Summary
Här presenterar vi adresserbara droplet microarrays (ADMs), en droplet matris baserat metod kunna avgöra absoluta protein överflöd i enstaka celler. Vi visar ADMs förmåga att karakterisera heterogenitet i uttryck av den tumör suppressor proteinet p53 i en human cancer cellinje.
Abstract
Ofta cellulära beteende och cellulära svar analyseras på populationsnivå där svaren från många celler sammanförs tillsammans som ett Snittresultat maskering rik enskild cell beteendet inom en komplex befolkning. Enstaka cell protein detektering och kvantifiering tekniker har gjort en anmärkningsvärd effekt under de senaste åren. Här beskriver vi en praktisk och flexibel enda cell analysplattform baserad på adresserbara droplet microarrays. Denna studie beskriver hur absoluta kopia antalet målproteiner kan mätas med enstaka cell upplösning. Den tumör suppressor p53 är den vanligaste muterade genen i human cancer, med mer än 50% av totala cancerfall som uppvisar ett mönster med icke-friska p53 i uttryck. Protokollet beskrivs stegen för att skapa 10 nL droppar som enda mänskliga cancerceller är isolerade och kopia antalet p53 protein mäts med enda molekyl upplösning att exakt bestämma variabiliteten i uttryck. Metoden kan tillämpas på vilken celltyp inklusive primära material för att bestämma absoluta kopia antalet någon målproteiner sevärdheter.
Introduction
Målet med denna metod är att bestämma variationen i överflöd av ett målprotein i en cell befolkningen med enstaka cell upplösning. Enstaka cell analys ger ett antal fördelar som inte finns med traditionella ensemble biokemiska metoder. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 för det första arbetar på enstaka cellnivå kan fånga en cell befolkning som skulle annars förloras genom det genomsnitt som sker med traditionella ensemble biokemiska tekniker rika heterogenitet. Majoriteten av arbetshäst biokemiska metoder fungerar med huvuddelen, som kräver, som de ofta gör, miljontals celler att producera ett resultat. Naturligtvis, konsekvenserna av att bedöma hela cellpopulationer beror på ett antal faktorer, exempelvis heterogenitet i proteinuttryck där några viktiga funktioner av fördelningen av protein överflöd kan missas. Ur ett praktiskt perspektiv, den känslighet som krävs av enstaka cell tekniker gör dem kapabla att arbeta med mängder av biologiska material som är otillräcklig för ännu känsligare bulk teknik att fungera. Ett viktigt exempel på detta är studier av sällsynta celltyper såsom cirkulerande tumörceller (CTCs) där även för patienter med en dålig prognostisk outlook mindre än 10 CTCs kan finnas i en enda 7,5 mL blod rita. 6 här presenterar vi den metod som krävs för att utföra enstaka cell protein mätningar med en minskad volym antikroppsbaserade assay anställa olja-capped droppar tryckt på en antikropp microarray.
Mikroflödessystem droplet plattformar är hög genomströmning, kunna generera tusentals droppar per sekund, och kan isolera och även odling, enstaka celler i enskilda droppar att utföra en rad olika biokemiska analyser. Droplet-baserade tekniker är väl lämpade för enstaka cell analys,7,8,9 med anmärkningsvärda senaste exempel inklusive DropSeq10 och inDrop11, som har varit kraftigt med hjälp av kraften i förstärkning tekniker. Den begränsade mängden material och inga metoder för förstärkning av proteiner gör enstaka cell proteomik särskilt utmanande.
Droppar kan analyseras genom ett antal metoder och fluorescensmikroskopi har använts. Enda molekyl tekniker såsom totalreflexion fluorescensmikroskopi (Frida) tillåter fluorescerande molekyler för att visualiseras med oöverträffad signal-brus-förhållande. 12 på grund av exponentiell förfalla av fältet flyktig, endast fluorophores i hög närhet till ytan (efter 100nm) är glada att göra Frida en bra strategi att upptäcka små mängder av en målmolekyl i en komplex blandning. Inneboende optisk snittning styrkan av Frida också hjälper till att undvika tvätt steg och gränser assay tid och komplexitet. Men Frida kräver plana ytor och exempel på Frida mikroskopi tillämpas på droppar i flöde innebär bildandet av en plan yta som till bilden. 13 därför designa enstaka cell proteomiska tekniker ofta mikroflödessystem marker runt ytan-orörlig fånga agenter i en microarray format. 4 , 14
Droppar, själva, kan bildas i matriser på plana ytor, så kallade droplet microarrays. 15 , 16 , 17 rumsligt organisera droppar i matriser tillåter dem att bekvämt indexeras, enkelt övervakas över tid, individuellt riktat och, om så krävs, Hämtad. Droplet microarrays kan uppnå en hög täthet av mikro-reaktorer med tusentals element per chip som är antingen fristående eller stöds av mikrobrunn strukturer. 18 , 19 , 20 de kan bildas av sekventiell nedfall av vätskehantering robotar, inkjet spotters, kontakta microarrayers21,22,23,24,25, 26 eller de kan själv montera på ytor såsom superhydrophillic ställen mönstrade på en superhydrofobt yta. 27 , 28 , 29
Med dessa i åtanke utformades adresserbara Droplet Microarrays (ADMs) för att kombinera mångsidighet, fysisk adressering och minskade volymer av droplet microarrays med känsligheten hos enda molekyl Frida mikroskopi att kvantitativt mäta protein överflöd. 5 ADMs aktivera enda cell analys bildar en droplet microarray som innehåller enstaka celler över en antikropp microarray, som sedan är utjämnat med olja för att förhindra avdunstning. Volymerna av dropparna är diskret att förhindra prov förlust, som annars skulle uppnås genom på-chip ventilsystem i kontinuerligt flöde mikrofluidik. 30 den absoluta mängden målprotein från en enda cell är extremt liten; dock ger minskade volymen av droppar relativt hög lokal koncentration så att de upptäcks med en smörgås antikropp-analys - antikropp är orörlig i en särskild region, eller plats, på en yta som fångar protein vilket i sin tur binder till en fluorescently märkt detektionsantikropp närvarande i droplet volymen. Som en etikett-gratis strategi (dvs protein mål inte behöver märkas direkt), ADMs är allmänt tillämpliga på analysera celler från primära källor, såsom bearbetade blod behöver bra enkelarmade och dissocierade tumör biopsier, samt celler från kultur och deras lysates.
Mäta variationen i protein överflöd över en cell befolkningen är viktigt för att bestämma heterogeniteteten som svar, till exempel en drog och hjälper att ge inblick i cellulära funktioner och vägar, bedömning av subpopulationer och deras beteende samt identifiera sällsynta händelser som annars skulle maskeras av bulk metoder. Detta protokoll beskriver hur att producera och använda adresserbara droplet microarrays kvantitativt bestämma överflödet av de transkription faktorn p53 i mänskliga cancerceller och kan användas för att undersöka betydelsen av p53 svar på cellgifter. Målproteinet bestäms genom valet av avskiljning och identifiering av antikroppar och kan ändras för att omfatta mer eller olika mål. Instruktioner finns för att bygga en enkel apparater försedda med ett koncentriskt munstycke från allmänna lab förbrukningsartiklar till manuellt array 10 nL droppar utjämnade med olja. Full experimentella processen beskrivs whereby varje droppe laddas sedan med en enda cell, som sedan är lyserat och uttrycket av protein bestäms med enda molekyl upplösning med Frida mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning
-
Gör chips och print antikropp microarrays
- Bifoga en självhäftande silikon/akryl isolator till ett täckglas functionalized för att stödja en antikropp microarray. Detta benämns som chip.
Obs: Olika surface kemier har testats för sin lämplighet med adresserbara droppar. 5 surface kemier kan behöva optimeras för alternativa fånga agenter. ADM isolatorer finns kommersiellt eller kan produceras av laser skärning akryl (CAD fil för isolator som används i detta arbete ges som en nedladdning, se Kompletterande Code File). - Slå på microarrayer och inställd fuktighet på 75%.
Obs: relativ luftfuktighet minskar avdunstningen av utskriftslösning från microarray pin och minskar intra - och inter - spot variation. - Rengöra microarray stiftet i PIN-rengöringslösning för 5 min av ultraljud. Skölj den PIN-kod med ultrarent vatten med hjälp av en tvättflaska och torka med hjälp av kväve.
Obs: Avbryta PIN-koden när det gäller endast fördjupa pin spetsen. Ett objektglas med en på lämpligt sätt borrade hål hjälper om PIN-innehavare inte kan erhållas. - Göra 5 mL utskriftsbufferten bestående av 3 × saltlösning-natriumcitrat (SSC) buffert, 1,5 M betain kompletteras med 0,01% sodium dodecyl sulfate (SDS). Förvaras vid 4 ° C på obestämd tid.
- För att förbereda en utskriftslösning, Tina anti-p53 antikropp (p53/Mdm2 ELISA kit, se tabell av material) alikvoter som lagras vid-80 ° C. Blanda 1:1 med utskriftsbufferten till en slutlig koncentration på 0,5 mg/mL. Fyll 5-10 µL av utskriftslösning i en 384 väl-plattan med hjälp av en mikropipett och placera i microarrayer.
- Ladda marker monteras i steg 1.1.1 till microarrayer. Programmera microarrayer ut ställen på koordinater definieras genom mitten av varje brunn Frånkopplingsdonet.
Obs: Microarrayers anställa en rad, huvudsakligen, proprietär programvara och så läsaren uppmuntras att konsultera relevant litteratur. Den microarray krävs för ADM Frånkopplingsdonet skisserat i den tillhörande CAD-filen i steg 1.1.1 består av rektangulära element; de relevanta avstånd tillhandahålls. - Lagra marker i lufttäta behållare och Linda med folie. Lagra vid 4 ° C upp till 6 veckor.
Obs: Folien är att förhindra någon foto-skador. Lagring vid 4 ° C begränsar nedbrytningshastigheten av biomolekyler och eventuella skadliga reaktioner som kan agera för att minska microarray aktivitet. En lufttät behållare tillåter chips temperera vid rumstemperatur före användning utan kondens bildas på chip ytan. Kontakta microarray utskrift bedrifter ytspänning och vidhäftning mellan print lösningen och print substrat att producera ställen. Före utskrift eller läska krävs normalt att ta bort överflödig lösning från microarray stiftet ge jämnt stora ställen. Kasta inte det uppoffrande pre-print täckglaset eftersom det kan användas för att bedöma batch kvalitet.
- Bifoga en självhäftande silikon/akryl isolator till ett täckglas functionalized för att stödja en antikropp microarray. Detta benämns som chip.
-
Förbereda sprutor, slangen och koncentriskt munstycke för dispensering adresserbara droppar
- Demontera 100 µL (för vattenhaltiga droplet-programmet) och 1 mL (för tak oljan) glas Hamilton sprutor och skölj delar destillerat H2O.
- ID/360 µm OD foder en 100 mm längd 150 µm och smält kiseldioxid slangar genom 40 mm längd 1,0 mm ID/1/16 ”OD PFA slangen tills det sticker ut med 2 mm. Detta bildar koncentriska munstycket.
- Applicera ett tunt lager av cyanoakrylat lim till slutet av en 10 µL pipettspetsen och infoga i 40 mm lappa av 1,0 mm ID/1/16 ”OD PFA slangar. Om så krävs, flytta smält kiseldioxid slangen för att upprätthålla en 2 mm utstick vid munstycket innan de självhäftande uppsättningarna.
- Sätt in den andra änden av smält kiseldioxid kapillär i slutet av en 200 mm längd på 0,014 '' ID/0.062 ”OD PTFE-slangen och Anslut den till en 100 µL Hamilton spruta fylld med 4% bovint serum äggvita (BSA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (PBSA).
Obs: Proteiner och andra biokemiska arter kan icke-specifikt binder till ytor och kan förlorade eller denatureras. BSA är använd till 'kloss' ytor för att minimera icke-specifik bindning av uppoffrande bindande till dessa ytor. - Infoga en 400 mm längd på 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP slang i en 200 µL pipettspetsen tills den bildar en tätning. Applicera ett tunt lager av cyanoakrylat lim till en annan 200 µL pipettspetsen och driva detta i den första tipset att fixa slangen på plats. Anslut den öppna änden av 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP slangen till en 1 mL Hamilton spruta fylld med mineralolja.
- Sätt in 200 µL pipett tip församlingen i 10 µL pipettspetsen koncentriska munstycket. Placera sprutorna i separat sprutpumpar som de kommer att behöva drivas självständigt.
- Fyll 100 µL sprutan med 4% PBSA blockerande lösning. Tillbaka och spola 'aqueous' slangen med blockerande lösningen. Upprepa två gånger för totalt 3 spolar.
- Fyll sprutan 100 µL med 0,125 µg mL-1 detektionsantikropp (anti-p53 antikropp (-1) märkt med Alexa 488) i 4% PBSA och åter fästa slangar. Ersätta blockerande lösning i slangen med munstycket 25 µL upptäckt antikropp lösning.
- Skölj 'olja' slangen med mineralolja tills alla slangen och munstycket fylls med olja. Fyll 1 mL sprutan med mineralolja och åter fästa slangar. Fästa slang och munstycke vid en XYZ manipulator.
-
Förbered microinjector och micromanipulator
Obs: Stegen nedan göra särskild hänvisning till komponenter i microinjector och micromanipulator apparater anges i tabell av material, men är allmänt tillämpliga på alla sådana apparater.- Montera microinjector genom att fästa tryck slangen och kapillär innehavaren.
- Rotera långsamt kolv ratten tills mineralolja helt fyller linjen.
- Montera hållaren för kapillär i översättning huvud fästet.
- Fixa kapillären i kapillär hållaren med chefen grepp.
- Pipettera en lösning av 4% PBSA i en av brunnarna av Frånkopplingsdonet.
- Översätta med hjälp av micromanipulator och doppa spetsen av kapillären i lösningen.
- Fyll långsamt kapillären med 4% PBSA och lämna att blockera i 10 min.
- Mata ut microcapillary och svängbar översättningsmodulen så att församlingen framgår av chip.
2. bilda adresserbara droppar och belastning med enstaka celler
- Form adresserbara droppar
- Säkra chip på Mikroskop scenen.
Obs: Mikroskopet är en inverterad fluorescens automatiserade mikroskopet kan enda molekyl Frida försedd med en en kodad XY-scenen och en elektron att multiplicera kostnad – tillsammans enhetens kamera (EM-CCD). - Spela in Mikroskop scenkoordinaterna för varje plats i matrisen med hjälp av automatiserade Mikroskop kontroll programvara.
- Ställ in XYZ manipulatorn på Mikroskop scenen. Placera munstycket i en vinkel på 50-60°. Kontrollera att munstycket har tillräcklig längd och clearance att nå chipet. Ange den 'vatten' och 'olja' spruta pumpar att dosera 10 nL på 100 µL/min och 5 µL vid 100 µL/min, respektive.
Obs: Under beredning, en vattenlösning på huvudet av munstycket kan torka. - Dosera vattenlösning tills en pärla av vätska syns på huvudet av munstycket. Badda med en dammfri torka att ta bort den.
Obs: Beroende på antalet villkor under utredning, reservera ett antal brunnar som reservoarer för celler. För en enda cell/typ räcker en enda reservoar. - Med hjälp av automatiserade Mikroskop kontroll programvara, ange Mikroskop scenkoordinaterna till en antikropp plats i matrisen och fokus på täckglas ytan.
- Noga med att inte störa plats, använder XYZ manipulatorn, justera glas kapillär toppen av koncentriska munstycket till sidan av antikropp plats och fördela 10 nL i vattenlösning. Utan att flytta stadier, dispensera 5 µL av olja till cap vattenlösningen. Långsamt öka munstycket klart av droplet-programmet och flytta till nästa väl.
- Upprepa steg 2.1.6 för alla antikropp ställen i matrisen.
- Efter 30 min, bild alla ställen i matrisen med hjälp av automatiserade Mikroskop kontroll programvaran för att bestämma bakgrund av enstaka molekyler bundna till varje antikropp plats före lastningen celler.
- Säkra chip på Mikroskop scenen.
- Ladda adresserbara droppar med celler
- Ta bort cellen kultur kolvar från inkubatorn och lossa celler med hjälp av trypsin/EDTA-lösning.
Obs: I denna studie BE människors kolon carcinoma cell raden användes och odlade använder Dulbeccos modifierade Eagles Medium (DMEM) kompletteras med 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS) i en CO2 inkubator. - Om så krävs, fluorescently stain celler.
- Återsuspendera cellerna i en lösning av 0,125 μg/mL detektionsantikropp (anti-p53 antikropp (-1) märkt med Alexa 488) i 10% FBS i l-15 media. För att säkerställa en enda cellsuspension, filtrera cell lösningen genom en 40 µm pitch cell SIL.
- Räkna celler som använder en hemocytometer och späd eller koncentrera cell lösningen till en koncentration av 25-400 × 103 celler/mL. Detta säkerställer att cellerna sediment med tillräckligt avstånd till bekvämt manipulera microcapillary.
- Ladda enstaka celler i adresserbara droppar från reservoaren cell med hjälp av micromanipulator och microcapillary.
Obs: Icke-anhängare celler kan lastas i bulk till mikropipett och dispenseras taget i adresserbara små droppar. Trots blockering ytbehandling tenderar vidhäftande cellinjer att icke-specifikt hålla sig till microcapillary inre glasväggen och förloras. - Med en 10 × målsättningen att iaktta, använda microinjector som aspirerar en enda cell till microcapillary från reservoaren cell.
- Lagra micromanipulator skede koordinater om du använder en elektronisk manipulator scenen eller manuellt Observera z-placeringen.
- Dra tillbaka mikropipett genom att översätta den uppåt för att rensa 1 mm höjd av chip. Utföra detta manuellt med en joystick eller automatiskt med hjälp av funktionen ”mata ut” i ett elektronisk manipulator Stadium.
- Ställ in scenen koordinater till att av en adresserbara droplet med automatiserad Mikroskop styrprogram. 'Injicera' mikropipett genom att returnera det till lagrade (eller noterade) z-position. Utföra detta manuellt med en joystick eller automatiskt om du använder en elektronisk manipulator scenen.
Obs: Microcapillary kommer att genomborra tak oljan och placeras inom aqueous del av adresserbara droplet-programmet. - Fördela i cellen i adresserbara droplet-programmet med hjälp av microinjector. Volymen av en 10 nL adresserbara droplet ökar med mindre än 1%.
- Upprepa 2.2.5-2.2.9 för återstående adresserbara droppar lämnar några gratis för experimentell kontroll där adresserbara droppar inte innehåller en cell.
Obs: Ett enklare alternativ till lastning enstaka celler i adresserbara små droppar med hjälp av en microcapillary och micromanipulator är att ersätta lösningen i steg 1.2.8 med en lösning av detektionsantikropp i 4% PBSA innehållande celler vid en koncentration på 10 5 celler/mL, motsvarande 1 cell/10 nL. Enstaka cell beläggning blir Poissonian och cellkoncentrationen behöver optimeras.
- Ta bort cellen kultur kolvar från inkubatorn och lossa celler med hjälp av trypsin/EDTA-lösning.
- Lysera celler och bild array
- Bildcellerna i droppar med brightfield mikroskopi, inklusive eventuella fluorescens imaging.
Obs: Imaging tar ca 3 min till bild ~ 100 droppar genom en automatiserad Mikroskop. Utföra imaging med en 60 NA = 1.49 Oljeimmer mål. Inga filter krävs för brightfield imaging medan standardfilter uppsättningar används för fluorescens avbildning. - Bild alla ställen i matrisen med enda molekyl Frida mikroskopi.
Obs: Inställningar används eftersom i steg 2.3.1 med en specialiserad Frida filter set. Dessa bilder kommer att analyseras därefter i avsnitt 3 reda på bakgrund av enstaka molekyler bundna till varje antikropp plats före lysis. Enda molekyl bildåtergivning med totalreflexion fluorescensmikroskopi (Frida) tar cirka 5 min till bild ~ 100 ställen. - Fokusera på en cell i en adresserbara droplet. Uppnå fullständig optiska lysis genom att fokusera en enda 6 ns laser puls (våglängden 1064 nm, puls energier 14,1 ± 0,3 µJ per puls) nära platsen för cellen.
Obs: Laserpulsen sätter upp en expanderande kavitation bubblan att saxen cellen och frigör cellulära beståndsdelar in i droplet-volymen. 4 , 31 de mekaniska processerna på grund av laserinducerad lysis stör inte gränssnittet olja-vatten på låg puls energier. Optiska lysis tar normalt cirka 20-30 min att lysera 100 celler. Som diskuteras i avsnittet diskussion, finns det ett antal alternativa metoder att lysera enstaka celler om optiska lysis setup inte är möjligt. - Upprepa för alla cell-innehållande adresserbara droppar lämnar 5 gratis för experimentell kontroll där adresserbara droppar innehåller en un-lyserat cell.
- Notera den tid som varje cell är lyserat.
Obs: Dessa tider kommer att användas för att korrigera enskilda bindande kurvor för varje plats i steg 3.1.9. Ofta är det tillräckligt att notera de tider då de första och sista cellerna är lyserat och uppskatta resten förutsatt att ett tillräckligt konsekvent tiden mellan lysis händelser. - Förvärva enda molekyl bilder med Frida mikroskopi av alla ställen varje 10 min för de första 30 min sedan varje 20 min i ytterligare 60 minuter. Om bara intresserad av mängden protein bunden vid jämvikt, bild alla ställen efter inkubation chipet under 90 minuter vid rumstemperatur.
Obs: Tiden för att nå jämvikt beror på droplet volymen och tillhörighet av antikroppar används i analysen. Frida mikroskopi utförs med hjälp av en laser exciteringskälla på = 488 nm och 1,5 mW power mätt vid tillbaka bländare med en optisk wattmetern. Enda molekyl bilder förvärvas genom att ange inställningen förvärv på EM-CCD kameran till 900 ms förvärv tid, 16-bitars digitalisering med 1 MHz avläsning hastighet och en EM få faktor 10. Frånkopplingsdonet kan återanvändas genom att försiktigt ta bort täckglaset.
- Bildcellerna i droppar med brightfield mikroskopi, inklusive eventuella fluorescens imaging.
3. dataanalys
-
Enda molekyl räknar (icke-överbelastad/digitala regim)
- Med Fiji (eller Matlab), för någon icke-överbelastade antikropp plats, lasta imagen förvärvats före Lys (bakgrund, BKD).
Obs: Verksamheten i följande steg utförs rakt med Fiji bild analys programvara. En användarhandbok kan hittas på den följande länk https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html. - I Fiji, Välj BKD bilden. Välj ”duplicera” till dubbla BKD under menyn ”bild”. Välj Duplicera bilden och välj ”Gaussian Blur” under ”Process > filter”, och ange en Pixelradie av 50.
- Platta till BKD bilden så att det finns en effektiv enhetliga intensitet fördelning av magnetiseringen ljuskällan genom att dividera BKD bilden av den suddiga bilden BKD, producerar BKD_FLAT.
- Under ”Process” Välj ”bild kalkylator...”, ange åtgärden ”klyftan”, bilderna krävs, och att välja lådor ”skapa nytt fönster” och ”32-bitars (float) resultatet”.
- Subtrahera varje pixel i bilden av 1 (”Process > matematik”, Välj ”subtrahera...” och ange värdet 1). Den genomsnittliga pixel intensiteten ska vara 0.
Obs: Fält plattas och tillplattad bakgrundsbilder kan kontrolleras enkelt eftersom summan av alla pixlar ska vara 0 och eventuell återstående förskjutning kan kompenseras mer rättframt. - Välj en 50 pixel × 50 pixel område i någon av de 4 hörnen i den BKD_FLAT bilden. Mäta den pixel intensitet standardavvikelsen (σ) genom att välja ”analysera” och ”åtgärd”.
Obs: Den sammanfattande statistiken av valet kommer att presenteras i ett resultatfönster. Detta avgör off plats bakgrunden där det är osannolikt att en hög täthet av enstaka molekyler. Området skall mätas kan väljas manuellt med hjälp av standard-menyn urval verktyg eller genom att köra makrot kod ”makeRectangle (x, y, bredd, höjd)”; Detta skapar en rektangulär markering, där x och y argument är koordinater (i bildpunkter) i det övre vänstra hörnet. - Ange tröskelvärdet bild till 3σ och skapa en binär bild SM_MASK.
- Under ”bild > Justera”, Välj ”tröskeln...” och ange lägre tröskelvärdet till 3σ.
Obs: Pixel vars värde är under tröskelvärdet sätts till noll och pixlar överstiger tröskeln har angetts till 1. Tröskelvärdet avgör förtroendet som thresholded pixlar tillhör en enda molekyl.
- Under ”bild > Justera”, Välj ”tröskeln...” och ange lägre tröskelvärdet till 3σ.
- I bilden segmenterad SM_MASK, Ställ in pixel intensitetsvärden till noll av alla objekt som inte har en storlek på 4-9 pixel2 och en loopkontroll 0,5 - 1 genom att välja ”analysera” följt av ”analysera partiklar” och ange storlek och loopkontroll.
Obs: Pixelstorlek kan behöva optimeras för andra fluorophores och Mikroskop set ups. På grund av typ av kamera buller pixlar kan vara över denna tröskel och kasseras inte trots att inte ha enstaka molekyler. Pixel storlekskriteriet korrekt ignorerar sådana pixlar. Enstaka molekyler är allmänhet runda i formen. Loopkontroll värdet 1 anger en perfekt cirkel medan ett värde som närmar sig 0 indikerar en allt mer avlång form. De återstående objekten är enstaka molekyler och får räknas. En mask kan ställas in att avgränsa området av plats att diskriminera på platsen och off plats räknas per bildruta. Detta är lättare för ramar som förvärvats på senare tider när det finns en tillräcklig signal på plats som sedan kan tillämpas på tidigare ramar. - För samma icke-överbelastade antikropp plats, ladda och upprepa steg 3.1.1 - 3.1.7 för alla bild ramar fångas som en tid-löst serie förvärvade post lysis. Använd Lys gånger antecknade i steg 2.3.5. för att korrigera eventuella bindande kurvor.
- Med Fiji (eller Matlab), för någon icke-överbelastade antikropp plats, lasta imagen förvärvats före Lys (bakgrund, BKD).
-
Enda molekyl räknar (överbelastad/analog regim)
- För att beräkna Genomsnittligt intensiteten av en enda molekyl, innan du fortsätter Upprepa steg 3.1.1 - 3.1.8.
- Multiplicera bilderna BKD_FLAT och SM_MASK för att producera en bild där noll pixelvärden är associerade med enstaka molekyler.
- För att utföra detta, under menyn ”Process”, Välj ”bild calculator...”, ange åtgärden ”multiplicera” och bilderna krävs och välj lådor ”skapa nytt fönster” och ”32-bitars (float) resultatet”.
- Summera alla pixelvärden intensitet genom att välja ”analysera” och sedan ”åtgärd”; den sammanfattande statistiken av valet kommer att presenteras i ett resultatfönster. Dividera med antalet räknade enstaka molekyler per steg 3.1.8 att beräkna genomsnittliga intensiteten per enskild molekyl.
- För något överbelastade antikropp plats, ladda bild som förvärvats efter Lys och platta till med en suddig bakgrundsbild enligt steg 3.1.2 och 3.1.3.
- Subtrahera varje pixel i bilden tillplattad av 1 (”Process > matematik”, Välj ”subtrahera...” och ange värdet 1)
- Välj ett 50 pixel × 50 pixel område i någon av 4 hörn av bilden och mäta den pixel intensitet standardavvikelsen (σ). Se punkt 3.1.5 för detaljer.
- Skapa en binär Bildmask genom att ställa in tröskelvärdet bild 3σ och Ställ in pixel intensitetsvärden till noll av alla objekt med en storlek mindre än 4 pixel2. För att utföra detta, under menyn ”analysera”, Välj ”analysera partiklar” och ange storlek och loopkontroll.
- Multiplicera tillplattad överbelastade antikropp spot avbildningen med binär bild masken.
- För att utföra detta, under menyn ”Process”, Välj ”bild calculator...”, ange åtgärden ”multiplicera” och bilderna krävs och välj lådor ”skapa nytt fönster” och ”32-bitars (float) resultatet”.
- Summan av de återstående pixel stödnivåerna genom att välja ”analysera” följt av ”åtgärd”; den sammanfattande statistiken av valet kommer att presenteras i ett resultatfönster.
- Dividera summan av pixel intensiteter av genomsnittliga enda molekyl intensiteten att beräkna antalet enstaka molekyler bundna till överbelastade plats.
-
Kalibreringskurvan för absolut kvantifiering
- Upprepa avsnitten 1 och 2 att bilda 10 nL adresserbara droppar med detektionsantikropp i 4% PBSA lösning spetsade med en känd koncentration rekombinant protein.
- Utföra en koncentration serie 102- 107 rekombinanta proteiner per droppe av varierande kända koncentrationen av rekombinant protein tillsätts lösningen. Det rekommenderas att arbeta när det gäller antal proteiner per droppe att göra kalibrera enda celldata enkelt.
- Använd koncentration serien data i steg 3.3.2 att kalibrera någon enda molekyl räknas per plats till protein överflöd per droppe och av förlängning protein överflöd per enskild cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Absoluta basala protein kopia antalet p53 bestämdes med enstaka cell upplösning i en mänsklig kolon cancer cellinje, BE celler. Vi visar hur p53 uttryck kan variera över flera tiopotenser och visar ett svagt positivt samband mellan cell storlek och protein kopienumret inom vilande BE cell befolkningen.
Adresserbara Droplet Microarrays bildas när vatten droppar är expedieras på antikropp spot platser och utjämnade med olja. Här stöder droppar en känslig p53 protein assay. COVERSLIPS är klädd med capture antikropp fläckar med hjälp av en kontakt microarrayer och en PIN-kod. Anti-p53 fånga antikroppen tas från en kommersiell ELISA testkit. De utskrift förhållandena var sådana att fånga ställen var ungefär 100 µm i diameter med en maximal avskiljning kapacitet på 6,2 ± 0,5 x 105 proteiner per plats. 32
Användning av en isolator som bundna till täckglaset tillåter en högre täthet av droppar bildas eftersom det begränsar spridningen av olja till närliggande antikroppar tillfångatagandet ställen. I varje brunn Frånkopplingsdonet bildas droppar genom att man avskaffar en vattenlösning, som sedan är utjämnat med olja för att förhindra avdunstning (figur 1A). En minimal mängd olja kan expedieras till råga droplet-programmet; Det är dock lämpligt att avstå från ett belopp som fyller varje isolator väl exakt sådan att olja ytan är platt för avbildning. Isolatorer är antingen kommersiellt anskaffas eller görs av laser skärning akrylskivor. Silikon isolatorer är tillgängliga färdigskurna brunnar i en 4 x 6-matris (n = 24) men kan ändras till en 4 x 11-matris (n = 44) med hjälp av en biopsi eller flera hål läder punch. Lasern skär isolator i figur 1B visar en matris med 100 sexkantiga brunnar varje med en maximal diameter på 2,89 mm, en center-till-center separation av 3,9 mm och en höjd av 0,5 mm. Dropparna kan lagras och förblir stabila under en längre tid (observerats upp till 3 månader).
Droppar skapas manuellt med en hembyggda apparater, som översätter en koncentrisk slangar munstycket (figur 1 c), som är ansluten till två sprutpumpar (figur 1A). Koncentriska slangar munstycket består av en smält kiseldioxid kapillär, som doserar vattenfasen, matas genom en kort längd på PEEK slangar, som doserar fasen olja. Med Mikroskop munstycket justeras till en antikropp plats och pumparna skulle först avstå från en vattenlösning som omedelbart följs av oljan (figur 1E, steg 1-4). När alla droppar i ADM bildas, används en microinjector och micromanipulator (se tabell av material) att ladda varje droppe med en enda cell (figur 1 d). Mikropipett skulle fånga en cell från en reservoar av celler, förpackat i en av brunnarna på chip, översättas till ett droplet-program väl och sedan penetrera oljelocket för att leverera cellen till den vattenhaltiga droplet (figur 1 d, steg 5-8).
Alla ställen inom droppar är avbildade före lysis och används för att bestämma graden av icke-specifik bindning till platserna (figur 2A). Enstaka celler är fullt lyserat (inklusive kärnan) med hjälp av optiska metoder. 31 optisk lysis är beroende av klippande styrkan av en expanderande laser puls-inducerad kavitation bubblan att störa cellerna. Vård måste göras att gränssnittet olja och vatten inte störas av dessa processer genom att begränsa puls energierna och deponerar celler bort från gränssnittet olja/vatten. När celler är lyserat, är matrisen fotograferad av Frida mikroskopi med hjälp av ett automatiserat Mikroskop; ramar är förvärvade varje 10 min för 30 min och sedan varje 20 min i ytterligare 60 minuter. Villkor, till exempel antikropp affinitet, protein diffusion och droplet volym, är sådana att bindande jämvikt uppnås inom 90 min förvärvet. En typisk enda cell pulldown visas i figur 2A.
Processen för bildanalys avgöra den enda molekylen räknar avbildas schematiskt i figur 2B. Bilder av ställen som antingen anses vara icke-överbelastad, protein målkoncentration är sådan att enstaka molekyler är väl åtskilda och lätt skiljas, eller överbelastade, där protein målkoncentration är högre och enda molekyl bilder överlappar varandra och är inte längre individuellt distinguishable. Eftersom Frida excitation profilen är ojämn, är det viktigt att alla förvärvade bilder vara platt-fält korrigeras. En icke-överbelastade ram, som fungerar som en utjämnande filter ta bort detalj och buller och producera en bild med den genomsnittliga profilen av Frida excitation profilen tillämpas Gaussisk oskärpa. Detta bearbetade bilden får användas ' platta ' den ursprungliga bilden. För icke-överbelastade bilder, där även vid jämvikt, finns det några enstaka molekyler, kan en ram behandlas för att korrigera sig själv. Detta tillvägagångssätt är inte tillämplig på en överbelastad plats, där enstaka molekyler tätt upptar plats och kräver en bakgrundsbild förvärvas för tillplattning. Tillplattad ramar är då thresholded för pixlar med intensitet minst 3 gånger standardavvikelsen bakgrund plus dess medelvärde. Enstaka molekyler upptäcks sedan automatiskt genom att identifiera 4-9 klustrade pixlar med loopkontroll större än 0,5 använda Partikelanalys funktioner i Fiji. Från resultaten, kan genomsnittliga intensiteten av en enda molekyl beräknas. Det används för att bestämma antalet enstaka molekyler på en överbelastad plats genom att dividera antikropp spot totala intensiteten av kända genomsnittliga intensiteten av en enda molekyl. Dessa steg kan automatiseras med hjälp av Fijis Skriptredigeraren.
En koncentration serie utförs för att bestämma antalet enda molekyl vid jämvikt i droppar med kända koncentrationer av rekombinant p53 protein (figur 3A). Villkoren är sådana att fånga antikropp fläckarna fånga en bråkdel av det totala målproteinet, cirka 1% i regionen av linearitet (för 105-108 proteiner per droplet R2 = 0,99). Icke-specifik bindning i droppar är 187 ± 60 molekyler. Resultaten av den enda cell pulldowns kan sedan konverteras för att uppnå distributioner av absoluta protein kopia antal per cell. Figur 3B visar fördelningen av absoluta p53 proteinuttryck i enstaka BE celler använder ADMs. P53 proteinuttryck i BE celler, som kan antas vara genetiskt identiska eller mycket lika, är en stokastisk process. Fördelningen är Gamma-liknande - asymmetriska och unimodala med en lång svans. Följaktligen, medelvärdet (1,82 × 106 proteiner) kan överskatta det modala protein överflödet (bin 0 - 5,0 × 105 proteiner) och standardavvikelsen (1,88 × 106 proteiner) fullt ut fånga inte funktioner i distributionen. Denna fördelning är ett exempel på vikten av enstaka cell mätningar att fånga heterogenitet proteinuttryck i cell befolkningen, som annars skulle gå förlorade när genomsnitt med bulk mätningar. Ytterligare parametrar för varje cell kan mätas. Här, uppskattas cellvolym genom att mäta varje cell diameter före lysis i droplet-programmet och förutsatt att cellen är ungefär sfäriska. Figur 3 c visar en jämförelse av p53 absoluta protein kopienumret i enstaka BE celler som en funktion av cellstorleken. Det finns en tendens för större celler för att ha en högre totala p53 kopia nummer. Intressant, är det möjligt från fördelningen att det förekommer samordning mellan p53 uttryck och Cellstorlek eftersom det verkar finnas en minsta p53 kopia antal per cell; mekanismerna genom vilka detta uppstår kräver dock ytterligare utredning.
Figur 1: adresserbara Droplet Microarray apparater och Chip. (en) droppar fördelas manuellt med en 3-axlig manipulator för att översätta en koncentrisk slangar munstycke. Den vattenhaltiga droplet dispenserats vid specifika platser i en antikropp microarray följt av tak olja. (b), Frånkopplingsdonet möjliggör en högre täthet av adresserbara vattendroppar på substratet genom att begränsa spridningen av oljan. Isolatorer kan framställas genom laser skärning 0,5 mm akrylskivor. Stöd visualisering av droppar, blå karamellfärg dye deponeras med användning av utrustning i en). Skala bar 10 mm, infälld skala bar 1 mm. (c) det koncentriska slangar munstycket tillåter adresserbara droppar att bildas, monterade som i steg 1.2 i protokollet. (d) en microinjector och micromanipulator används för att isolera cellerna in individuellt adresserbara droppar, tillagad som steg 1.3 i protokollet. (e) de stora steg i processen att skapa och lastning adresserbara droppar visas. En antikropp plats ligger med en kodad översättning stage (1) där spetsen av kapillär slangen justeras (2) och vattenlösning (3) och sedan olja (4) komponenterna är förpackat. Enstaka celler får belastas med ett glas microcapillary (5-8) som upprepade gånger kan lösa den aqueous droplet (7) och sätta in en cell (8). Skala barer 100 µm. Den röda pilen i (5) och (8) belyser den isolerade enstaka cellen och infällt av (8) visar isolerade enda cellen vid hög förstoring (skala bar 10 µm). Delar av denna siffra har ändrats från referens12, återges med tillstånd av The Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bild analys steg. Varje plats i matrisen är regelbundet fotograferad av Frida mikroskopi tills jämvikt (tEq) nås (90 min för p53 assay). Equilibrium tiden beror på t i lösning samt tillhörigheter av antikropparna par för riktade proteinet. (a) exempel enda molekyl Frida mikroskopi bilder av bakgrunden samt ett exempel enda cell pulldown (skala barer 20 μm). Infälld bild visar en förstorad del av bilden med några enstaka molekyler markerat med röda pilar (skala bar 5 μm). (b) disposition av bildanalys som beskrivs i steg 3 i protokollet. Kortfattat, det finns två breda regimer där fläckarna kan anses icke-överbelastad, enstaka molekyler är gles och överbelastade, tätheten av enstaka molekyler är sådan att det finns en betydande överlappning och kan inte längre vara ensamma identifierbara. Ett avgörande steg i bildanalys är fältet flackare för att ta bort effekten av icke-enhetlig intensitet profilen av magnetiseringen laser. I den digitala cykliska regimen identifieras enstaka molekyler direkt, baserat på deras intensitet och form parametrar. I det analoga räknar regim, beräknas antalet enstaka molekyler genom att mäta den totala spot intensiteten vid jämvikt och dividera med genomsnittliga intensiteten av en enda molekyl, som är känd från den digitala cykliska regimen. Stegen kan automatiseras rakt i ImageJ att analysera data. Nedre panelen bildsekvensen visar ansamling av målprotein på antikroppar tillfångatagandet plats; initialt, ställen inte är överbelastad (t1) som målprotein ackumuleras på antikropp plats, de enstaka molekylerna kan blivit alltmer överbelastad (tn) tills jämvikt nås (teq). Observera att om en plats är fortfarande icke-överbelastad eller blir överbelastade beror på ett antal faktorer, i synnerhet överflödet av målproteinet i volymen analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: enda celldata. Absolut kvantifiering uppnås med hjälp av kalibreringskurvan. (en) enda molekyl räknas görs med kända koncentrationer av rekombinant protein. Detta är en kalibreringskurva och används för att konvertera enda molekyl räknas på varje plats till antal målproteiner i analys volymen och därmed enda kopia mobilnummer. Den horisontella röda streckade linjen indikerar nivån på icke-specifik bindning av 187 ± 60 molekyler. Felstaplar är en standardavvikelsen för medelvärdet av 3 experimentella körs. Den streckade linjen representerar 100% upptäckt av protein. (b), en fördelning av den enda cell basala p53 proteinuttryck i BE cancerceller visas visar en lång-tailed gamma-liknande fördelning där p53 proteinuttryck i vissa celler är betydligt högre än det modala värdet. (c), Scatter plot av p53 protein kopia nummer per cell som en funktion av cellvolym visar hur proteinuttryck varierar som en funktion av cellstorleken. Delar av denna siffra har modifierats från 12 och Reproducerad med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adresserbara Droplet Microarrays är en känslig och utbyggbar metod för att kvantitativt bestämma absoluta kopia antalet protein i en enskild cell.
Att begränsa nivån på icke-specifik bindning är (NSB) kritiska, i protokollet till att uppnå som låg en detektionsgräns som möjligt. Proteiner och andra biokemiska arter kan icke-specifikt binder till ett antal gränssnitt inom droppar — täckglas ytan, antikroppen spot och gränssnittet olja/vatten. Proteiner kan förloras genom uppdelning i gränssnittet eller oljan själv. Vi har visat att 4% BSA i vattenlösning droplet-programmet kan begränsa NSB av proteiner med hjälp av de antikroppar som anges i protokollet. Alternativa protein mål och de antikroppar som används för att upptäcka dem kräva alternativa blockerande metoder, sådan icke-joniskt rengöringsmedel eller kompatibel tensider. Fluorerade oljor kan också testas för sin lämplighet i tjänstgör som tak oljan. I sådana fall måste ytterligare överväganden såsom kritiska micelle koncentrationen och tätheten av tak oljan göras.
Otvättade utskrift bufferten, som återstår på varje plats plats efter arraying aids i anpassningen. Vid initialt insättning droppar, måste försiktighet iakttas inte repar eller skadar antikropp plats genom spetsen av koncentriska slangar munstycket. Utveckla metoden vidare, kan ett fluorescerande färgämne dopas in i antikropp utskrift bufferten som blir orörlig förutom fånga antikroppen. Detta skulle möjliggöra tvätt och blockera steg som ska utföras före droplet arraying; dock skulle ett sådant steg inte nödvändigtvis krävas om använder automatiserade metoder av droplet arraying som till exempel inkjet tryckmetoder.
Ytan av den kommersiellt odlade coverslips som droppar bildas är belagd med en hydrofil polymer och vattenhaltiga droppar nL produceras på dem med en volym av 10 och har en diameter på 751 ± 42 mm. Det finns en gräns för hur mycket insatta droplet-programmet bör våta ytan eller sprider på grund av vikten av tak oljan eftersom under en minsta tjocklek finns ökade optiska scatter från Frida excitation lasern. Scatter ökar den genomsnittliga nivån av bakgrund och kan överrösta signal när upptäcka enstaka molekyler. Antikropp plats måste också finnas med droplet eggen eftersom excitation laserljuset kan delvis eller helt slå ett område utanför aqueous droplet-programmet. Villkoret kritiska vinkeln kommer inte längre att uppfyllas för ljuset slående glas-olja gränssnittet i motsats till glas-vatten gränssnittet.
För att kvantitativt bestämma överflödet av protein antalet enstaka molekyler bundna till en plats måste bestämmas genom bildanalys. För att bestämma totalen mängden protein i lösning från den enda molekyl räkningen en kalibreringskurva krävs och möjliggör tekniken att vara absolut kvantitativa.
För att minimera fotoblekning, fläckar är inte avbildade kontinuerligt och Frida excitation laser källa kraften minimeras. Protokollet som presenteras har använts framgångsrikt för fotostabilt fluorophores såsom den Alexa Fluor färgämnen. Alternativa fluorophores kan användas men fotoblekning måste bedömas och imaging protokollet anpassas vid behov. Det totala antalet enstaka molekyler per bildruta kan plottas mot tiden att reproducera bindande kurvan även om detta inte är absolut nödvändigt om bindande kinetik inte är eftertraktade och imaging en enda bildruta vid jämvikt kommer att räcka.
Även om det finns ett krav på två hög affinitet antikroppar, resulterar detta i en mycket känslig och mycket specifika assay, avgörande för mätningar på enstaka cellnivå. P53 antikroppar används i detta protokoll är väl optimerade att upptäcka gratis p53 från enstaka celler. Målproteinet bestäms genom valet av antikroppar och kan ändras i ett antal olika sätt: 1, både fånga och upptäcka antikroppar kan ersättas för att binda alternativa mål. 2, detektionsantikropp kan ersättas för att undersöka protein-protein interaktioner eller post-translationella modifieringar till proteinet bunden till fånga antikroppen, t.ex. fastställa phosphorylation status fångade p53; 3, multiplexade analyser kan uppnås genom att skriva ut flera capture antikropp ställen i närheten – skriva ut en 3 × 3 plats matris är möjligt inom 10nL droppar. Naturligtvis, för varje ändring av målprotein ett antal antikroppar skärmar, måste kontroller och optimeringar genomföras.
Flera metoder för lyseringslösning enstaka celler har rapporterats. 33 optisk Lys är en kemikaliefri metod för att snabbt lysera enskilda celler utan att ändra innehållet i celler och att upprätthålla integriteten av proteiner och deras komplex. Kemisk Lys använder rengöringsmedel utgör ett problem till droppar integritet när du använder mineralolja och kan störa samspelet mellan molekyler. 34 dock för analyser där kemisk Lys är kompatibla är det attraktiva strategi eftersom det inte är beroende av utrustning såsom laser eller micropatterned elektroder. 35
Droppar Visa jämförbara prestanda med alternativa enda cell metoder. I den nuvarande generationen av droppar med de föreslagna p53-antikropparna, är nivån på NSB 187 ± 60 molekyler per plats. Den enda molekyl räknas uppvisar stark linearitet (R2 = 0,99) i regionen som sträcker sig 105 –108 rekombinant p53-protein per droppe. Detta tyder på att även lägre nivåer av protein kan upptäckas i celler, det finns en gräns för kvantifiering av 105 p53-protein; Detta motsvarar en enda molekyl räkna på fläckarna av 901 ± 83. Detta är huvudsakligen begränsat av volymen av droppar och adsorption till gränssnittet. Utförandet av p53 analysen är sådan att när de utförs i en 10 nL volym bara 1,1 ± 0,2% av det totala målproteinet fångas från lösning; Detta ökar till 85 ± 9% när volymreducera analys till 0,2 nL. 36 genom att minska volymen av droppar till nedanför 1nL och minska adsorption, det finns potential med de angivna antikropparna att p53 att förbättra detektionsgränsen till < 50 proteiner per cell. Adresserbara droppar har därför potential att användas för att mäta mycket låga överflöd proteiner från enstaka celler.
Adressering av droppar ges genom oljelocket lättgenomträngliga tillåter cell analys volymen utmanas sekventiellt. Användningen av en mikropipett ger en injektion av ett önskat antal celler i varje droppe i en plugg för 10-20 pL, som inte avsevärt ökar volymen. För chip visas i figur 1B med 100 brunnar, att bilda droppar och ladda dem med enstaka celler normalt tar 75-90 min. lastning celler kan också uppnås genom att ta itu med droplet-programmet med hjälp av koncentriska rör munstycke i stället för mikropipett eller använda en lösning som innehåller celler när initialt bildar droppar. Den senare skulle vara användbar i att begränsa antalet steg i protokollet men i båda fallen, beläggningen per droppe skulle följa en Poissonian fördelning. Detta skulle begränsa andelen enda celldata per chip; droppar med noll eller flera celler skulle dock tjäna som kontroller. En ytterligare begränsning i med koncentriska munstycket till adress droppar är droplet volymen skulle öka i 10nL steg. Med de föreslagna ändringarna ovan detta kan förbättras. På-chip droplet mikrofluidik kan producera droppar på hög frekvens och har potential i att automatiskt kombineras med ADMs att producera och manipulera droppar och sekventiellt sätta in dem i ett planar array. Detta skulle verkligen övervinna begränsningarna i produktionen av ADMs samtidigt också som enda molekyl avläsning av droppar.
Förmågan att hantera varje enskild droplet har en rad möjliga användningsområden. Vi har visat möjligheten att sekventiellt ladda enstaka celler. Det tillåter också avlägsnande av obundna cellulära material post lysis och post analys med pipett för analys med hjälp av andra metoder. Exempel på efterföljande analys skulle kvantitativ realtids-PCR eller mass-spektrometri.
En av de nuvarande flaskhalsarna för laboratorier som vill ta en kvantitativ metod till enstaka cell proteinanalys är det höga tekniska hindret och behov av specialutrustning. Med ADMs, miniatyriserade, kan hög känslighetsanalyser uppnås utan att behöva rena rumsfaciliteter att fabricera mikroflödessystem lab-on-a-chip enheter. Experiment är inte begränsade av utformningen av chip och deras volym och position kan ändras utan att behöva tillverka nya mästare. Visst finns det utrymme för förbättring i förenkla tekniken och sänka inträdeshindret för enstaka cell analys till bara en microarrayer, skriva ut både antikroppar och droplet microarrays och en fluorescens microplate reader, bild.
Ett antal kliniska tillämpningar av enstaka cell analys växer fram, särskilt i behandling av cancer. Tumör heterogenitet är en stor utmaning att effektivt kemoterapi. I tumörutveckling, mutationer uppstår allt oftare och heterogenitet kan resultera i morfologisk, genetiska, och proteomiska variabilitet. Enstaka cell analys är kunna lösa cellulära heterogenitet inom en tumör och ge en plattform för att bättre förstå och förutsäga läkemedelsbehandling motstånd och guide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
ASR designad experiment, utvecklat protokoll och analyserade data. SC och PS utförde cell storlek experiment. ASR och OC skrev manuskriptet. Författarna vill tacksamt erkänner stöd av Prof. David R. Klug för att ge tillgång till utrustning. Författarna vill tacka de Imperial College avancerade Hackspace för tillgång till tillverkning och prototyping faciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al.
- Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
