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Bioengineering

पश्चिमी मकई Rootworm के Microinjection, Diabrotica virgifera virgifera, Germline परिवर्तन के लिए भ्रूण, या CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन

Published: April 27, 2018 doi: 10.3791/57497
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

Summary

यहां हम इकट्ठा करने और microinjecting सेलुलर पश्चिमी मकई rootworm भ्रूण के लिए इस तरह के germline परिवर्तन और CRISPR/Cas9-जीनोम संपादन के रूप में कार्यात्मक जीनोमिक परख प्रदर्शन के प्रयोजन के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान ।

Abstract

पश्चिमी मकई rootworm (WCR) मकई का एक महत्वपूर्ण कीट है और अच्छी तरह से अपने को तेजी से कीट प्रबंधन रणनीतियों के लिए अनुकूल करने की क्षमता के लिए जाना जाता है । हालांकि आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) WCR जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हुआ है, यह अपनी सीमाएं हैं । विशेष रूप से, RNAi ही क्षणिक (यानी संबद्ध phenotype के दीर्घकालिक Mendelian विरासत में परिणाम नहीं है), और यह लक्ष्य जीन के डीएनए अनुक्रम जानने की आवश्यकता है । बाद सीमित किया जा सकता है अगर ब्याज की phenotype खराब संरक्षित, या यहां तक कि उपंयास जीन द्वारा नियंत्रित है, क्योंकि उपयोगी लक्ष्यों की पहचान चुनौतीपूर्ण होगा, अगर असंभव नहीं है । इसलिए, WCR के जीनोमिक toolbox में उपकरणों की संख्या है कि स्थिर उत्परिवर्ती उपभेदों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और WCR जीनोम के अनुक्रम स्वतंत्र सर्वेक्षण सक्षम तरीकों के विकास के द्वारा विस्तारित किया जाना चाहिए । इस के साथ साथ, हम विस्तार तरीकों को इकट्ठा करने और न्यूक्लिक एसिड के साथ WCR भ्रूण microinject के लिए इस्तेमाल किया । जबकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक WCR, CRISPR के निर्माण के उद्देश्य से कर रहे है/Cas9-जीनोम संपादन भी एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है, केवल अंतर के साथ समाधान की संरचना भ्रूण में इंजेक्ट किया जा रहा है ।

Introduction

वेस्टर्न कॉर्न rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, कॉर्न1का एक महत्वपूर्ण कीट है । दिलचस्प है, WCR नियंत्रण उपायों पर काबू पाने के लिए और अधिक तेजी से सबसे कृषि कीट से प्रतीत होता है क्योंकि वे न केवल शारीरिक रूप से अनुकूल है, लेकिन यह भी व्यवहार2,3,4,5, 6. पिछले एक दशक से अधिक, आरएनए हस्तक्षेप (RNAi), एक शक्तिशाली कार्यात्मक जीनोमिक उपकरण, WCR7,8के लिए एक संभावित नियंत्रण विधि के रूप में जांच की गई है, और यह भी जीन समारोह9अध्ययन करने के लिए एक साधन के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, जबकि RNAi अक्सर अन्य प्रजातियों में डबल-कतरा आरएनए (dsRNA) के microinjection द्वारा किया जाता है, इंजेक्शन आधारित RNAi WCR में दुर्लभ है । वास्तव में, WCR9में dsRNA के microinjection के माध्यम से RNAi की केवल कुछ रिपोर्टों रहे हैं । कारण यह है कि WCR उच्च प्राप्त कर सकते है dsRNA7,10की घूस के माध्यम से जीन पछाड़ना के स्तर, यहां तक कि मां11को खिला dsRNA द्वारा भ्रूण प्रभाव के अध्ययन की अनुमति । हालांकि इस विधि RNAi के माध्यम से कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट विषय WCR बनाता है, यह इस प्रजाति में भ्रूण microinjection के लिए के तरीके के विकास पर प्रगति धीमा है.

बिजली न होने के बावजूद RNAi में कुछ कमियां हैं । उदाहरण के लिए, नहीं सभी जीन समान रूप से RNAi को जवाब । इस परिवर्तनशीलता एक कार्यात्मक जीनोमिक्स परख के परिणाम और अधिक मुश्किल व्याख्या कर सकते हैं । इसके अलावा, RNAi क्षणिक है और heritable उत्परिवर्तनों उत्पंन नहीं करता है । दूसरी ओर, germline परिवर्तन, एक कार्यात्मक जीनोमिक उपकरण, जीनोम12,13में एक चिह्नित transposable तत्व की प्रविष्टि के माध्यम से heritable उत्परिवर्तनों उत्पंन कर सकते हैं । यह germline परिवर्तन बनाता है दीर्घकालिक आनुवंशिक अध्ययन में उपयोग के लिए उत्परिवर्ती उपभेदों बनाने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण । परिवर्तन भी एक उत्परिवर्ती जीनोम14के लिए जीन की एक कार्यात्मक प्रतिलिपि देने के द्वारा एक उत्परिवर्तन बचाव किया जा सकता है । इसके अलावा, germline परिवर्तन आणविक आनुवंशिक तकनीक की एक विस्तृत विविधता की आधारशिला है । बाहर दस्तक और/या जीन समारोह बचाव के अलावा, germline परिवर्तन बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है15फँसाने, जीन फँसाने16, Gal4-आधारित अस्थानिक अभिव्यक्ति17, और जीनोम चौड़ा mutagenesis18.

हाल ही में, उपकरण है कि परिष्कृत जीनोम संपादन सक्षम विकसित किया गया है । इन उपकरणों प्रतिलेखन उत्प्रेरक-जैसे प्रभाव Nucleases (तलेन) और CRISPR/Cas9-nuclease प्रणाली19,20शामिल हैं । इन नए उपकरणों का लाभ यह है कि वे शोधकर्ताओं को लगभग किसी भी जीनोम के भीतर लगभग किसी भी स्थान पर एक डबल-असहाय डीएनए तोड़ने के लिए प्रेरित करने की क्षमता प्रदान करते हैं । एक बार प्रेरित, इन टूटता है या तो गैर के माध्यम से मरंमत की जा सकती है मुताबिक़ अंत में शामिल होने, जो हटाने या लक्षित जीन, या समरूपता के माध्यम से मरंमत का निर्देश दिया है, जो एक इंजीनियर के निर्माण की उपस्थिति में निवेशन परिचय, उत्प्रेरित कर सकते है पूरे जीन या आनुवंशिक क्षेत्रों के प्रतिस्थापन21,22। हालांकि, इन तरीकों बहुत युवा भ्रूण में डीएनए, आरएनए और/या प्रोटीन के microinjection की आवश्यकता होती है ।

महत्वपूर्ण बात, RNAi के लिए इस्तेमाल dsRNAs के विपरीत, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन germline परिवर्तन और जीनोम संपादन के लिए इस्तेमाल किया आसानी से कोशिका झिल्ली पार नहीं कर सकते । इसलिए, प्लाज्मिड DNAs के microinjection, mRNAs, और/या प्रोटीन syncytial blastoderm चरण (यानी कीट भ्रूण cellularizes से पहले) के दौरान जगह लेना चाहिए । यह इंजेक्शन के समय एक महत्वपूर्ण कारक बनाता है । उदाहरण के लिए, Drosophila melanogasterमें, भ्रूण के दो घंटे के भीतर इंजेक्शन की आवश्यकता के बाद अंडा12रखना । इसलिए, WCR के लिए एक सफल भ्रूण microinjection प्रोटोकॉल के विकास के खाते में महिला अंडा बिछाने के लिए सबसे अच्छी शर्तों के रूप में अच्छी तरह से सेलुलर भ्रूण के पर्याप्त मात्रा में इकट्ठा करने के लिए सबसे अच्छा तरीका रखना चाहिए ।

एक के लिए आणविक आनुवंशिक उपकरण की एक विस्तृत श्रृंखला लाने के प्रयास WCR जीव विज्ञान पर भालू को इकट्ठा करने और microinjecting सेलुलर WCR भ्रूण के लिए तरीकों के विकास की आवश्यकता है । यहाँ हम विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं, सुझावों और चालों के साथ, दूसरों की मदद करने के लिए WCR अनुसंधान में रूपांतरण आधारित तकनीक का उपयोग करें. कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन में उपयोग के लिए WCR करने के लिए ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियों का विस्तार करने के अलावा, इन तकनीकों को भी शक्तिशाली नई कीट नियंत्रण रणनीतियां सक्षम जीन ड्राइव23,24 के लिए इस आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण में परीक्षण किया जाएगा कीट.

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Protocol

1. WCR वयस्कों के कॉलनी-स्तर का पालन

  1. एक विश्वसनीय कंपनी या अनुसंधान प्रयोगशाला से WCR वयस्कों (५००-१,०००) की एक पर्याप्त मात्रा प्राप्त (एक उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) और एक 30 सेमी3 पिंजरे में जगह है ।
    नोट: एक गैर diapausing तनाव का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है ।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद WCR कृत्रिम आहार तैयार करने और एक ३८ ऑउंस कंटेनर में एक 1 सेमी मोटी परत डालो ( सामग्री की तालिकादेखें) । मिश्रण के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने के लिए अप्रयुक्त आहार की दुकान ।
  3. एक 30 सेमी3 पिंजरे में एक पेट्री डिश (१०० x 15 मिमी) वयस्क आहार (10-15 ग्राम) के साथ रखो । भोजन कम या सूखा होने पर अधिक आहार जोड़ें ।
  4. पानी के साथ एक कुप्पी (३०० मिलीलीटर) रखो, एक कपास की गेंद है, जो जगह में एक कपास रोल (6 "x 3/8"), एक जल स्रोत के रूप में सेवा करने के लिए आयोजित किया जाता है के साथ कवर । पानी कम होने पर इसे बदलें ।
  5. ६०% आर्द्रता और एक कीट पालन मशीन में एक 14:10 प्रकाश चक्र के साथ 26 डिग्री सेल्सियस पर WCR बनाए रखें ।

2. भ्रूण संग्रह और संरेखण

  1. एक अंडा संग्रह एक बाँझ १०० x 15 मिमी2 पेट्री डिश में पानी में 1% आगर का उपयोग कर चैंबर बनाओ । आगर जम के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  2. नई रखी अंडे इकट्ठा करने के लिए, जाली के 4 परतों (आकार करने के लिए प्रत्येक की सतह पर) (चित्र 1a) के बाद फ़िल्टर कागज की एक परत जगह है,
    नोट: जाली ब्लीच और autoclaved में धोया जा रहा है, के बाद reused किया जा सकता है, लेकिन यह पहले उपयोग के लिए यह करने के लिए आवश्यक नहीं है । फ़िल्टर काग़ज़ का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए और उसे निष्फल होने की आवश्यकता नहीं है ।
  3. WCR पिंजरे में प्लेस अंडा संग्रह प्लेट संभव के रूप में दिन में देर के रूप में (कार्य दिवस के अंत) और एक टिनफॉईल तंबू के साथ कवर । रातोरात छोड़ दें ।
    नोट: सुबह 10 से 12 बजे तक पर रोशनी होने (14 ज) देरी अंडा बिछाने, इस प्रकार microinjection के लिए युवा अंडे के संग्रह की आवश्यकता के बिना प्रयोगशाला कर्मियों को पिंजरे में संग्रह कक्ष जगह देर रात तक की सुविधा ।
  4. अंडा संग्रह कक्ष के आसपास 8 या 9 A.M. निकालें
  5. एक बार और पानी की एक चोंच (५०० मिलीलीटर) में जगह पर जाली की 1 परत लेने के लिए संदंश का प्रयोग करें । धीरे चमचे से जाली के बंद अंडे धो (चित्र 1b और 1C) ।
  6. एक बल्ब पिपेट पानी का एक और चोंच (५०० मिलीलीटर) के लिए अंडे हस्तांतरण का प्रयोग करें । दोहराएं 2-3x अंडे साफ करने के लिए ।
  7. फिल्टर कागज पर अंडे हस्तांतरण करने के लिए बल्ब पिपेट का प्रयोग करें (चित्र 1 d) जबकि पानी की मात्रा को कम से अधिक ले ।
  8. एक ग्लास स्लाइड के रूप में व्यापक रूप में स्ट्रिप्स में काले फिल्टर कागज कट और सुनिश्चित करने के लिए स्लाइड करने के लिए दृढ़ता से टेप कागज फ्लैट (चित्रा 2a) देता है.
    नोट: काले फिल्टर कागज परावर्तित प्रकाश की मात्रा को कम करके माइक्रोस्कोप के तहत दृश्यता में सुधार करने में मदद करता है ।
  9. लागू गैर विषैले गोंद (एक उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) ठीक लाइनों (चित्रा बी) में फिल्टर पेपर के लिए । गोंद लाइनों एक अंडे के व्यास से पतले रखने के लिए अंडे गोंद में लेपित हो रही से बचें ।
  10. एक ठीक ब्रश का प्रयोग करें धीरे WCR अंडे एक एक करके अपने फ़िल्टर कागज से गोंद लाइन के लिए कदम । गोंद पर अंडे देना इससे पहले कि यह सूख जाता है और प्रत्येक अंडे के बीच कम से कम एक अंडे की दूरी रखने की कोशिश करो ।
  11. एक फिल्टर पेपर स्लाइड (चित्रा 3) पर अंडे की कई लाइनें रखकर इंजेक्शन दक्षता अधिकतम करें ।
  12. सभी अंडे फिल्टर कागज पर बाहर रखी हैं के बाद, microinjection से पहले सभी गोंद सूख जाता है जब तक इंतजार.
    नोट: germline परिवर्तन के लिए और CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन के लिए, दोपहर तक सभी भ्रूण सुई (12 P.M.) ताकि सबसे पुराना भ्रूण कोई 19 से अधिक एच पुराने है । हालांकि, RNAi के लिए, कोई समय सीमा नहीं है क्योंकि, WCR में, dsRNA कक्षों के बीच ले जा सकते हैं । वास्तव में, RNAi के लिए, उंर बढ़ने भ्रूण बेहतर जीवन रक्षा दरों में परिणाम हो सकता है ।

3. प्लाज्मिड DNAs और इंजेक्शन सुई की तैयारी

  1. एक endotoxin मुक्त वाणिज्यिक किट का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता वाले supercoiled प्लाज्मिड डीएनए तैयार (एक उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें).
  2. इंजेक्शन समाधान तैयार करने के लिए, प्रत्येक प्लाज्मिड की एकाग्रता की जाँच करें और फिर सहायक प्लाज्मिड गठबंधन (२५० एनजी/µ l अंतिम एकाग्रता), दाता प्लाज्मिड (७५० एनजी/µ l अंतिम एकाग्रता) और phenol लाल बफर (20% अंतिम एकाग्रता). भंवर संक्षेप समाधान और अधिकतम गति से 3 मिनट के लिए करने के लिए कणों कि सुई रोकना सकता हाला ।
  3. borosilicate ग्लास सुई खींचो (ओडी 1 मिमी, आईडी ०.५८ मिमी, 10 सेमी लंबाई) एक ज्वलंत/ब्राउन प्रकार micropipette खींचने का उपयोग कर । भंडारण के लिए, एक पेट्री पकवान या अंय स्पष्ट कंटेनर में डबल पक्षीय चिपचिपा टेप पर सुरक्षित खींच सुई ।
    नोट: micropipette खींचने प्रणाली के लिए, इस्तेमाल किया सेटिंग्स थे: हीट = ३३५, FIL = 4, VEL = ४०, DEL = २००, PUL = १००.
  4. एक माइक्रो-लोडर टिप का उपयोग करके इंजेक्शन सुई Backfill ( सामग्री की तालिकादेखें) प्लास्टिक ०.५-१.० µ एल नीचे सुई के अंदर, पतला अंत के पास. सुई की नोक से बुलबुले निकालें यदि कोई हो ।
  5. सुई धारक में इंजेक्शन सुई डालें ।
  6. धीरे संदंश की एक अच्छी जोड़ी के साथ तोड़कर सुई की नोक खोलो, या धीरे से छू/coverslip या ग्लास स्लाइड पर टिप खींच ।
    नोट: लक्ष्य है कि अभी भी इंजेक्शन मिश्रण बाहर आने के लिए (छोटे खुलने आम तौर पर उच्च इंजेक्शन दबाव की आवश्यकता है) की अनुमति देता है कि छोटी सी खोलने के लिए है । बेवल्ड सुइयों इस चरण की आवश्यकता नहीं है क्योंकि वे पहले से ही खुले हैं ।

4. Microinjection और पोस्ट-इंजेक्शन की देखभाल

  1. एक ठीक तूलिका का उपयोग करना, ध्यान से बाँझ पानी के साथ 1-3 अंडे की सतह गीला, सुई डालें, और समाधान इंजेक्षन. सतह सूख जाता से पहले प्रत्येक अंडे सुई । उपस्थिति के लिए देखो इंजेक्शन के दौरान अंडे के अंदर लाल रंग की एक छोटी राशि के लिए सफल microinjection संकेत मिलता है । क्रश या क्षतिग्रस्त, खाली, या अंयथा इंजेक्शन नहीं किया जा सकता है कि देखो किसी भी अंडे निकालें ।
    नोट: हालांकि इंजेक्शन दबाव सुई बोर आकार के आधार पर बदलता है, 10-13 साई एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है ।
  2. सभी अंडों को इंजेक्ट करने के बाद, कांच की स्लाइड से फिल्टर पेपर निकालें ।
  3. एक 1% आगर डिश की सतह पर फिल्टर कागज प्लेस (ऊपर वर्णित) ।
  4. डिश सील करने के लिए प्लास्टिक आयल फिल्म का प्रयोग करें, और 12 दिनों के लिए एक 26 डिग्री सेल्सियस कीट पालन मशीन में डाल दिया ।
    नोट: आयल फिल्म में मदद मिलेगी पार-बर्तन के बीच मोल्ड के संदूषण को रोकने के । हालांकि, किसी अंय उपचार मोल्ड और बैक्टीरियल विकास को रोकने के लिए इंजेक्शन भ्रूण के अस्तित्व को कम कर सकता है ।

5. संवर्धन और भ्रूण की सेने

  1. भ्रूण की जांच शुरू 12 दिनों के बाद नए रची लार्वा के लिए इंजेक्शन और अगले 2 सप्ताह के लिए दैनिक जारी है ।
  2. स्थानांतरित लार्वा, एक ठीक ब्रश का उपयोग कर, अंकुरित मकई और मिट्टी के साथ एक पालन बॉक्स करने के लिए ।
    नोट: मोल्ड आगर डिश में विकसित हो सकता है, लेकिन लार्वा अभी भी ज्यादातर मामलों में हैच होगा । उन सब को पकड़ने के लिए मोल्ड के भीतर ध्यान से लार्वा के लिए देखो । कुछ लार्वा डिश के ढक्कन तक ले जा सकते हैं और हो सकता है कि वे संघनित्र में फंस जाएं ।
  3. 26 डिग्री सेल्सियस पर रियर लार्वा निंनलिखित मानक WCR पालन विधियां25।

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Representative Results

एक महत्वपूर्ण विचार जब इस प्रोटोकॉल विकासशील microinjection के समय में भ्रूण के विकास का मंच था । विशेष रूप से, germline परिवर्तन भ्रूण cellularization करने से पहले DNAs के microinjection की आवश्यकता है । इसका कारण यह है DNAs आसानी से कोशिका झिल्ली पार नहीं कर सकता । प्रयास WCR भ्रूण के विकास के चरणों कल्पना करने के लिए एक परमाणु दाग का उपयोग असफल रहे थे क्योंकि WCR भ्रूण के dechorionation अनिवार्य रूप से भ्रूण की अखंडता के लिए जिंमेदार सुरक्षात्मक झिल्ली के सभी भंग । हालांकि, जांच की इस लाइन एक और कठिनाई से supplanted था-एक समय पर ढंग से भ्रूण की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने । क्षेत्र में, WCR महिलाओं मिट्टी में अपने अंडे देना, इस प्रकार यह कोई आश्चर्य की बात है कि प्रयोगशाला में होना चाहिए, मादा ही अंधेरे में अंडे देना । यह छोटा दिन संग्रह (2-4 ज) मुश्किल बनाता है । इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए, एक ही रात में एक अंडा करना था और भ्रूण की बड़ी मात्रा में उपज पाया गया था । हालांकि इकट्ठा करने की प्रक्रिया (चित्रा 1) और बाहर बिछाने (चित्रा 2) microinjection के लिए भ्रूण कुछ श्रमसाध्य है, अगर जल्दी से किया इस प्रोटोकॉल है कि इंजेक्शन के समय 2-19 ज पुराने के बीच है भ्रूण के microinjection सक्षम बनाता है, और कोई 24 से पुराने ज अगर इंजेक्शन बाद में दिन में प्रदर्शन कर रहे हैं । WCR और अंय प्रजातियों के बीच विकास के समय की तुलना पता चलता है कि WCR भ्रूण अभी भी 24 एच पोस्ट अंडा रखना में सेलुलर होना चाहिए (चर्चा देखें) ।

WCR के germline परिवर्तन में पहला प्रयास शामिल सह इंजेक्शन (चित्रा 3) हेल्पर (transposase स्रोत) और दाता (transposon) सेलुलर भ्रूण में plasmids । दाता प्लाज्मिड के लिए परिवर्तन मार्कर एक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) जीन Tribolium castaneum (अल्फा-tubulin प्रमोटर26) से एक constitutively सक्रिय प्रमोटर द्वारा संचालित था । भ्रूण जीवित रहने की दर कम (1 टेबल) थे, लेकिन 26 जी0 वयस्कों बरामद किए गए । निर्धारित करने के लिए यदि दाता तत्व किसी भी रोगाणु कोशिकाओं में डाला, जी1 भ्रूण EGFP अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई । हालांकि फ्लोरोसेंट संतति वास्तव में पहचाने गए थे (चित्रा 4), तीव्र प्रकाश स्रोत के साथ WCR भ्रूण स्क्रीनिंग27घातक साबित हुआ । germline परिवर्तन के अगले दौर के एक नए दाता प्लाज्मिड, एक एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन रखने (DsRed) जीन एक constitutively सक्रिय प्रमोटर से Drosophila melanogaster (हीट शॉक प्रोटीन ७० प्रमोटर28 से प्रेरित का उपयोग किया ). जबकि अस्तित्व की दर बहुत सुधार (तालिका 1) थे, जीवित वयस्कों केवल एक एकल DsRed सकारात्मक लार्वा (चित्रा 5) का उत्पादन किया । हालांकि, इन प्रयोगों विशेष रूप से दो संबंध में जानकारीपूर्ण थे । पहले, यह पता चला कि microinjection विकास में देरी का कारण बना, एक विस्तारित समय में जिसके परिणामस्वरूप-हैच । बल्कि सभी 2 सप्ताह के भीतर सेने भ्रूण से, 12 और 26 दिनों के बाद microinjection के बीच रची भ्रूण इंजेक्शन, इस प्रकार एक विस्तारित निगरानी अवधि के लिए सभी hatchlings सुनिश्चित करने की आवश्यकता एकत्र किए गए थे । दूसरा, यह गौर किया गया कि नए सिरे से रची गई लार्वा काफी सक्रिय थीं. वे ढक्कन पर रेंगा जहां वे अटक जाते हैं, और कभी कभार डिश से बच गया । इन मुद्दों को एक आयल फिल्म के साथ पेट्री व्यंजन सील और पलकों की जांच और hatchlings के लिए ध्यान से आगर से दूर थे ।

इस इंजेक्शन प्रोटोकॉल के अंतिम संस्करण अकेले बफर के साथ microinjecting WCR भ्रूण द्वारा परीक्षण किया गया था, या सहायक और नेत्र-मोटर (3xP329) के साथ दाता डीएनए plasmids के रूप में चिह्नित । एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, भ्रूण का एक और सेट हूबहू संभाला गया था, लेकिन microinjected नहीं थे । भ्रूण के चार सेट या तो इंजेक्शन समाधान के साथ इंजेक्शन थे । ४८५ भ्रूण की कुल बफर और उन के साथ इंजेक्शन थे, १४८ रची (हैच दर = ३०.५%, तालिका 1) । १,४५० प्लाज्मिड DNAs, २८९ रची के साथ इंजेक्शन भ्रूण की (दर = २६.८%) । दिलचस्प है, ४७० भ्रूण है कि एक ही अंडे की स्थिति से निपटने के लिए गया था, लेकिन microinjection के बिना, केवल २५० रचा (दर = ५३.२%) । कि इंजेक्शन भ्रूण के जीवित रहने की दर 20% भ्रूण के लिए जीवित रहने की दर से अधिक है microinjection की वजह से अपरिहार्य नुकसान की वजह से उंमीद की जा रही है । हालांकि, थोड़ा अंतर बफर इंजेक्शन और डीएनए इंजेक्शन के बीच देखा जाता है, जो डीएनए की राशि का पता चलता है जोड़ा जा रहा है WCR के लिए स्वीकार्य है (चर्चा देखें) । इन परिणामों से यह भी पता चलता है कि जीवित रहने की दरें पहले के प्रयासों में सुधार । इस विधि का उपयोग कर ट्रांसजेनिक लाइनों की सफल स्थापना के27कहीं और बताया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: अंडा संग्रह । क) अंडा संग्रह कक्ष । ख) ज़ूम-24 के बाद एक अंडा चैंबर के एक वर्ग के देखने में एच अंडा रखना । नोट, तीर कुछ अंडे के स्थान का संकेत है । ग) जाली बंद अंडे धोने । घ) WCR अंडे का अंतिम अंतरण । नोट, ब्रैकेट घनी पैक WCR भ्रूण (यानी न्यूनतम पानी) के साथ क्षेत्र को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: एक इंजेक्शन स्लाइड तैयार करना. क) काले फिल्टर कागज एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड को कसकर टेप । ख) तैयारी प्रक्रिया के दौरान इंजेक्शन स्लाइड के एक अनुभाग के दृश्य को ज़ूम-इन करें । नोट, तीर #1 अंडे की एक पंक्ति का स्थान इंगित करता है, गोंद की आंशिक लाइन #2 और पिन गोंद फैलाने के लिए इस्तेमाल किया #3. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: इंजेक्शन भ्रूण । अंडे की आठ पंक्तियों के साथ एक इंजेक्शन स्लाइड । इंजेक्शन सुई के कोण के कारण, भ्रूण की लगातार पंक्तियों को केवल मंच पर ले जाकर इंजेक्ट किया जा सकता है । इंजेक्शन सुई में लाल रंग बहुत इंजेक्शन का दृश्य एड्स ध्यान दें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: ट्रांसजेनिक G1 भ्रूण । एक WCR वयस्क है कि सह था से भ्रूण piggyBac-आधारित सहायक और एक प्रारंभिक भ्रूण के रूप में दाता plasmids के साथ इंजेक्शन । उज्ज्वल ग्रीन भ्रूण बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक है, जबकि दूसरों को नहीं कर रहे हैं । EGFP अभिव्यक्ति Tribolium castaneum अल्फा-tubulin प्रमोटर26से प्रेरित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: ट्रांसजेनिक G1 लार्वा । 3-instar लार्वा जिनके माता-पिता एक प्रारंभिक भ्रूण के रूप में piggyBac-आधारित सहायक और दाता plasmids के साथ सह-इंजेक्शन थे । बाईं तरफ लाल चमक लार्वा DsRed अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक है, जबकि सही पर लार्वा नहीं है । DsRed अभिव्यक्ति Drosophila melanogaster हीट शॉक ७० प्रमोटर28से प्रेरित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रयोग उपचार अंडे रची हैच दर
Exp. #1 αtubEGFP-दाता ९१० ५७ ६.३%
Exp. #2 hsp70DsRed-दाता १५८० २११ १३.४%
Exp. #3 3xP3EGFP-दाता १४५० ३८९ २६.८%
बफ़र ४८५ १४८ ३०.५%
नो-इंजेक्शन ४७० २५० ५३.२%

तालिका 1: Microinjection डेटा. WCR भ्रूण पर तीन microinjection प्रयोगों से हैच दर, इंजेक्शन अंडे की कुल संख्या दिखा रहा है, लार्वा की कुल संख्या है कि सफलतापूर्वक रचा, और हैच दर ।

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Discussion

हालांकि RNAi के प्रयोजन के लिए dsRNAs के साथ WCR के microinjection9सूचित किया गया है, यह पहला प्रोटोकॉल है microinjecting सेलुलर WCR भ्रूण, germline परिवर्तन के संचालन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं की स्थापना और/ CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन इस प्रजाति में । WCR भ्रूण के सफल microinjection कई कारकों पर निर्भर है, के रूप में परिवर्तन दक्षता है । नीचे चर्चा की प्रमुख इस बीटल में germline परिवर्तन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के परिणाम को प्रभावित करने के मुद्दों में से कुछ हैं ।

सेलुलर भ्रूण प्राप्त करना
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, डीएनए कोशिका झिल्ली dsRNA कर सकते है जिस तरह से पार नहीं करता है । इसका मतलब यह है कि यह महत्वपूर्ण महत्व का है कि डीएनए, mRNA, और/या प्रोटीन cellularization होने से पहले इंजेक्ट किया जाना है । क्योंकि इंजेक्शन के समय महत्वपूर्ण है, यह सफल microinjection के लिए एक संभावना खिड़की निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण था के आधार पर कितनी देर तक यह nondiapausing WCR तनाव30 लेता है के लिए पूरा embryogenesis । यह गणना syncytial blastoderm चरण के समय के विस्तृत अध्ययन के आधार पर एक अन्य बीटल, Tribolium castaneumमें की गई थी । Triboliumमें, cellularization होता है ~ 8 एच पोस्ट अंडा 30 डिग्री सेल्सियस पर रखना31। चूंकि यह 30 डिग्री सेल्सियस पर embryogenesis पूरा करने के लिए Tribolium के लिए ~ ३.५ दिन लेता है, cellularization इस प्रक्रिया में रास्ते का दसवां स्थान लेता है । चूंकि WCR भ्रूण लगभग 2 सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए, cellularization दूसरे दिन पोस्ट अंडा रखना तक नहीं हो सकता है । इसलिए, यह मान लिया गया था कि सफल microinjection के लिए विंडो कम 24 ज लंबी है, जो उपयोगी है, के बाद से WCR रात भर अंडा बिछाने के लिए microinjection के लिए अंडे की पर्याप्त मात्रा प्रदान करने की आवश्यकता है । हालांकि इस विधि सफल transgenesis के लिए इस्तेमाल किया गया था27, यह कल्पना है कि परिणाम छोटे भ्रूण इंजेक्शन द्वारा सुधारा जा सकता है, प्रदान की बहुत जल्दी भ्रूण हैंडलिंग उंहें नुकसान नहीं होता है ।

डीएनए गुणवत्ता और एकाग्रता
यह आश्चर्य की बात नहीं है कि डीएनए एकाग्रता सफल परिवर्तन में एक निर्णायक भूमिका निभाता है । यह लंबे समय से सोचा गया है कि 1 मिलीग्राम/एमएल नीचे प्लाज्मिड डीएनए के अंतिम एकाग्रता रखते हुए इंजेक्शन भ्रूण३२करने के लिए संभावित विषाक्तता से बचने के लिए आवश्यक था । हालांकि यह अब स्पष्ट नहीं है अगर अतीत के विषाक्तता के मुद्दों डीएनए के कारण ही थे या बजाय प्लाज्मिड शोधन प्रक्रिया से अधिक किए गए संदूषणों का परिणाम थे, अंगूठे के इस नियम को लगातार दो दशकों के लिए पालन किया गया है । लेकिन, हम हाल ही में पता चला कि से अधिक 1 मिलीग्राम/एमएल सीमा ही संभव नहीं था, लेकिन यह भी है कि ऐसा करने से उच्च परिवर्तन दर प्राप्त कर सकते हैं, अटकलें है कि अंडा विषाक्तता के अभाव प्लाज्मिड शोधन किट में प्रगति की वजह से हो सकता है के लिए अग्रणी, कम दूषित होने के परिणामस्वरूप । रियर WCR के लिए आवश्यक समय को देखते हुए, परिवर्तन दरों में किसी भी वृद्धि सहायक है, भले ही यह थोड़ा उच्च मृत्यु दर में परिणाम है ।

नरम अंडा सतह microinjection से पहले
Triboliumके विपरीत, बाहरी सबसे सतह (एक WCR भ्रूण की चोरियों) microinjection से पहले नरम किया जाना चाहिए । यह भी जब क्वार्ट्ज सुइयों का उपयोग कर एक महत्वपूर्ण कदम है । आदर्श रूप में, पानी इंजेक्शन से पहले तुरंत एक भ्रूण के लिए लागू किया जाना चाहिए, लेकिन एक समय में 2 से 3 भ्रूण के समूहों के लिए लागू किया जा सकता है अगर microinjection चोरियों को सख्त करने से पहले पूरा किया जा सकता है । इस कदम के बिना, सुई आम तौर पर चोरियों घुसना करने के लिए असफल हो जाएगा, जिससे इंजेक्शन के प्रयास को विफल करने के लिए, और संभावित सुई की नोक हानिकारक । इसके अलावा, अगर सुई को सफलतापूर्वक एक सूखी चोरियों घुसना होता है, इंजेक्शन समाधान आम तौर पर वापस बाहर भ्रूण के अंदर दबाव के कारण बाहर लीक परिवेश दबाव से अधिक जा रहा है । यह है, तथापि, आसान गीला से शुष्क भेद (नरम) भ्रूण । विशेष रूप से, जब सूखी, भ्रूण एक विशिष्ट कठोर, गोल आकार है, जबकि पानी के अलावा उंहें अपने गोलाकार उपस्थिति खो कारणों । नरम न केवल सुई आसानी से चोरियों घुसना करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी पर्याप्त है कि इंजेक्शन समाधान बाहर रिसाव नहीं करता है भ्रूण के अंदर दबाव को कम करती है ।

आर्द्रता और मोल्ड
इंजेक्शन भ्रूण embryogenesis भर में एक गर्म, नम वातावरण में आयोजित कर रहे हैं । ये स्थितियाँ न केवल WCR विकास के लिए संपूर्ण वातावरण प्रदान करती हैं बल्कि मोल्ड के विकास को भी बढ़ावा देती हैं. इस दो सप्ताह की अवधि के दौरान, मोल्ड अक्सर WCR भ्रूण आवास आगर बर्तन पर बढ़ता है । दुर्भाग्य से, भ्रूण उच्च आर्द्रता की आवश्यकता होती है, और यह बहुत कम हैच दरों में हुई कम करने के लिए प्रयास । दिलचस्प है, मोल्ड की उपस्थिति आम तौर पर हैच दरों पर थोड़ा प्रभाव पड़ा, ज्यादातर समस्याओं के बिना सेने भ्रूण के साथ । इसके अलावा, रोधी उपचार WCR भ्रूण के लिए हानिकारक हैं, इसलिए सबसे अच्छा तरीका है मोल्ड विकास को कम करने के लिए संक्रमण से बचने के लिए प्रतीत होता है; उपकरण, कंटेनर, और microinjection प्रणाली का उपयोग करने से पहले सफाई, और समय रखने के लिए एक ंयूनतम करने के लिए microinjecting खर्च के बाद से मोल्ड बीजाणु कई प्रयोगशाला के वातावरण में प्रचलित हैं ।

निष्कर्ष
इस प्रोटोकॉल को और अधिक शोधकर्ताओं को अपने WCR अनुसंधान में ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियों को रोजगार के लिए सक्षम करने के लिए और उंमीद है कि इस कीट में उपयोग के लिए अतिरिक्त transgenics आधारित प्रौद्योगिकियों के विकास में सहायता करना होगा । परिष्कृत transgenics-आधारित प्रयोगों में Tribolium संभावित WCR के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, सहित mutagenesis३३ और CRISPR आधारित जीनोम संपादन३४. क्योंकि इन तकनीकों सेलुलर भ्रूण के microinjection की आवश्यकता होती है, इस प्रोटोकॉल न केवल transposon के लिए उपयोगी होगा आधारित कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन और/या CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन लेकिन यह भी आनुवंशिकी के लिए आधारित कीट प्रबंधन रणनीतियों ३५ , ३६.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम मोनसेंटो कॉर्न Rootworm नॉलेज रिसर्च प्रोग्राम, ग्रांट नंबर एजी/1005 (MDL और YC) और स्टार्ट-अप फंड से MDL को NCSU से अनुदान द्वारा समर्थित था । एफसी मोनसेंटो के मकई Rootworm ज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम (एजी/1005) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, अनुदान संख्या म्क्ब-१२४४७७२ (MDL) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं घोषित करते हैं । एफसी और MDL कल्पना और प्रयोगों का डिजाइन; एफसी, पीडब्लू और एसपी ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया; एफसी और MDL परिणामों का विश्लेषण किया; और एफसी, एनजी और MDL पांडुलिपि लिखा था । हम स्क्रीनिंग WCR में उनके विशेषज्ञ सहायता के लिए टेरेसा O'Leary, विलियम Klobasa, और स्टेफ़नी Gorski धंयवाद । हम भी Dr. वेड फ्रेंच (USDA-ARS, उत्तर केंद्रीय कृषि अनुसंधान प्रयोगशाला, ब्रूकिंग्स, एसडी) अंडे के लदान के लिए लैब कालोनियों की स्थापना और पालन प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Qualitative Filter Paper (Black) Ahlstrom 8613-0900 For egg microinjection
1 oz Containers  Anny's Plastic Tableware ASET101 Egg container
Drosophila Agar Type II Apex 66-103 Substrate for WCR egg-laying dish
Featherweight Forceps  Bioquip 4748 Handling larvae and pupae 
Clorox Regular-Bleach1 Clorox 44600-30770 Wash corn and dishes
Trucker's Favorite Yellow Coor Farm Supply 502 Corn for feeding WCR
Microinjection System (Homemade) NA Parts & instructions available upon request Controls injection pressure (0-20 psi)
Elmer's Non-toxic Glue Elmer's Products, Inc. E304 Glue eggs on filter paper
epTIPS Microloader Tips Eppendorf C2554691 Backfilling needle loading tips
Falcon Tissue Culture Dishes Falcon 25383-103 Sprouting corn /150 x 25 mm
Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles Fisher Scientific S47576C Making agar dish for egg-lay/9cm
Sparkleen Fisher Scientific 04-320-4 Wash dishes
Plain Microscope Slides Fisher Scientific 12-549-3 Holding filter paper and eggs for microinjection
Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute Frontier Agricultural Sciences  F9766B WCR adult artificial diet
Cotton Balls, Large Genesee Scientific 51-101 Close the flask
Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes Globe Scientific 137035 Collect and transfer eggs
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope  Leica M165 FC  WCR screening
DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope Leica DSR Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm
EGFP filter Leica GFP2 Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm
BugDorm MegaView Science DP1000_5P Cage for adult colony
Miniature Paint Brush MyArtscape MAS-102-MINI Liner 2/0 
Joystick Micromanipulator Narishige MN-151 Micromanipulator and needle holder
Microscope XY Stage Olympus 265515 Microscope stage (adapted for use with stereoscope)
Grade 90 Cheesecloth Online Fabric Store CHEE90 For egg-lay
Plastic paraffin film  Pechiney Plastic Packaging PM-996 Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft
Percival Incubator Percival  I41VLH3C8 WCR growing chamber (insect rearing incubator)
Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks VWR 4980-300-PK Water container for adult colony 
Griffin Low Form Beakers VWR 1000-600-PK For egg wash
Braided Cotton Rolls Richmond Dental Cotton Co. 605-3599 Use in water supply for adult colony 
Petri Dishes (35x10mm) SIGMA CLS430588-500EA For diet plates
Phenol Red Sigma 143-78-8 Microinjection buffer
Laser-based Micropipiette Puller Sutter Instrument P-2000/G Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
Premium Topsoil The Scotts Company 71130758 Soil for cron growing
Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags United States Plastic Corporation 48342 Bag agar dish after microinjection/5x7
Petri Dishes (100x15m) VWR 89038-968 Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm
6 oz Containers Webstaurantstore 128E506 WCR single pair mating chamber 
38 oz Containers Webstaurantstore 128NC888 Larvae rearing box/38 oz
ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container Webstaurantstore 128HRD16 Larvae rearing box/16 oz
Microinjection Scope  Wild Heerbrugg WILD-M8 Microinjection scope outfited with an XY stage
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 Microinjection needles
Adult Western Corn Rootworms North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory Non-diapase strain Request from Dr. Bryan Wade French's lab
Plasmid DNA Midi Kit Qiagen 12143 Purification of injection-ready plasmid DNAs

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References

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इंजीनियरिंग अंक १३४ भ्रूण microinjection कार्यात्मक जीनोमिक्स germline परिवर्तन transgenesis CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन वेस्टर्न कॉर्न rootworm
पश्चिमी मकई Rootworm के Microinjection, <em>Diabrotica virgifera virgifera</em>, Germline परिवर्तन के लिए भ्रूण, या CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन
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Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S.,… More

Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing. J. Vis. Exp. (134), e57497, doi:10.3791/57497 (2018).

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