécula técnicas como microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total permite moléculas fluorescentes para visualizarse con cociente signal-to-noise sin precedentes. 12 debido al decaimiento exponencial del campo evanescente, sólo fluoróforos en gran proximidad a la superficie (orden de 100nm) muy contentos haciendo TIRF una buena estrategia en la detección de pequeñas cantidades de una molécula de la blanco en una mezcla compleja. La fuerza inherente de seccionamiento óptica de TIRF también ayuda a evitar los pasos de lavado y ensayo de límites de tiempo y la complejidad. Sin embargo, TIRF requiere superficies planas y ejemplos de microscopía TIRF aplicado a las gotitas de flujo implican la formación de una superficie plana que a la imagen. 13 para ello, técnicas de proteómica celular solo diseño a menudo chips microfluídicos en agentes de superficie inmovilizado captura en un formato de microarrays. 4 , 14
Las gotitas, ellos mismos, se pueden formar en arreglos de discos en superficies planas, gotita llamada microarrays. 15 , 16 , 17 organizar espacialmente gotitas en arreglos de discos permite que sean convenientemente indexadas, fácilmente monitoreado en el tiempo, individualmente dirigida y, si es necesario, obtenido. Microarrays de gota puede alcanzar una alta densidad de micro reactores con miles de elementos por chip ya sea libre o apoyado por las estructuras de los micropocillos. 18 , 19 , 20 , pueden ser formados por la deposición secuencial por robots de manejo de líquidos, observadores de inyección de tinta, en contacto con microarrayers21,22,23,24,25, 26 o se puede uno montar en superficies tales como superhydrophillic puntos con motivos sobre una superficie superhidrófobos. 27 , 28 , 29
Con estas consideraciones en mente, direccionable gotita Microarrays (ADMs) fueron diseñados para combinar la versatilidad, direccionamiento espacial y volúmenes reducidos de microarrays de gota con la sensibilidad de la microscopía TIRF de sola molécula a cuantitativamente medir la abundancia de la proteína. 5 ADMs permiten análisis de la célula formando un microarray de gotas que contienen las células sobre un microarray de anticuerpo, que luego es cubierto con aceite para evitar la evaporación. Los volúmenes de las gotas son discretos para evitar pérdida de muestra, que de lo contrario se lograría por la en-viruta valvulado en microfluídica de flujo continuo. 30 la cantidad absoluta de proteínas blanco de una sola célula es extremadamente pequeña; sin embargo, el reducido volumen de las gotas permite la relativamente alta concentración local a fin de que se detectan mediante un análisis de anticuerpos del emparedado - anticuerpo es inmovilizado en una región distinta, o de punto, sobre una superficie que capta proteínas que a su vez se une a un anticuerpo de detección fluorescente etiquetado presente en el volumen de la gota. Como un enfoque libre de etiqueta (es decir, proteína de objetivos no es necesario etiquetar directamente), ADMs son generalmente aplicables para el análisis de células a partir de fuentes primarias, tales como sangre procesada, es necesario bien aspirados y biopsias de tumor disociado, así como las células de cultura y los lisados.
Medir la variación en la abundancia de proteínas a través de una población celular es importante en la determinación de la heterogeneidad en la respuesta, por ejemplo, a una droga y ayudará en la provisión de información sobre las funciones celulares y vías, evaluación de subpoblaciones y su comportamiento, así como identificar eventos raros que lo contrario serían ser enmascarados por métodos a granel. Este protocolo describe cómo producir y utilizar gota direccionable microarrays para determinar cuantitativamente la abundancia de la transcripción factor p53 en células cancerosas humanas y puede ser utilizado para investigar el papel de p53 en respuesta a los fármacos quimioterapéuticos. La proteína Diana es determinada por la opción de captura y detección de anticuerpos y puede modificarse para incluir más o diferentes objetivos. Se proporcionan instrucciones para construir un aparato sencillo que incorpora una boquilla concéntrica de consumibles de laboratorio general al array manualmente 10 gotitas de nL con aceite. Se describe el proceso completo experimental por el que cada gota se carga entonces con una sola célula, que luego es lisada y la expresión de proteína determinada con la resolución sola molécula mediante microscopía TIRF.
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Protocol
1. preparación
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Hacer virutas y microarrays de anticuerpos impresión
- Colocar un aislador de adhesivo acrílico y silicón a un cubreobjetos funcionalizado para apoyar un microarray de anticuerpo. Esto se conoce como el chip.
Nota: Varios químicos superficiales han sido probados para su conveniencia con gotitas direccionables. 5 química superficial deben optimizarse para agentes alternativos de captura. Aisladores de ADM están disponibles comercialmente o pueden ser producidos por láser corte de acrílico (CAD para aislador utilizado en este trabajo se ofrece como una descarga de archivo, consulte el Archivo de código suplementario). - Conecte el microarrayer y ajuste la humedad hasta un 75%.
Nota: humedad relativa reduce la evaporación de la solución de impresión de la espiga de microarrays y reduce la variación intra y inter spot. - Limpie la clavija de microarrays en pin solución durante 5 minutos de limpieza por ultrasonidos. Enjuague el pasador con agua ultra puro con una botella de lavado y secado con nitrógeno.
Nota: Suspendido el pin que sumerja solamente la punta del pin. Un portaobjetos de microscopio con un sistema debidamente perforado de agujeros ayudarán si no puede obtenerse un porta. - Tomar 5 mL de buffer de impresión que consta de 3 × tampón de citrato salino-sódico (SSC), betaína de 1,5 M con 0.01% sodio dodecil sulfato (SDS). Almacenar a 4 ° C indefinidamente.
- Para preparar una solución de impresión, descongelar el anticuerpo anti-p53 (p53/Mdm2 ELISA kit; vea la tabla de materiales) alícuotas almacenadas a-80 ° C. Mezcla 1:1 con el tampón para impresión a una concentración final de 0,5 mg/mL. Carga 5-10 μl de la solución de impresión en una placa bien 384 utilizando una micropipeta y colocar en el microarrayer.
- Carga chips ensamblados en el paso 1.1.1 el microarrayer. Programa microarrayer imprimir puntos en las coordenadas definidas por el centro de cada pozo del aislador.
Nota: Microarrayers emplean una gama de, predominantemente, software propietario y por lo que el lector se recomienda consultar la literatura relevante. Microarrays para el aislador ADM en el archivo de CAD en el paso 1.1.1 se compone de elementos rectangulares; se proporcionan las distancias pertinentes. - Almacenar las virutas en recipientes herméticos y envolver con papel de aluminio. Almacenar a 4 ° C hasta 6 semanas.
Nota: La hoja es para prevenir cualquier daño de la foto. Almacenamiento a 4 ° C limita la tasa de degradación de las biomoléculas y las reacciones perjudiciales que pueden actuar para reducir la actividad de microarrays. Un recipiente hermético permite virutas se equilibren a temperatura ambiente antes de usarlo sin condensación formando en la superficie del chip. Impresión de microarrays contacto explota la tensión superficial y adhesión entre la solución de impresión y el sustrato de impresión para producir manchas. Impresión o borrar normalmente se requiere para eliminar el exceso de solución del pin de microarrays a ceder puntos uniformemente tamaños. No descarte el sacrificio cubreobjetos previa ya que puede ser utilizado para evaluar la calidad del lote.
- Colocar un aislador de adhesivo acrílico y silicón a un cubreobjetos funcionalizado para apoyar un microarray de anticuerpo. Esto se conoce como el chip.
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Preparar jeringas, tubo y concéntrica boquilla para dispensar gotas direccionables
- Desmontar 100 μl (para la gota acuosa) y 1 mL (para el aceite tapado) cristal jeringas Hamilton y enjuague las piezas con agua destilada H2O.
- Alimentación de una longitud de 100 mm de 150 μm ID/360 μm OD fundido tubería de silicona a través de una longitud de 40 mm de 1,0 mm ID, 1/16 "tubo PFA OD hasta que sobresalga 2 mm. Esto formará la boquilla concéntrica.
- Aplique una capa delgada de pegamento del cianocrilato al extremo de una punta de pipeta 10 μl e inserte la pieza de 40 mm de 1,0 mm ID, 1/16 "tubería de PFA de OD. Si es necesario, vuelva a colocar el tubo de sílice fundida para mantener una saliente de 2 mm de la boquilla antes de los sistemas adhesivos.
- Inserte el otro extremo de lo capilares de sílice fundida en el extremo de una longitud de 200 mm de 0,014" ID/0.062" OD tubo de PTFE y conéctelo a una 100 μl jeringa Hamilton llena con 4% albúmina de suero bovino (BSA) en tampón fosfato salino (PBS) (PBSA).
Nota: Las proteínas y otras especies bioquímicas específicamente no puede obligar a las superficies y pueden perdidos o desnaturalizados. BSA se utiliza para 'bloquear' las superficies para minimizar el atascamiento no específico por sacrificio obligatorio para esas superficies. - Introduzca una longitud de 400 mm de tubo de 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP en una punta de pipeta de 200 μL hasta que se forme un sello. Aplique una capa delgada de pegamento del cianocrilato a la otra punta de la pipeta de 200 μl y este empuje en el primer Consejo para fijar la tubería en su lugar. Conecte el extremo abierto de la tubería de FEP OD 1.0mm ID/2.0 mm a un 1 mL jeringa Hamilton llena con aceite mineral.
- Inserte el montaje de punta de pipeta μl 200 10 μl Punta de la pipeta de la tobera concéntrica. Coloque las jeringas en bombas de jeringas separadas como deben funcionar independientemente.
- Llene la jeringa de 100 μl con solución al 4% PBSA bloqueo. Vuelva a colocar y lave la tubería 'acuosa' con la solución de bloqueo. Repetir dos veces para un total de 3 colores.
- Llene la jeringa de 100 μl con 0.125 μg mL-1 detección anticuerpo (anti-p53 anticuerpo (-1) con Alexa 488) en 4% PBSA y vuelva a colocar la tubería. Vuelva a colocar solución de bloqueo en la tubería de suministro 25 solución de anticuerpo de detección μl.
- Enjuague el tubo de 'oil' con aceite mineral hasta que todas las tuberías y el inyector se llena de aceite. Llenar la jeringa de 1 mL con aceite mineral y vuelva a colocar la tubería. Asegure el tubo y la boquilla a un manipulador XYZ.
-
Prepararse microinyectora y amalgamas dentales
Nota: Siguientes pasos hacen referencia específica a los componentes de la microinyectora y micromanipulador aparato especificado en la tabla de materiales, pero son generalmente aplicables a dichos aparatos.- Montar la microinyectora conectando la tubería de la presión y el capilar.
- Lentamente gire el pistón hasta que el aceite mineral se llena completamente la línea.
- Monte el soporte del tubo capilar en el Monte de cabeza de traducción.
- Fijar el tubo capilar en el porta capilar con el cabezal de agarre.
- Pipetear una solución de 4% PBSA en uno de los pozos del aislador.
- Traducir mediante el micromanipulador y sumerja la punta del tubo capilar en la solución.
- Llene lentamente el tubo capilar con 4% PBSA y deje de bloquear por 10 min.
- Expulse el microcapillary y girar el módulo de traducción para que la Asamblea está clara de la viruta.
2. formar gotitas direccionables y carga con las células
- Forma de gotitas direccionables
- Fije el chip en la platina del microscopio.
Nota: El microscopio es una fluorescencia invertida microscopio automatizado capaz de sola molécula TIRF equipado con un una etapa XY codificada y un electrón multiplicando cámara de dispositivo de carga acoplada (EM-CCD). - Registrar las coordenadas de fase microscopio de cada punto de la matriz mediante el software de control automatizado del microscopio.
- Encuentra el manipulador XYZ en la platina del microscopio. Coloque la boquilla en un ángulo de 50-60°. Asegúrese de que la boquilla tiene suficiente longitud y la separación a la viruta. Conjunto de la 'acuosa' y 'aceite' jeringa bombas para despachar 10 nL 100 μl/min y 5 μl a 100 μl/min, respectivamente.
Nota: Durante la preparación, la solución acuosa a la cabeza de la boquilla puede secar. - Pipetear la solución acuosa hasta que una gota de líquido es visible en la cabeza de la boquilla. Frote con un paño libre de polvo para quitarlo.
Nota: Dependiendo del número de condiciones de investigación, reservar un número de pozos que sirven como depósitos para las células. Para un sola celda línea tipo será suficiente un solo depósito. - Mediante el software de control de microscopio automatizado, establece las coordenadas de fase microscopio en un lugar de anticuerpo en la matriz y el enfoque en la superficie del cubreobjetos.
- Cuidado de no perturbar el terreno, con el manipulador XYZ, alinee la punta capilar de vidrio de la boquilla concéntrica al lado del lugar de anticuerpo y dispensar 10 nL de solución acuosa. Sin mover las etapas, dispensar 5 μl de aceite a la tapa de la solución acuosa. Lentamente Levante la boquilla de la gota y pasar a la siguiente también.
- Repita el paso 2.1.6 para todos los puntos de anticuerpo en la matriz.
- Después de 30 min, imagen de todos los puntos de la matriz mediante el software de control automatizado del microscopio para determinar el fondo de las moléculas individuales a cada punto antes de cargar las células anticuerpo.
- Fije el chip en la platina del microscopio.
- Gotas direccionables con células de carga
- Retirar los frascos de cultivo celular de la incubadora y separar las células con solución de tripsina/EDTA.
Nota: En este estudio, el ser humano colon línea celular de carcinoma fue utilizada y cultivado usando modificado águilas medio (DMEM de Dulbecco) suplementado con suero bovino fetal 10% (v/v) (FBS) en un incubador de CO2 . - Si es necesario, tinción fluorescencia células.
- Resuspender las células en una solución de 0.125 μg/mL de anticuerpo de detección (anti-p53 anticuerpo (-1) con Alexa 488) en 10% FBS en medios L-15. Para asegurar una suspensión unicelular, filtrar la solución de células a través de un tamiz de 40 μm pitch celular.
- Contar las células usando un hemocitómetro y diluir o concentrar la solución de células a una concentración de 25-400 x 103 células/mL. Esto asegura que ese sedimento de células con suficiente espacio para manipular cómodamente el microcapillary.
- Carga las células en gotas direccionables desde el embalse de celda utilizando el instrumental quirúrgico y microcapillary.
Nota: Las células no adherente pueden ser cargadas a granel en la micropipeta y dispensado uno a uno en gotitas direccionables. A pesar de tratamiento superficial de bloqueo, líneas de células adherentes tienden a no específicamente se adhieren a la pared interna de la microcapillary de vidrio y se pierden. - Utilizando un objetivo de × 10 para observar, utilice la microinyectora para aspirar una sola celda en la microcapillary de la reserva de la célula.
- Almacenar las coordenadas de fase instrumental quirúrgico si se utiliza una etapa de manipulador electrónico o nota manualmente la posición de z.
- Retraiga la micropipeta por traducirlo hacia arriba para despejar la altura de 1 mm de la viruta. Realizar esto manualmente con una palanca de mando o automáticamente mediante la función de 'Expulsión' de una etapa de manipulador electrónico.
- Conjunto de que la etapa se coordina para que de una gota direccionable el usar microscopio control software automatizado. 'Inyectar' la micropipeta por regresar a la posición de z almacenada (o conocida). Realizar esto manualmente con una palanca de mando o automáticamente si se utiliza una etapa de manipulador electrónico.
Nota: El microcapillary perforar el aceite tapado y se encuentra dentro de la porción acuosa de la gota direccionable. - Dispensar la célula en la gota direccionable usando el microinyector. El volumen de una gota direccionable de nL 10 aumentará menos del 1%.
- Repetir 2.2.5-2.2.9 las gotitas direccionable restantes dejando algunos gratis para el control experimental donde direccionables gotitas que contienen una célula.
Nota: Es una alternativa más simple a la carga de las células en gotas direccionables con un microcapillary y un micromanipulador para sustituir la solución en el paso 1.2.8 con una solución de anticuerpo de detección en 4% PBSA que contiene células a una concentración del orden de 10 5 células/mL, equivalente a 1 célula/10 nL. Ocupación única célula será Poissonian y necesitará optimizarse la concentración celular.
- Retirar los frascos de cultivo celular de la incubadora y separar las células con solución de tripsina/EDTA.
- Lyse las células y la matriz de la imagen
- Imagen de células en las gotas mediante microscopía brightfield, incluyendo cualquier proyección de imagen de fluorescencia.
Nota: la proyección de imagen toma aproximadamente 3 minutos a la imagen ~ 100 gotas usando un microscopio automatizado. Realizar la proyección de imagen con un NA 60 = 1.49 objetivo de inmersión en aceite. Filtros no son necesarios para el brightfield imágenes mientras que conjuntos de filtro estándar son utilizados para la proyección de imagen de fluorescencia. - Imagen de todos los puntos de la matriz mediante microscopía TIRF de molécula única.
Nota: Configuración se utiliza como paso 2.3.1 con una TIRF especializado filtro conjunto. Estas imágenes serán posteriormente analizadas en la sección 3 para determinar el fondo de las moléculas individuales a cada punto de anticuerpos antes de la lisis. Proyección de imagen de una molécula utilizando microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total toma aproximadamente 5 minutos de ~ 100 puntos de la imagen. - Se centran en una celda de una gotita direccionable. Lograr completa lisis óptico concentrándose un 6 solo ns laser pulso (longitud de onda 1064 nm, pulso energías 14,1 ± 0.3 ìj por pulso) cerca de la ubicación de la célula.
Nota: El pulso de láser establece una creciente burbuja de cavitación tijeras de la célula y libera a componentes celulares en el volumen de la gota. 4 , 31 procesos mecánicos debido a la lisis inducida por láser no perturban la interfaz aceite-agua en energías de bajo pulso. Lisis óptica típicamente toma aproximadamente 20-30 min para lyse las 100 células. Como comentamos en la sección de discusión, hay una serie de métodos alternativos para lyse las células si no es posible la configuración óptica lisis. - Repita para todos gotitas direccionables que contiene la célula dejando 5 gratis para el control experimental donde direccionables gotas contienen una célula no sometidas a lisis.
- Tenga en cuenta el momento en el que cada célula es lisada.
Nota: Estos tiempos se utilizará para corregir las curvas de enlace individual para cada punto en el paso 3.1.9. A menudo es suficiente para notar los tiempos cuando las células de la primeras y la últimas están lisadas y estiman el resto asumiendo adecuadamente consistente en un tiempo entre los acontecimientos de lisis. - Adquisición de imágenes de sola molécula mediante microscopía TIRF de todos los puntos cada 10 minutos para los primeros 30 min luego cada 20 minutos de un 60 minutos más. Si sólo está interesado en la cantidad de proteína limitada en equilibrio, todos los puntos de imagen después de incubar el chip durante 90 minutos a temperatura ambiente.
Nota: El tiempo para alcanzar el equilibrio depende el volumen de la gota y la afinidad de los anticuerpos utilizados en el ensayo. Microscopía TIRF se realiza utilizando una fuente de excitación láser en = 488 nm y 1.5 de mW de potencia medido en la abertura posterior utilizando un medidor de potencia óptica. Sola molécula imágenes son adquiridas mediante el establecimiento de los parámetros de adquisición de la cámara EM-CCD en tiempo de la adquisición de 900 ms, digitalización de 16 bits a velocidad de lectura de 1 MHz y un EM obtener factor de 10. El aislador puede reutilizarse quitando cuidadosamente el cubreobjetos.
- Imagen de células en las gotas mediante microscopía brightfield, incluyendo cualquier proyección de imagen de fluorescencia.
3. Análisis de los datos
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Sola molécula contando (régimen no congestionado/digital)
- Fiji (o Matlab) para cualquier punto de anticuerpo no congestionadas, carga la imagen adquirida antes de lisis (fondo, BKD).
Nota: Las operaciones en los siguientes pasos se realizan directamente con software de análisis de imagen de Fiji. Una guía de usuario se puede encontrar en el siguiente enlace https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html. - En Fiji, seleccione la imagen BKD. En el menú "Imagen" seleccione "Duplicar" para duplicar BKD. Seleccione la imagen duplicada y en el "proceso > filtros", seleccione "Desenfoque gaussiano" y especificar un radio de 50 píxeles.
- Aplanar la imagen BKD para que haya una distribución de intensidad uniforme efectiva de la fuente de luz de excitación dividiendo la imagen BKD la borrosa imagen de BKD, produciendo BKD_FLAT.
- "Proceso" seleccionar "imagen calculadora...", especificando la operación "Dividir", las imágenes requieren y seleccionando las cajas "Crear nueva ventana" y "resultado de 32 bits (float)".
- Restar cada píxel de la imagen 1 ("proceso > Matemáticas", seleccione "Restar..." y especificar un valor de 1). La intensidad del pixel media debe ser 0.
Nota: El campo aplanar e imágenes de fondo aplanado pueden revisarse fácilmente, ya que la suma de todos los píxeles debe ser 0 y cualquier desplazamiento restante puede compensarse más directamente. - Seleccione un área de píxeles 50 píxel × 50 en cualquiera de las 4 esquinas de la imagen BKD_FLAT. Medir la desviación de estándar de intensidad de pixel (σ) mediante la opción "Analizar" y "Medida".
Nota: Las estadísticas de la selección se presentará en una ventana de resultados. Determina antecedentes de lugar donde hay poco probable ser una alta densidad de las moléculas individuales. El área a medir puede seleccionarse manualmente usando las herramientas de selección de menú por defecto o por ejecutar la macro código "makeRectangle (x, y, ancho, altura)"; Esto crea una selección rectangular, donde x e y los argumentos son las coordenadas (en píxeles) de la esquina superior izquierda. - Ajuste del umbral de la imagen a 3σ y crear una imagen binaria SM_MASK.
- En "Imagen > ajustar", seleccione "Umbral..." y establecer el nivel de umbral bajo 3σ.
Nota: Pixeles cuyo valor está por debajo del umbral se establecen en cero y píxeles superior al umbral se establecen en 1. El umbral determina la confianza con la que píxeles thresholded pertenecen a una sola molécula.
- En "Imagen > ajustar", seleccione "Umbral..." y establecer el nivel de umbral bajo 3σ.
- En la imagen segmentada SM_MASK, valores de la intensidad del pixel ajuste a cero de los objetos que no tienen un tamaño de pixel de 4-92 y una circularidad de 0.5 - 1 por seleccionar "Analizar" seguido de "Analizar las partículas" y especificar el tamaño y la circularidad.
Nota: El tamaño de píxel deba ser optimizada para otro conjunto de fluoróforos y microscopio de ups. Debido al tipo de ruido de cámara píxeles solo pueden estar por encima de este umbral y no se descarta a pesar de no ser las moléculas individuales. El criterio de tamaño de pixel deseche correctamente dichos píxeles. Las moléculas individuales son generalmente de forma circulares. Un circularidad el valor 1 indica un círculo perfecto mientras que el valor a 0 indica una forma cada vez más alargada. Los objetos restantes son moléculas individuales y pueden ser contados. Una máscara puede configurarse para delimitar la zona de la mancha para discriminar sobre el terreno y fuera de lugar cuenta cada fotograma. Esto es más fácil para los marcos que adquirió en épocas posteriores cuando hay una señal suficiente sobre el terreno que luego puede ser aplicada a los marcos anteriores. - Para el mismo lugar de anticuerpo no congestionadas, carga y repita los pasos 3.1.1 - 3.1.7 para todos los marcos de imagen capturaron como una serie de tiempo resuelto adquirida post lisis. Utilice los tiempos de lisis en paso 2.3.5. para corregir cualquier curvas de enlace.
- Fiji (o Matlab) para cualquier punto de anticuerpo no congestionadas, carga la imagen adquirida antes de lisis (fondo, BKD).
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Sola molécula contando (régimen congestionado/analógica)
- Para calcular la intensidad promedio de una sola molécula, antes de proceder, repita los pasos 3.1.1 - 3.1.8.
- Se multiplican las imágenes BKD_FLAT y SM_MASK para producir una imagen por el que se asocian a las moléculas individuales valores de cero píxeles.
- Para realizar esto, en el menú de "Proceso", seleccione "Imagen calculadora...", especifique la operación "Multiplicar" y las imágenes necesarias y seleccione las cajas "Crear nueva ventana" y "resultado de 32 bits (float)".
- Suma todos los valores de intensidad del píxel al seleccionar "Analizar" y luego "Medida"; el resumen estadístico de la selección se presentará en una ventana de resultados. Dividir por el número de moléculas individuales contados según paso 3.1.8 para calcular la intensidad media por molécula única.
- Para cualquier anticuerpo congestionado lugar, carga la lisis de la imagen adquirida y aplanar con una imagen de fondo borroso según pasos 3.1.2 y 3.1.3.
- Restar cada píxel de la imagen aplanada de 1 ("proceso > Matemáticas", seleccione "Restar..." y especificar un valor de 1)
- Seleccione un área de píxeles 50 píxel × 50 en cualquiera de las 4 esquinas de la imagen y medir la desviación de estándar de intensidad de pixel (σ). Consulte el paso 3.1.5 para más detalles.
- Crear una máscara de imagen binaria estableciendo el umbral de la imagen a 3σ y establece valores de intensidad del píxel en cero de los objetos con un tamaño de menos de 4 pixel2. Para realizar esto, en el menú "Analizar", seleccione "Analizar partículas" y especifique el tamaño y la circularidad.
- Multiplicar la imagen spot aplanado anticuerpo congestionadas por la máscara de la imagen binaria.
- Para realizar esto, en el menú de "Proceso", seleccione "Imagen calculadora...", especifique la operación "Multiplicar" y las imágenes necesarias y seleccione las cajas "Crear nueva ventana" y "resultado de 32 bits (float)".
- Suma de las intensidades de píxeles restantes al seleccionar "Analizar" seguido por "Medida"; el resumen estadístico de la selección se presentará en una ventana de resultados.
- Dividir la suma de intensidades de píxeles por la intensidad media molécula única para calcular el número de moléculas individuales al lugar congestionado.
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Curva de calibración para cuantificación absoluta
- Repetir los apartados 1 y 2 para formar 10 gotitas direccionable de nL con el anticuerpo de detección en solución al 4% PBSA añadieron una proteína recombinante de concentración conocida.
- Realizar una serie de concentración de 102- 107 proteínas recombinantes por gota mediante la variación de la concentración conocida de la proteína recombinante a la solución. Se recomienda trabajar en términos de cantidad de proteínas por gota para hacer calibración de celda única de datos sencillo.
- Utilizar la serie de concentración datos en paso 3.3.2 para calibrar cualquier molécula única cuenta por punto a la abundancia de la proteína por gota y por la abundancia de proteínas de extensión por célula.
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Representative Results
Se determinó el número de copia absoluto basal proteína de p53 con la resolución de la célula en una línea de células de cáncer de colon humano, las células se. Demostramos cómo expresión de p53 puede variar en varios órdenes de magnitud y muestran una correlación positiva débil entre numero de celular proteína y tamaño de copia dentro de la población de la célula sea descansa.
Direccionable de gotita de Microarrays se forman cuando gotitas acuosas son dispensadas en lugares punto de anticuerpo y cubiertas con aceite. Aquí, las gotitas de apoyan un análisis de la proteína p53 sensible. Cubreobjetos se vistió con manchas de anticuerpo de captura usando un microarrayer contacto y un pin. El anticuerpo de captura anti-p53 está tomado de un kit de prueba comercial de ELISA. Las condiciones de impresión eran tales que captura puntos eran aproximadamente 100 μm de diámetro con una capacidad de captura máximo de 6,2 ± 0,5 x 105 proteínas por punto. 32
El uso de un aislador a cubreobjetos permite una mayor densidad de gotas que se formó ya que limita la expansión del aceite cerca puntos de captura de anticuerpos. En cada pozo del aislador gotas están formadas por dosificación de una solución acuosa, que luego es cubierta con aceite para evitar la evaporación (figura 1A). Una mínima cantidad de aceite se puede surtir para la gota; sin embargo, es útil distribuir una cantidad que llena cada aislador bien exactamente que es plana para la proyección de imagen de la superficie del aceite. Aisladores son comercialmente origen o hechos por hojas de acrílico de corte láser. Aisladores de silicona están disponibles pozos precortados en una matriz de 4 x 6 (n = 24), pero puede ser modificada a una matriz de 4 x 11 (n = 44) con un punzón de piel biopsia o varios agujeros. El láser de corte aislador en la figura 1B muestra una matriz de 100 pozos hexagonales de 2,89 m m, una separación centro a centro de 3,9 mm y una altura de 0,5 mm de diámetro máximo. Las gotitas pueden conservarse y permanecen estables durante largos períodos de tiempo (hasta 3 meses observado).
Las gotas se crean manualmente utilizando un aparato de fabricación casera, que traduce una boquilla de tubo concéntrico (figura 1), que está conectada a dos bombas de jeringa (figura 1A). La boquilla de tubería concéntrica se compone de una tubo capilar, la silicona fundida que dispensa la fase acuosa, a través de un tramo corto de tubería de la OJEADA, que dispensa la fase oleosa. Utilizando un microscopio, la boquilla se alinea con el punto del anticuerpo y las bombas primero serían dispensar la solución acuosa seguida inmediatamente por el aceite (Figura 1E, pasos 1-4). Una vez que se forman todas las gotitas en el ADM, un microinyector y amalgamas dentales (véase la tabla de materiales) se utilizan para la carga de cada gotita con una sola célula (figura 1). La micropipeta captaría una célula de un reservorio de células, dispensado en uno de los pozos en el chip, bien se puede traducir a una gotita y entonces penetra en el tapón del aceite para entregar el celular a la acuosa gota (figura 1, pasos 5-8).
Todos los puntos dentro de las gotitas son imágenes antes de la lisis y se utilizará para determinar el grado de atascamiento no específico a los puntos (figura 2A). Las células son completamente lisadas (incluyendo el núcleo) usando métodos ópticos. 31 óptica lisis depende de la fuerza de rotura de una burbuja de cavitación inducida por pulsos láser expansión para romper las células. Atención se debe hacer que la interfaz aceite-agua no ser perturbado por estos procesos limitando las energías del pulso y depositar las células de la interfaz del aceite/de agua. Una vez que las células son sometidas a lisis, la matriz es reflejada por microscopía TIRF utilizando un microscopio automatizado; Marcos se adquieren cada 10 min por 30 min y luego cada 20 minutos de un 60 minutos más. Las condiciones, tales como afinidad del anticuerpo, proteína difusión y volumen de la gota, son tales que el enlace de equilibrio se alcanza en la adquisición de 90 min. Una típica célula desplegable se muestra en la figura 2A.
El proceso de análisis de imagen para determinar a que la molécula única cuenta se representa esquemáticamente en la figura 2B. Imágenes de lugares o considerados no congestionadas, donde la concentración de la proteína blanco es tal que las moléculas individuales están bien separadas y distinguir fácilmente o congestionadas, donde la concentración de proteína objetivo es imágenes superiores y una sola molécula se superponen y son no más individualmente distinguible. Puesto que el perfil de excitación de la TIRF es desigual, es crucial que todos adquirieron imágenes ser plana-campo corregido. Se aplica un desenfoque gaussiano a un marco no congestionadas, que actúa como un filtro de suavizado para eliminar detalle y ruido y producir una imagen con el perfil promedio del perfil de excitación TIRF. Esta imagen procesada puede utilizarse para 'aplanar' la imagen original. Imágenes no congestionadas, donde, incluso en el equilibrio, hay pocas moléculas individuales, podrá ser tratado un marco para corregir a sí mismo. Este enfoque no es aplicable a un lugar congestionado, donde las moléculas individuales ocupan densamente el lugar y requiere una imagen de fondo a ser adquiridas para aplanar. Marcos aplanados son después thresholded píxeles con intensidad al menos 3 veces la desviación estándar de fondo además de su valor medio. Moléculas individuales entonces se detectan automáticamente al identificar píxeles agrupados 4-9 con circularidad mayor que 0.5 con las características de análisis de partículas de Fiji. De los resultados, se puede calcular la intensidad promedio de una sola molécula. Se utiliza para determinar el número de moléculas individuales en un lugar congestionado dividiendo la intensidad total punto de anticuerpos por la intensidad media conocida de una sola molécula. Estos pasos pueden automatizarse mediante el editor de scripts de Fiji.
Una serie de concentración se realiza para determinar el número de molécula única en el equilibrio en las gotitas con concentraciones conocidas de proteína recombinante p53 (Figura 3A). Las condiciones son tales que los puntos de anticuerpo de captura capturan una fracción de la proteína objetivo total, aproximadamente el 1% en la región de linealidad (105-108 proteínas por gotita R2 = 0.99). El nivel de fijación no específica de las gotitas es 187 ± 60 moléculas. Los resultados de los jalones de la célula entonces se pueden convertir para obtener las distribuciones del número de copia absoluta de proteínas por la célula. Figura 3B muestra la distribución de la expresión de proteína p53 absoluta en ser las células usando ADMs. Expresión de la proteína p53 en las células del ser, que puede ser asumido para ser genéticamente idénticos o muy similares, es un proceso estocástico. La distribución es similar a Gamma - asimétrico y unimodal con una cola larga. En consecuencia, la media (1,82 × 106 proteínas) puede subestimar la abundancia de proteína modal (bin 0 - 5,0 × 105 proteínas), y la desviación estándar (1,88 × 106 proteínas) no captura completamente las características de la distribución. Esta distribución es un ejemplo de la importancia de las mediciones de célula para capturar la heterogeneidad de la expresión de la proteína en la población celular, que de lo contrario se perdería al promediar con mediciones masivas. Parámetros adicionales para cada celda se pueden medir. Aquí, el volumen celular se estima midiendo cada diámetro de la célula antes de la lisis de la gota y suponiendo que la celda es aproximadamente esférica. Figura 3 muestra una comparación de número de copia absoluta de la proteína p53 en las células sea en función del tamaño de la célula. Hay una tendencia para que las células más grandes tienen un mayor número de copia total de p53. Curiosamente, es posible a partir de la distribución que existe coordinación entre la expresión de p53 y tamaño de la célula parece haber un número de copia mínimo de p53 por la célula; sin embargo, los mecanismos por los cuales esto se presenta requiere más investigación.
Figura 1: gotita direccionable Microarray aparato y Chip. (un) gotas son dispensadas manualmente usando un manipulador de 3 ejes para traducir una boquilla de tubo concéntrico. La gotita acuosa se distribuye en lugares específicos en un microarray de anticuerpo seguida por tapado de aceite. (b) el aislante permite una mayor densidad de gotas direccionables en el substrato por limitar la propagación del petróleo. Aisladores se pueden producir por hojas de acrílico de 0,5 mm de corte de láser. Para facilitar la visualización de las gotitas, azul tinte colorante se deposita utilizando el aparato en una). Escala de barra 10 m m, escala de inserción de barras 1 mm. (c) la boquilla de tubería concéntrica permite gotitas direccionables que se formará, montado como en el paso 1.2 del protocolo. (d) un microinyector y amalgamas dentales se utilizan para aislar las células en gotas direccionables individuales, preparadas como en el paso 1.3 del protocolo. (e) se muestra los pasos principales en el proceso de creación y carga gotitas direccionables. Un lugar de anticuerpos se encuentra con una etapa de traducción codificado (1) donde se alinea la extremidad del tubo capilar (2) y acuosos (3) y aceite (4) componentes son dispensados. Las células se pueden cargar usando un microcapillary de cristal (5-8), que repetidamente puede abordar la gotita acuosa (7) y depositar una célula (8). Escala de barras de 100 μm. La flecha roja (5) y (8) destaca la célula aislada y el recuadro de (8) muestra la célula aislada a alta magnificación (escala de la barra 10 μm). Porciones de esta figura se ha modificado de referencia12, reproducido con permiso de la Real Sociedad de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: pasos del análisis de la imagen. Cada punto de la matriz es periódicamente reflejada por microscopía TIRF hasta que se alcanza el equilibrio (tEq) (90 min para ensayo de p53). El tiempo de equilibrio depende de la t en solución, así como las afinidades de pareja de los anticuerpos para la proteína específica. a) imágenes de microscopía TIRF ejemplo sola molécula de fondo así como un ejemplo sola celda desplegable (escala bares 20 μm). Recuadro la imagen muestra una parte ampliada de la imagen de fondo con algunas moléculas individuales destacados por flechas rojas (escala de la barra 5 μm). b) esquema de análisis de imágenes detallada en el paso 3 del protocolo. Brevemente, hay dos regímenes amplios donde los puntos se pueden considerar moléculas no congestionada, solos son escasas y congestionada, donde la densidad de las moléculas individuales es tal que hay una superposición significativa y puede no ser individualmente identificables. Un paso crucial en el análisis de imagen es campo aplanar para eliminar el efecto del perfil de intensidad no uniforme de lo láser de excitación. En el régimen de cuenta digital, las moléculas individuales se identifican directamente, basado en sus parámetros de intensidad y forma. En el análogo régimen de conteo, el número de las moléculas individuales se calcula midiendo la intensidad total punto de equilibrio y dividiendo la intensidad media de una sola molécula, que es conocida por el régimen de cuenta digital. Pasos pueden automatizarse directamente en ImageJ para analizar los datos. La secuencia de imágenes con el panel inferior muestra la acumulación de la proteína diana en la captura de anticuerpos spot; inicialmente, los puntos no están congestionadas (t1) considerando como proteína diana se acumula en el lugar de los anticuerpos, las moléculas individuales pueden llegar a ser cada vez más congestionada (tn) hasta que se alcanza el equilibrio (teq). Nota que un punto sigue siendo no congestionadas o se congestiona depende de varios factores, en particular, la abundancia de la proteína diana en el volumen de análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: solo datos del celular. Cuantificación absoluta se realiza usando una curva de calibración. (una) sola cuenta de molécula se realiza con concentraciones conocidas de proteína recombinante. Esto es una curva de calibración se utiliza para convertir la molécula solo contada en cada punto a la cantidad de proteínas de la blanco en el volumen de análisis y por lo tanto, solo el número de copia de la célula. La línea punteada roja horizontal indica el nivel de fijación no específica de 187 ± 60 moléculas. Las barras de error son una desviación de estándar de la media de 3 experimental funciona. La línea discontinua representa el 100% de detección de la proteína. expresión de la proteína (b) una distribución de la célula basal p53 en las células cancerosas se aparece mostrando una distribución gamma-como cola larga donde la expresión de proteína p53 en algunas células es significativamente mayor que el valor modal. (c) dispersión parcela número de copia de p53 proteína por la célula en función del volumen de la célula que muestra cómo la expresión de la proteína varía en función del tamaño de la célula. Porciones de esta figura han sido modificadas desde 12 y reproducido con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Direccionable de gotita de Microarrays son un método sensible y extensible para determinar cuantitativamente el número de copia absoluta de proteína dentro de una sola célula.
Limitar el nivel de la Unión no específica (NSB) es fundamental en el protocolo para alcanzar hasta un límite de detección posible. Proteínas y otras especies bioquímicas no específicamente pueden obligar a un número de interfaces presentes dentro de las gotas, la superficie del cubreobjetos, el anticuerpo spot y la interfaz agua/aceite. Las proteínas se pueden perder por repartir en la interfaz o el aceite mismo. Hemos demostrado que 4% BSA presente en la gotita acuosa es capaz de limitar el NSB de proteínas usando los anticuerpos especificados en el protocolo. Objetivos alternativos de la proteína y los anticuerpos utilizados para su detección pueden requerir alternativas de bloqueo, estos detergentes no iónicos o compatible con tensioactivos. Aceites fluorados pueden también analizarse para su adecuación como el aceite tapado. En tales casos, deben hacerse consideraciones adicionales tales como la concentración micelar crítica y la densidad del aceite tapado.
El búfer impresión sin lavar, que se mantiene en cada punto después de colocar el SIDA en la alineación. Cuando inicialmente depositar las gotas, debe tener cuidado para no rayar o dañar el lugar de anticuerpo por la punta de la boquilla de tubería concéntrica. Desarrollar más el método, un colorante fluorescente puede ser dopado en el búfer de impresión de anticuerpo que queda inmovilizado además del anticuerpo de captura. Esto permitiría para el lavado y el bloqueo de pasos a realizar antes de colocar la gota; sin embargo, este paso no necesariamente sería necesario utilizando métodos automatizados de gota colocar como métodos de impresión de inyección de tinta.
La superficie de la comercialmente con cubreobjetos sobre el cual se forman gotas está recubierta con un polímero hidrofílico y las gotitas acuosas produce sobre ellos con un volumen de 10 nL tienen un diámetro de ± 751 42 mm. Hay un límite para cuánto la gota depositada debe mojar la superficie o extensiones debido al peso del aceite tapado ya que debajo de un espesor mínimo hay mayor dispersión óptica del láser TIRF excitación. La dispersión aumenta el nivel promedio de fondo y puede ahogarse señal al detectar las moléculas individuales. El lugar anticuerpo también debe ser situado lejos del borde de la gota ya la luz laser de la excitación puede parcialmente o totalmente la huelga un área fuera de la gotita acuosa. La condición de ángulo crítico ya no se cumplirán para la luz llama la atención la interfaz aceite cristal en comparación con la interfaz de agua de cristal.
Para determinar cuantitativamente la abundancia de la proteína el número de moléculas individuales a un punto debe ser determinada mediante análisis de imagen. Para determinar el total de la cantidad de proteína en la solución de la cuenta sola molécula una curva de calibración es necesario y permite la técnica para ser absolutamente cuantitativa.
Para minimizar el fotoblanqueo, manchas son imágenes continuamente y la TIRF excitación láser fuente de energía se reduce al mínimo. El protocolo presentado se ha utilizado con éxito para Fotoestables fluoróforos como el Alexa Fluor tintes. Fluoróforos alternativos pueden utilizarse pero debe evaluarse el fotoblanqueo y el protocolo imagen adaptada si es necesario. El número total de moléculas individuales por marco puede ser trazado contra el tiempo para reproducir la curva de enlace aunque esto ciertamente no es necesario que si la cinética de Unión no es buscados y proyección de imagen un solo cuadro en el equilibrio será suficiente.
Aunque hay un requisito de los dos anticuerpos de alta afinidad, esto resulta en un ensayo muy sensible y altamente específico, crucial para las mediciones en el nivel unicelular. Los anticuerpos p53 utilizados en el presente Protocolo están bien optimizados en la detección de p53 libre de células. La proteína Diana es determinada por la elección de anticuerpos y puede ser modificada en varias formas: 1, los anticuerpos de captura y detección pueden reemplazarse para enlazar objetivos alternativos; 2, el anticuerpo de detección puede ser reemplazado para probar las interacciones proteína-proteína o modificaciones poste-de translación de la proteína enlazado al anticuerpo de captura, por ejemplo, determinar el estado de fosforilación de p53 capturados; 3, ensayos multiplexados pueden lograr múltiples puntos de anticuerpo de captura en las inmediaciones de la impresión: impresión 3 × 3 matriz de punto es posible dentro de las gotas 10 nl. Por supuesto, para cualquier modificación en proteína diana una serie de pantallas de anticuerpo, optimizaciones y controles deben realizarse.
Se han reportado varios métodos para la lisis de las células. 33 lisis de óptica es un método libre de químicos rápidamente Lyse las células individuales sin alterar el contenido de las celdas y mantener la integridad de las proteínas y sus complejos. Lisis químico usando detergentes plantea un problema para la integridad de las gotas cuando se utiliza aceite mineral y puede interferir con las interacciones entre las moléculas. 34 sin embargo, para los ensayos donde la lisis química es compatible es atractivo enfoque puesto que no es dependiente de equipos tales como láseres o electrodos micropatterned. 35
Las gotitas muestran resultados comparables con métodos alternativos unicelular. En la actual generación de gotas usando los anticuerpos p53 sugerida, el nivel de NSB es 187 ± 60 moléculas por punto. Las cuentas sola molécula exhiben fuerte linealidad (R2 = 0.99) en la región que abarca 105 –108 recombinante p53 proteínas por gota. Esto sugiere que si bien pueden detectarse bajos niveles de proteína en las células, hay un límite de cuantificación de las proteínas p53 de 105 ; Esto corresponde a una sola molécula cuenta en los puntos de 901 ± 83. Esto predominante está limitado por el volumen de las gotas y adsorción en el interfaz. El rendimiento de la prueba de p53 es tal que cuando se realiza en un 10 nL volumen único 1.1 ± 0.2% de la proteína objetivo total es capturado de solución; Esto aumenta a 85 ± 9%, al reducir el volumen de análisis a 0,2 nL. 36 por reducir el volumen de las gotas debajo de 1nL y adsorción, existe la posibilidad mediante los anticuerpos especificados a p53 en la mejora del límite de detección para < 50 proteínas por la célula. Por lo tanto, direccionables gotas tienen el potencial de ser utilizado para medir las proteínas de muy baja abundancia de las células.
La direccionabilidad de las gotas de la tapa de aceite fácilmente penetrable permite el volumen de análisis celular secuencialmente desafiada. El uso de una micropipeta permite la inyección de un número de células en cada gotita en un tapón de 10-20 pL, que no aumenta significativamente el volumen. Para el chip se muestra en la figura 1B 100 pozos formar gotas y cargar con las células típicamente toma 75-90 minutos las células de carga también puede lograr tratar la gota usando el tubo inyector en vez de la micropipeta concéntricos o utilizando un solución que contiene las células al formar inicialmente las gotitas. Este último sería útil en limitar el número de pasos en el protocolo, pero en ambos casos, la ocupación por gota seguiría de a Poissonian distribución. Esto limitaría la proporción de datos de la celda solo por chip; sin embargo, las gotas con cero o varias células serviría como controles. Una limitación adicional en el uso de la boquilla concéntrica a gotitas de dirección es que el volumen de la gota aumentar en incrementos de 10 nl. Con las modificaciones sugeridas por encima de este pueden mejorarse. Gota de microfluídica es capaces de producir gotitas de alta frecuencia y tiene potencial de ser automáticamente combinado con ADMs para producir y manipular gotitas y depositarlas secuencialmente en un arreglo planar en el chip. Esto sin duda superaría las limitaciones en la producción de ADMs permitiendo también lectura sola molécula de gotitas.
La capacidad para abordar cada gota individual tiene una gama de posibles usos. Hemos demostrado la capacidad de cargar secuencialmente las células. También permite remover la lisis independiente post material celular y análisis post con una pipeta para el análisis de otros métodos. Posterior análisis algunos ejemplos de PCR cuantitativa en tiempo real o espectrometría de masa.
Uno de los actuales cuellos de botella para los laboratorios que desean adoptar un enfoque cuantitativo de análisis de la proteína unicelular es la alta barrera técnica y la necesidad de equipo especializado. Con ADMs, miniaturizados, análisis de alta sensibilidad pueden lograrse sin necesidad de instalaciones de sala limpia fabricar dispositivos lab-on-a-chip de microfluidos. Experimentos no están limitados por el diseño del chip y su volumen y su posición pueden ser alterados sin la necesidad de fabricar nuevos amos. Ciertamente, hay posibilidades de mejora en la simplificación de la técnica y bajar la barrera de entrada para el análisis unicelular a sólo un microarrayer, imprimir tanto anticuerpos y microarrays de gota y un lector de microplacas de fluorescencia, a imagen.
Un número de aplicaciones clínicas de análisis de la célula está surgiendo, particularmente en el tratamiento del cáncer. Heterogeneidad del tumor es un reto a la quimioterapia efectiva. En el desarrollo del tumor, las mutaciones se presentan con mayor frecuencia y puede provocar heterogeneidad morfológica, genética y la variabilidad de la proteómica. Análisis única célula son capaz de resolver heterogeneidad celular dentro de un tumor y proporcionar una plataforma para ayudar a comprender mejor y predecir la resistencia y guía de terapia con medicamentos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
ASR había diseñado experimentos, desarrolló protocolos y análisis de datos. SC y PS realizan experimentos de tamaño celular. ASR y OC escribieron el manuscrito. Los autores desean agradece el apoyo del Prof. David R. Klug para proporcionar acceso al equipo. Los autores desean agradecer la Imperial College avanzado Hackspace para acceso a instalaciones de prototipado y fabricación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
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