Summary
Her præsenterer vi protokoller for indsamling og microinjecting precellular vestlige majs rodorm embryoner med henblik på udførelse af funktionelle-genomisk assays kønscelleoverførsel transformation og CRISPR/Cas9-genom-redigering.
Abstract
Majs-rodorm (VIF) er en vigtige skadedyr af majs og er kendt for sin evne til hurtigt tilpasse sig til pest forvaltningsstrategier. Selvom RNA-interferens (RNAi) har vist sig for at være et effektivt redskab til at studere VIF biologi, har den sine begrænsninger. Specifikt, RNAi selv er forbigående (dvs. ikke resulterer i langsigtede mendelske arv af de tilknyttede fænotype), og det kræver at vide DNA-sekvens af target-genet. Sidstnævnte kan være begrænsende hvis Fænotypen af interesse er kontrolleret af dårligt bevarede, eller endda nye gener, fordi at identificere nyttige mål ville være udfordrende, hvis ikke umuligt. Antallet af værktøjer i VIFS genomisk værktøjskasse bør derfor udvides ved udviklingen af metoder, der kunne bruges til at skabe stabile mutantstammen og aktiverer sekvens-uafhængige undersøgelser af VIF genom. Heri, detalje vi de metoder, der anvendes til at indsamle og microinject precellular VIF embryoner med nukleinsyrer. Mens de protokoller er beskrevet heri er rettet mod oprettelsen af transgene VIF, kan CRISPR/Cas9-genom-redigering også udføres ved hjælp af de samme protokoller, med den eneste forskel er sammensætningen af opløsningen injiceres embryoner.
Introduction
Majs-rodorm (VIF), Diabrotica virgifera virgifera, er et vigtigt skadedyr af majs1. Interessant, VIF synes at overvinde kontrol foranstaltninger hurtigere end mest landbrugs skadedyr, da de ikke kun tilpasse fysiologisk men også behaviorally2,3,4,5, 6. i det sidste årti, RNA-interferens (RNAi), en kraftfuld funktionelle genomisk værktøj, er blevet undersøgt som en potentiel kontrol metode for VIF7,8, og er også blevet brugt som et middel til at studere gen funktion9. Men mens RNAi udføres ofte ved mikroinjektion af dobbelt-strenget RNA (dsRNA) i andre arter, injektion-baserede RNAi er sjældne i VIF. I virkeligheden er der kun få rapporter om RNAi via mikroinjektion af dsRNA i VIF9. Årsagen er, at VIF kan nå høje niveauer af genet knockdown via indtagelse af dsRNA7,10, selv tillader undersøgelse af embryonale effekter ved at fodre dsRNA mor11. Mens denne metode gør VIF et glimrende emne for genomisk funktionalanalyse via RNAi, er det aftaget fremskridt på udvikling af metoder til embryonale mikroinjektion i denne art.
Trods effekt af RNAi er der et par ulemper. For eksempel, reagere ikke alle gener lige så at RNAi. Denne variation kan gøre fortolkningen af en funktionel genomforskning assay vanskeligere. Også, RNAi er forbigående og genererer ikke arvelige mutationer. På den anden side kan kønscelleoverførsel transformation, en anden funktionel genomisk værktøj, generere arvelige mutationer via indsættelse af en markant varemærkeregistreringer element i genom12,13. Dette gør kønscelleoverførsel transformation et fremragende værktøj til at skabe mutantstammen til brug i langsigtede genetiske undersøgelser. Transformationen kan også bruges til at redde en mutation ved at levere en funktionel kopi af genet til en mutant genom14. Derudover er kønscelleoverførsel transformation hjørnestenen i en bred vifte af molekylær genetiske teknikker. Ud over udskære og/eller redning genfunktion, kan kønscelleoverførsel transformation bruges til forstærker fældefangst15, gen fældefangst16, Gal4-baserede Ektopisk udtryk17og genome-wide mutagenese18.
For nylig er blevet udviklet værktøjer, der aktiverer sofistikerede genom-redigering. Disse værktøjer omfatter transskription Activator-Like effektor nukleaser (TALEN) og CRISPR/Cas9-nukleasen system19,20. Fordelen ved disse nye værktøjer er, at de tilbyder forskere evne til at fremkalde en dobbelt-strenget DNA pause på næsten ethvert sted inden for næsten alle genom. Når induceret, disse pauser kan repareres via enten ikke-homologe ende sammenføjning, som kan præsentere sletninger eller indrykninger i målrettede genet, eller homologi-instrueret reparation, som i tilstedeværelse af en manipuleret konstruktion, kan katalysere den udskiftning af hele gener eller genetiske regioner21,22. Disse metoder kræver dog mikroinjektion af DNA, RNA og/eller protein i meget ung embryoner.
Vigtigere, i modsætning til dsRNAs anvendes til RNAi, nukleinsyrer og proteiner anvendes for kønscelleoverførsel kan ikke transformation og genom-redigering nemt krydse cellemembraner. Derfor skal mikroinjektion af plasmid DNAs, mRNAs og/eller proteiner finde sted under syncytial blastoderm fase (dvs. før den insekt embryo cellularizes). Dette gør timingen af injektioner en kritisk faktor. For eksempel i Drosophila melanogasterskal embryoner sprøjtes inden for to timer efter æg lå12. Derfor, udvikling af en vellykket embryonale mikroinjektion protokol for VIF skal tage hensyn de bedste betingelser for kvindelige æglægning, samt den bedste metode til at indsamle tilstrækkelige mængder af precellular embryoner.
Et forsøg på at bringe en bred vifte af molekylær genetiske værktøjer til at bære på VIF biologi kræver udvikling af metoder til indsamling og microinjecting precellular VIF embryoner. Her leverer vi detaljerede instruktioner, sammen med tips og tricks, til at hjælpe andre anvende transformation-baserede teknikker i VIF forskning. Ud over at udvide transgene teknologier til VIF til brug i funktionelle genomisk undersøgelser, aktiverer disse teknikker også kraftfulde nye pest control strategier såsom gen drev23,24 skal testes i denne økonomisk vigtige skadedyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. koloni-niveau opdræt af VIF voksne
- Få en tilstrækkelig mængde af VIF voksne (500-1.000) fra en pålidelig virksomhed eller forskning laboratorium (Se Tabel af materialer for eksempel) og placere i en 30 cm3 bur.
Bemærk: Brug af en ikke-diapausing stamme er stærkt anbefales. - Forberede VIF kunstig kost efter producentens protokol og hæld et 1 cm tykt lag i en 38 ounce container (Se Tabel af materialer). Efter blanding, skal du gemme ubrugte kost ved 4 ° C i op til 2 måneder.
- Sætte en petriskål (100 x 15 mm) med Voksen kost (10-15 g) i en 30 cm3 bur. Tilføje flere kost, når maden er lav eller tør.
- Sætte en kolbe (300 mL) med vand, dækket med et stykke vat, som bruges til at holde på plads en bomuld roll (6 "x 3/8"), til at tjene som en vandkilde. Skift vandet, når det løber tør.
- Vedligeholde VIF ved 26 ° C med 60% fugtighed og en 14:10 lys cyklus i insekt opdræt inkubator.
2. Foster samling og justering
- Gøre et æg samling kammer ved hjælp af 1% agar i vand i en steril 100 x 15 mm2 petriskål. Opbevares ved 4 ° C efter agaren størkner.
- For at samle nylagte æg, placere en enkelt lag af filtrerpapir, efterfulgt af 4 lag af ostelærred (hver klippe til størrelse) på overfladen af agaren (figur 1A).
Bemærk: Ostelærred kan genbruges, efter at være blevet vasket i blegemiddel og autoklaveres, men det er ikke nødvendigt at gøre dette til den første brug. Filtrerpapir må ikke genbruges og behøver ikke at blive steriliseret. - Sted æg indsamling plade i VIF buret så sent på dagen som muligt (slutningen af arbejdsdagen) og dæk med stanniol telt. Lad natten.
Bemærk: Under lysene fra 10: 00 til 12 A.M. (14 h) forsinkelser æglægning, således at lette indsamlingen af yngre æg til mikroinjektion uden at kræve lab personale til at placere samling kammer i bur sent om natten. - Fjerne æg samling kammeret omkring 8 eller 9 kl.
- Bruge pincet til at afhente 1 lag af ostelærred i en tid og sted i et bægerglas (500 mL) vand. Vask æg ud af ostelærred af forsigtigt omrøring (figur 1B og 1 C).
- Bruge pære pipette til at overføre æggene til et andet bægerglas (500 mL) vand. Gentag 2-3 x for at rengøre æggene.
- Bruge pære pipette til at overføre æg på filtrerpapir (fig. 1 d) samtidig minimere mængden af vand fremførsel.
- Skær sort filterpapir i strimler så bred som et glas dias og tape fast i diaset for at sikre lægger papiret flad (figur 2A).
Bemærk: Sort filtrerpapir hjælper med at forbedre synlighed under mikroskop ved at reducere mængden af reflekteret lys. - Anvend ikke giftig lim (Se Tabel af materialer for eksempel) til filterpapir i fine linier (figur 2B). Holde linjerne lim tyndere end diameteren af et æg til at undgå at få æggene belagt i limen.
- Brug en fin børste forsigtigt flytte VIF æg én efter én fra deres filtrerpapir til lim linje. Prøv at lægge æg på limen, før det tørrer og holde mindst ét æg afstand mellem hvert æg.
- Maksimere injektion effektivitet ved at placere flere linjer af æg på et filtrerpapir dias (figur 3).
- Når alle æg er lagt ud på filtrerpapir, vent, indtil alle limen tørrer før mikroinjektion.
Bemærk: For kønscelleoverførsel transformation og CRISPR/Cas9-medieret genom-redigering, injicere alle embryoner ved middagstid (kl. 12) så at den ældste embryo er ikke mere end 19 h gamle. Men for RNAi, der er ingen tidsbegrænsning fordi i VIF, dsRNA kan flytte mellem celler. I virkeligheden, for RNAi, kan aldrende embryoner resultere i bedre overlevelse.
3. forberedelse af Plasmid DNAs og injektion nåle
- Forberede høj kvalitet supercoiled plasmid DNA ved hjælp af en endotoxin-fri kommerciel kit (Se Tabel af materialer for et eksempel).
- For at forberede løsningen ved injektion, kontrollere koncentrationen af hver plasmid og derefter kombinere helper plasmid (250 ng/µL endelige koncentration), donor plasmid (750 ng/µL slutkoncentration) og phenol rød buffer (20% endelige koncentration). Vortex løsning kort og centrifugeres i 3 min. ved maksimal hastighed at udfælde partikler, der kan tilstoppe nålen.
- Trække borsilikatglas nåle (OD 1 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm længde) ved hjælp af en flammende/brun type mikropipette puller. Til opbevaring, sikre trak nåle på dobbelt-sidet klistret tape i en petriskål eller andre klart beholder.
Bemærk: For mikropipette aftrækker systemet, indstillingerne anvendes var: varme = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Opfyldning injektion nålen ved hjælp af en mikro-loader tip (Se Tabel af materialer) til afpipetteres 0,5 - 1,0 µL ned inde i nålen, nær den tilspidsede ende. Fjerne bobler fra spidsen af nålen, hvis nogen opstår.
- Indsæt injektion nålen i nål holderen.
- Åbn spidsen af nålen ved forsigtigt at bryde med et fint par pincet, eller blidt røre/trække tip på diasset coverslip eller glas.
Bemærk: Målet er at have den mindste åbning, der stadig tillader injektion blanding til at komme ud (mindre åbninger generelt kræver højere indsprøjtning pres). Skrå nåle kræver ikke dette trin, da de er allerede åben.
4. mikroinjektion og efter indsprøjtning pleje
- Brug en fin pensel, omhyggeligt fugte overfladen af 1-3 æg med sterilt vand, indsætte nålen og injicere løsningen. Injicere hvert æg før overfladen tørrer. Se efter udseende en lille mængde af rød farve inde i æg under injektion til at angive den succesfulde mikroinjektion. Knuse eller fjerne nogen æg, der ser beskadiget, tom, eller ellers ikke kan blive injiceret.
Bemærk: Selvom indsprøjtning pres varierer baseret på nålen bar størrelse, 10-13 psi er et godt udgangspunkt. - Når alle æg er indsprøjtet, fjerne filtrerpapir fra glas dias.
- Placer filtrerpapir på overfladen af en 1% agar parabol (beskrevet ovenfor).
- Bruge plast paraffin film at forsegle fadet, og sætte i en 26 ° C insekt opdræt inkubator i 12 dage.
Bemærk: Paraffin filmen vil hjælpe med at forhindre krydskontaminering af mug mellem retter. Men enhver anden behandling for at forhindre mug og bakteriel vækst kunne reducere overlevelsen af de injicerede embryoner.
5. dyrkning og udrugning af embryoner
- Begynder at kontrollere embryoner 12 dage efter injektion for nyligt udklækket larver og fortsætter dagligt i de næste 2 uger.
- Overføre larver, med en fin børste, en stejlende boks med spirede majs og jord.
Bemærk: Mold kan vokse i agar parabol, men larverne vil stadig udklækkes i de fleste tilfælde. Kigge efter larver omhyggeligt i formen til at fange dem alle. Nogle larver kan flytte til låget på fadet og kan sidde fast i kondens. - Bageste larver ved 26 ° C efter standard VIF opdræt metoder25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vigtig overvejelse ved udviklingen af denne protokol var fase af fosterudviklingen ved mikroinjektion. Specifikt, kræver kønscelleoverførsel transformation mikroinjektion af DNAs før embryonale cellularization. Dette er fordi DNAs let kan krydse cellemembraner. At visualisere stadier af VIF embryonale udvikling ved hjælp af en nuklear pletten var kundescenario fordi dechorionation af VIF embryoner hovedsagelig opløser alle beskyttende membraner ansvarlig for integriteten af embryoet. Men denne linje undersøgelsesudvalg blev fortrængt af en anden vanskelighed – erhvervelse af tilstrækkelige mængder af embryoner i tide. I feltet VIF hunner lægge deres æg i jorden, således skal det ingen overraskelse, at i laboratoriet, kvinder kun lægge æg i mørke. Dette gør kort dagtimerne samlinger (2-4 h) vanskeligt. For at afhjælpe dette problem, en enkelt overnatning æg lå blev udført og viste sig for at give store mængder af embryoner. Selv om processen med at indsamle (figur 1) og udstikker (figur 2) embryoner for mikroinjektion er lidt besværlige, hvis det gøres hurtigt denne protokol giver mulighed for mikroinjektion af embryoner, der er mellem 2-19 h gamle på tidspunktet for indsprøjtning, og ingen ældre end 24 h Hvis injektioner udføres senere i dag. Sammenligning af udviklingstider mellem VIF og andre arter tyder på, at VIF embryoner stadig skal være precellular på 24 timer post egg lå (Se diskussion).
De første forsøg på kønscelleoverførsel transformation af VIF involveret Co injektion (figur 3) hjælper (transposase kilde) og donor (transposon) plasmider i precellular embryoner. Transformation markør for donor plasmid var en grøn fluorescerende proteiner (EGFP) genet drevet af en constitutively aktiv promotor fra Tribolium castaneum (alpha-tubulin promotor26). Embryonale overlevelsesrate var lav (tabel 1), men 26 G0 voksne blev inddrevet. For at bestemme om elementet donor indsat i enhver kønsceller, G1 embryoner blev screenet for EGFP udtryk. Selv om fluorescerende afkom var faktisk identificeret (figur 4), screening VIF embryoner med intens lyskilde viste sig for at være dødbringende27. Den næste runde af kønscelleoverførsel transformation udnyttet en ny donor plasmid, man besidder en rød fluorescerende proteiner (DsRed) genet drevet af en constitutively aktiv promotor fra Drosophila melanogaster (heat shock protein 70 promotor28 ). Mens overlevelsesrate var meget bedre (tabel 1), produceres de overlevende voksne kun et enkelt DsRed-positive larver (figur 5). Disse eksperimenter var dog særlig informativ i to henseender. Først, det blev opdaget at mikroinjektion medført forsinkelser i udviklingen, hvilket resulterer i en længere tid til at luge. I stedet for alle embryoner rugeæg inden for 2 uger, injiceres embryoner udklækket mellem 12 og 26 dage post mikroinjektion, hvilket kræver en udvidet overvågning periode for at sikre alle hatchlings blev indsamlet. For det andet blev det bemærket, nyligt udklækket larver var forholdsvis aktiv. De kravlede op på låget hvor de ville få fast, og undertiden undslap fra agar parabol. Disse spørgsmål blev overvundet af forsegling petriskåle med en paraffin film og undersøge låg og agar omhyggeligt for hatchlings.
Den endelige version af denne injektion protokol blev testet af microinjecting VIF embryoner med buffer alene eller med hjælperen og øjet-promotor (3xP329) markeret donor DNA plasmider. Som en ekstra kontrol, et andet sæt af embryoner blev håndteret ens men var ikke microinjected. Fire sæt af embryoner blev sprøjtet med enten injektion løsning. Alt 485 embryoner blev sprøjtet med buffer og af disse, 148 udklækket (hatch sats = 30,5%, tabel 1). 1.450 embryoner injiceres med plasmid DNAs, 289 udklækket (sats = 26,8%). Interessant, de 470 embryoner, som gennemgik samme æg-håndtering betingelser, men uden mikroinjektion, kun 250 udklækket (sats = 53,2%). At overlevelsesraten for uninjected embryoner er 20% højere end overlevelsesrater for injiceres embryoner er forventeligt på grund af den uundgåelige skader ved mikroinjektion. Men lille forskel ses mellem buffer injektion og DNA injektion, hvilket tyder på mængden af DNA bliver tilføjet er acceptabelt for VIF (Se diskussion). Disse resultater viser også, at overlevelsesprocenten forbedret over tidligere indsats. Vellykket etablering af transgene linjerne ved hjælp af denne metode har været rapporteret et andet sted27.
Figur 1: æg samling. A) æg samling kammer. B) zoome i se en del af et æg kammer efter 24-h æg lå. Bemærk, pilene angiver placeringen af et par æg. C) vask æg ud ostelærred. D) den endelige overførsel af VIF æg. Bemærk, beslag angiver region med tætpakkede VIF embryoner (dvs minimal vand). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: forbereder en injektion dias. A) sort filtrerpapir tapede stramt til en standard objektglas. B) zoome i se en del af en indsprøjtning glide under forberedelsesprocessen. Bemærk, pil #1 angiver placeringen af en række af æg, #2 delvis linje af lim og #3 pin bruges til at sprede limen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: indsprøjtning embryoner. En injektion dias med otte rækker af æg. På grund af vinklen på injektion nålen kan successive rækker af embryoner injiceres ved blot at flytte fase. Bemærk den røde farvestof i injektion nålen aids stærkt visualisering af injektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Transgene G1 embryon. Embryoner fra et VIF voksen, der var Co injiceres med piggyBac-baserede helper og donor plasmider som en tidlig embryo. Den lyse grønne embryo er positivt for øget grøn fluorescerende proteiner (EGFP) udtryk, mens de andre ikke er. EGFP udtryk er drevet af Tribolium castaneum alpha-tubulin promotor26. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Transgene G1 larve. 3rd-instar larver hvis overordnede var Co injiceres med piggyBac-baserede helper og donor plasmider som en tidlig embryo. De røde glødende larve til venstre er positiv for DsRed udtryk, mens larve til højre ikke er. DsRed udtryk er drevet af Drosophila melanogaster heat shock 70 promotor28. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Eksperiment | Behandling | Æg | Udklækket | Hatch sats |
| Exp. #1 | ΑtubEGFP-donor | 910 | 57 | 6,3% |
| Exp. #2 | hsp70DsRed-donor | 1580 | 211 | 13.4% |
| Exp. #3 | 3xP3EGFP-donor | 1450 | 389 | 26,8% |
| Buffer | 485 | 148 | 30,5% | |
| No-injektion | 470 | 250 | 53,2% |
Tabel 1: mikroinjektion data. Klækkes priser fra tre mikroinjektion eksperimenter på VIF embryoner, viser det samlede antal æg injiceres, det samlede antal larver, der med held udklækket og hatch sats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom mikroinjektion af VIF med dsRNAs med henblik på RNAi har været rapporteret9, dette er den første protokol til at fastlægge bedste praksis for microinjecting precellular VIF embryoner, en kritisk proces for at gennemføre kønscelleoverførsel transformation og/eller CRISPR/Cas9 genom-redigering i denne art. Vellykket mikroinjektion af VIF embryoner er afhængig af mange faktorer, som er transformation effektivitet. Diskuteret nedenfor er nogle af de store spørgsmål påvirker resultatet af brug af denne protokol for kønscelleoverførsel transformation i denne Bille.
At opnå precellular embryoner
Som nævnt ovenfor, krydser DNA ikke cellemembraner måde dsRNA kan. Det betyder, at det er af afgørende betydning, at DNA, mRNA og/eller proteiner skal injiceres før cellularization opstår. Fordi timingen af injektion er kritisk, var det vigtigt at afgøre et sandsynligt vindue for vellykket mikroinjektion baseret på hvor lang tid det tager nondiapausing VIF stamme30 til at fuldføre embryogenese. Dette blev beregnet baseret på detaljerede undersøgelser af timingen af syncytial blastoderm fase i en anden Bille, Tribolium castaneum. I Triboliumopstår cellularization ~ 8 h post egg lå på 30 ° C31. Da det tager ~3.5 dage for Tribolium til komplet embryogenese ved 30 ° C, sted cellularization finder en tiendedel af måde i processen. Da VIF embryoner tage næsten 2 uger til at udvikle, kan cellularization ikke forekomme indtil den anden dag post egg lå. Derfor blev det antaget at vinduet for vellykket mikroinjektion er mindst 24 timer lang, hvilket er nyttigt, da VIF kræver overnight æglægning til at levere tilstrækkelige mængder af æg til mikroinjektion. Denne metode blev brugt til vellykket transgenese27, men det er tænkeligt, at resultaterne kan forbedres ved at indsprøjte yngre embryoner, forudsat håndtering meget tidlige embryoner ikke forårsage dem skade.
DNA kvalitet og koncentration
Det er ikke overraskende, at DNA koncentration spiller en central rolle i vellykket transformation. Det har længe været tænkt, at holde den endelige koncentration af plasmid DNA under 1 mg/mL var nødvendig for at undgå potentielle toksicitet for de injicerede embryoner32. Selv om det nu er uklart, om toksicitet spørgsmål af tidligere var på grund af DNA, selv eller blev i stedet et resultat af forurenende stoffer fra plasmid rensningsproces, denne tommelfingerregel har været standhaftigt overholdes i to årtier. Men vi har for nylig opdaget at overstiger 1 mg/mL grænse var ikke alene muligt, men også at gøre så kan opnå højere transformation satser, fører til spekulationer om, at fraværet af æg toksicitet kan være på grund af fremskridt i plasmid rensning kits, resulterer i færre forurenende stoffer. I betragtning af den tid, der kræves til bageste VIF, er enhver stigning i transformation satser nyttige, selvom det resulterer i lidt højere dødelighed.
Blødgørende æg overflade før mikroinjektion
I modsætning til Tribolium, skal den ydre-de fleste overflade (chorion) af et VIF embryo blødgjort før mikroinjektion. Dette er et afgørende skridt, selvom du bruger kvarts nåle. Ideelt vand bør anvendes til en enkelt embryon umiddelbart før injektion, men kan anvendes til grupper af 2 til 3 embryoner på et tidspunkt, hvis mikroinjektion kan ske, før chorions reharden. Uden dette trin, vil nåle generelt ikke at trænge ind i chorion, hvorved injektion forsøg mislykkes, og potentielt skadelige spidsen af nålen. Desuden, hvis nålen med succes trænge en tør chorion, injektion løsning typisk lækager tilbage ud på grund af trykket i fosteret bliver højere end barometerstanden. Det er imidlertid let at skelne tør fra våde (blødgjort) embryoner. Specielt, når tør, embryoner har en særskilt stive, runde form, mens tilsætning af vand forårsager dem til at miste deres sfæriske udseende. Blødgøring ikke kun tillader nål til let trænge ind i chorion men også reducerer trykket inde embryo nok at injektion løsning ikke sive ud.
Fugt og skimmel
Injiceres embryoner er holdt i varme, fugtige omgivelser i hele embryogenese. Disse betingelser ikke alene give det perfekte miljø for udvikling af VIF men også fremme væksten af mug. I denne to-ugers periode vokser skimmel ofte på agar retter boliger VIF embryoner. Desværre, at embryonerne kræver høj luftfugtighed, og forsøg på at reducere det resulterede i meget lavere hatch. Interessant, havde tilstedeværelsen af skimmelsvamp generelt ringe indflydelse på lugen satser, med de fleste embryoner rugeæg uden problemer. Derudover er svampedræbende behandlinger skadelige for VIF embryoner, så den bedste måde at reducere mug vækst synes at være at undgå forurening; rengøring af værktøj, containere og mikroinjektion systemet før brug, og forsøger at holde den tid microinjecting til et minimum, da skimmelsporer er udbredt i mange laboratorium miljøer.
Konklusioner
Denne protokol er bestemt til at sætte flere forskere til at ansætte transgene teknologier i deres VIF forskning og vil forhåbentlig støtte i udviklingen af supplerende transgenics-baserede teknologier til brug i dette insekt. Sofistikeret transgenics-baserede eksperimenter udført i Tribolium kunne potentielt være tilpasset til VIF, herunder mutagenese33 og CRISPR-baseret genom-redigering34. Fordi disse teknikker kræver mikroinjektion af precellular embryoner, vil denne protokol være nyttigt ikke kun for transposon-baserede funktionelle genomisk undersøgelser og/eller CRISPR/Cas9-medieret genom-redigering men også for genetik-baseret skadedyrsbekæmpelse strategier 35 , 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Monsanto majs-rodorm viden Research Program, give nummer AG/1005 (til MDL og YC) og start-up midler til MDL fra NCSU. FC blev støttet af tilskud fra Monsantos majs-rodorm viden Research Program (AG/1005) og National Science Foundation, tildele nummer MCB-1244772 (MDL). Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser. FC og MDL udtænkt og designet eksperimenter; FC, PW og SP udførte eksperimenter; FC og MDL analyseret resultaterne; og FC, NG og MDL skrev manuskriptet. Vi takker Teresa O'Leary, William Klobasa og Stephanie Gorski for deres ekspertbistand i screening VIF. Vi takker også Dr. Wade French (USDA-ARS, North Central landbrugs forskningslaboratorium, Brookings, SD) for overførsel af æg at etablere lab kolonier og leverer opdræt protokoller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).
- Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
- Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
- Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
- Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
- Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
- Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
- Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162 (2010).
- Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
- Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
- Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
- Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
- O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
- Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Jeggo, P. A.
- Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
- Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
- Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
- Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
- Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
- Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
- Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
- Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
- Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11 (2007).
- Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).
