Summary
Hier präsentieren wir Protokolle für sammeln und microinjecting precellular westlichen Mais Maiswurzelbohrer Embryonen zum Zwecke der Ausführung der funktionellen Genomik Assays wie Keimbahn Transformation und CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung.
Abstract
Der Maiswurzelbohrer (WCR) ist ein wichtiger Schädling von Mais und ist bekannt für seine Fähigkeit, schnell zu Pest Managementstrategien anzupassen. RNA-Interferenz (RNAi) erwies sich ein leistungsfähiges Werkzeug für WCR Biologie zu studieren, hat aber seine Grenzen. Speziell, RNAi selbst vergänglich ist (d. h. nicht zu langfristigen Mendelian Erbschaft des zugehörigen Phänotyps), und es erfordert eine Kenntnis der DNA-Sequenz des Zielgens. Letzteres kann die Begrenzung wenn der Phänotyp des Interesses von schlecht erhaltenen oder auch neuartigen Genen gesteuert wird weil er einfach nur nützliche Ziele schwierig sein würde, wenn nicht gar unmöglich. Daher sollte die Anzahl der Werkzeuge in WCRs genomische Toolbox durch die Entwicklung von Methoden, die verwendet werden könnte, um stabile mutierte Stämme erstellen und aktivieren Sequenz-unabhängige Umfragen des Genoms WCR erweitert werden. Hier zeigen wir die Methoden zum Erfassen und microinject precellular WCR Embryonen mit Nukleinsäuren verwendet. Während die hier beschriebenen Protokolle auf die Schaffung von transgenen WCR ausgerichtet sind, könnte CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung auch mit durchgeführt werden die gleichen Protokolle mit dem einzigen Unterschied, die Zusammensetzung der Lösung in die Embryonen injiziert.
Introduction
Maiswurzelbohrer (WCR), Diabrotica Virgifera Virgifera, ist ein wichtiger Schädling von Mais1. Interessanterweise scheint WCR Überwindung Kontrolle Maßnahmen schneller als die meisten landwirtschaftlichen Schädlinge, da sie nicht nur physiologisch sondern auch verhaltensorientierte2,3,4,5, anpassen 6. im letzten Jahrzehnt RNA-Interferenz (RNAi), ein leistungsfähiges funktionelle Genomik Werkzeug, wurde als eine mögliche Steuerungsmethode für WCR7,8untersucht, und wurde auch als Mittel verwendet, um gen Funktion9zu studieren. Während RNAi durch Mikroinjektion von doppelsträngige RNA (DsRNA) bei anderen Spezies häufig durchgeführt wird, ist jedoch Injektion basierende RNAi in WCR selten. In der Tat gibt es nur wenige Berichte über RNAi per Mikroinjektion von DsRNA in WCR9. Der Grund ist, dass WCR auch erlaubt das Studium der embryonalen Effekte durch die Fütterung von DsRNA der Mutter11High-Level der Gen Knockdown über Einnahme von DsRNA7,10, erreichen kann. Während diese Methode eine ausgezeichnete Thema für funktionelle Genomanalyse über RNAi WCR macht, hat es Fortschritte bei der Entwicklung von Methoden zur embryonalen Mikroinjektion in dieser Spezies verlangsamt.
Trotz der Macht der RNAi gibt es ein paar Nachteile. Zum Beispiel reagieren nicht alle Gene gleich auf RNAi. Diese Variabilität kann Interpretation der Ergebnisse eines funktionellen Genomik-Assays schwieriger machen. Auch, RNAi ist flüchtig und löst keine vererbbare Mutationen. Auf der anderen Seite erzeugen Keimbahn Transformation, eine weitere funktionelle genomische Tool, vererbbare Mutationen über Einfügung eines markierten Elements übertragbar in das Genom12,13. Dies macht Keimbahn Transformation ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Erstellung von mutierte Stämme für den Einsatz in genetischen Langzeitstudien. Transformation kann auch verwendet werden, um eine Mutation zu retten, durch die Bereitstellung einer funktionsfähige Kopie des Gens für eine mutierte Genom-14. Darüber hinaus ist die Keimbahn Transformation der Grundstein für eine Vielzahl von molekulargenetischer. Neben ausschlagen und/oder Rettung Genfunktion, Germline Veränderung Enhancer Trapping15, Gene Trapping16, Gal4-basierte ektopische Expression17und genomweite Mutagenese18einsetzbar.
Vor kurzem wurden Tools, mit denen anspruchsvolle Genom-Bearbeitung entwickelt. Zu diesen Tools zählen Transkription Activator-Like Effektor Nukleasen (TALEN) und die CRISPR/Cas9-Nuklease System19,20. Der Vorteil dieser neuen Werkzeuge ist, dass sie Forscher die Fähigkeit, eine doppelsträngige DNA Pause an fast jedem Ort in fast jedem Genom zu induzieren. Sobald induziert, diese Pausen können repariert werden, durch nicht-homologe Enden verbinden, die Deletionen oder Insertionen in das gezielte gen einführen kann, oder durch Homologie gerichtete Reparatur, die in der Gegenwart ein veränderter Konstrukt, katalysieren kann die Ersatz des gesamten Gene oder genetische Regionen21,22. Diese Methoden erfordern jedoch Mikroinjektion von DNA, RNA und Protein zu sehr jungen Embryonen.
Wichtig ist, überschreiten nicht anders als die DsRNAs verwendet für RNAi, Nukleinsäuren und Proteine zur Keimbahn Transformation und Genom-Bearbeitung leicht Zellmembranen. Daher muss Mikroinjektion von Plasmid-DNA, mRNAs und/oder Proteine statt in der syncytial Blastoderm Phase (d. h. vor der Insekten Embryo cellularizes). Dadurch wird dem Zeitpunkt der Injektionen einen kritischen Faktor. Zum Beispiel in Drosophila Melanogastermüssen Embryonen injiziert werden, innerhalb von zwei Stunden nach Ei12zu legen. Daher muss Entwicklung eines erfolgreichen embryonalen Mikroinjektion Protokolls für WCR die besten Voraussetzungen für weibliche Eiablage, sowie die beste Methode zum Sammeln von precellular Embryonen in ausreichender Menge berücksichtigen.
Dem Bemühen, eine Vielzahl von molekularen genetischen Werkzeuge auf WCR Biologie zu bringen erfordert Methoden zum Sammeln und microinjecting precellular WCR Embryonen entwickeln. Hier bieten wir Ihnen eine ausführliche Anleitung, zusammen mit Tipps und Tricks, um anderen Transformation-basierte Techniken WCR Forschung verwendet zu helfen. Diese Techniken ermöglichen neben der Verlängerung transgener Technologies, WCR für funktionelle Genomforschung Studien, auch leistungsstarke neue Bekämpfungsstrategien wie gen Fahrt23,24 in diesem wirtschaftlich bedeutenden getestet werden Schädling.
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Protocol
(1) Kolonie-Ebene Aufzucht von WCR Erwachsene
- Erhalten Sie eine ausreichende Menge an WCR Erwachsene (500-1.000) von einem zuverlässigen Unternehmen oder Forschung Labor (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel) und legen Sie in einem 30 cm3 -Käfig.
Hinweis: Eine nicht ruhenden Belastung wird sehr empfohlen. - WCR künstliche Ernährung nach Protokoll des Herstellers vorbereiten und Gießen Sie eine 1 cm dicken Schicht in eine 38 Unzen-Container (siehe Tabelle der Materialien). Nach dem Mischen speichern Sie ungenutzte Diät bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.
- Setzen Sie eine Petrischale (100 x 15 mm) mit Erwachsenen Diät (10-15 g) in einen 30 cm3 -Käfig. Fügen Sie weitere Diät, wenn das Essen trocken oder niedrig ist.
- Setzen Sie eine Flasche (300 mL) mit Wasser, bedeckt mit einem Wattebausch, die verwendet wird, um eine Watterolle (6 "x 3/8"), dienen zu halten als eine Wasserquelle. Wechseln Sie das Wasser, wenn es zur Neige geht.
- WCR bei 26 ° C mit 60 % Luftfeuchtigkeit zu erhalten und eine 14:10 leichte Zyklus in ein Insekt Aufzucht Inkubator.
(2) Embryo Sammlung und Ausrichtung
- Machen Sie ein Ei Sammelkammer mit 1 % Agar in Wasser in einem sterilen 100 x 15 mm2 Petrischale. Nach das Agar erstarrt bei 4 ° C lagern.
- Um neu gelegten Eiern zu sammeln, legen Sie eine einzelne Schicht aus Filterpapier, gefolgt von 4 Schichten von Gaze (jeder Schnitt, Größe) auf der Oberfläche des Nährbodens (Abbildung 1A).
Hinweis: Gaze kann wiederverwendet werden, nachdem er gewaschen in Bleichmittel und autoklaviert, aber es ist nicht notwendig, dies bei der ersten Verwendung zu tun. Filterpapier darf nicht wiederverwendet werden und muss nicht sterilisiert werden. - WCR Käfig so spät in den Tag wie möglich (Ende des Arbeitstages) Ei Sammlung Platte setzen und abdecken mit Alufolie Zelt. Lassen Sie über Nacht.
Hinweis: Nachdem die Lichter auf von 10:00 bis 12: 00 Uhr (14 h) Verzögerungen Eiablage, erleichtert die Sammlung von jüngeren Eiern für die Mikroinjektion ohne Laborpersonal Sammelkammer in Käfig spät in der Nacht zu platzieren. - Entfernen Sie das Ei Sammelkammer rund 8 oder 09:00
- Verwenden Sie Zange um zu holen 1 Schicht aus Gaze Zeit und Ort in einem Becherglas (500 mL) Wasser. Waschen von Eiern aus Gaze von leichtem rühren (Abbildung 1 b und 1 C).
- Verwenden Sie eine Glühbirne Pipette Eiern in ein weiteres Becherglas (500 mL) Wasser zu übertragen. Wiederholen Sie 2-3 X um die Eizellen zu reinigen.
- Verwenden Sie die Glühbirne Pipette übertragen von Eiern auf Filterpapier (Abbildung 1) bei gleichzeitiger Minimierung der Menge an Wasser Verschleppung.
- Schneiden Sie schwarzes Filterpapier in Streifen so breit wie ein Glas Folie und Klebeband fest an der Folie, um sicherzustellen, liegt das Papier flach (Abbildung 2A).
Hinweis: Schwarzes Filterpapier verbessert die Sichtbarkeit unter dem Mikroskop durch Verringerung der Menge des reflektierten Lichts. - Ungiftigen Kleber auftragen (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel) auf das Filterpapier in feinen Linien (Abb. 2 b). Halten Sie die Klebstoff-Linien dünner ist als der Durchmesser eines Eies zu vermeiden, die Eiern, die im Klebstoff beschichtet.
- Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um sanft WCR Eiern eins nach dem anderen aus ihrer Filterpapier in die Klebefuge verschieben. Versuchen Sie, die Eiern auf den Kleber legen, bevor es trocknet aus und halten Sie mindestens ein Ei Abstand zwischen jedem Ei.
- Injektion Effizienz zu maximieren, indem Sie mehrere Zeilen von Eiern auf einem Filterpapier Folie (Abbildung 3).
- Nachdem alle Eizellen auf dem Filterpapier gelegt sind, warten Sie, bis der Leim, bevor Mikroinjektion trocknet.
Hinweis: Für Germline Veränderung und CRISPR/Cas9-vermittelten Genom Bearbeitung, Spritzen Sie alle Embryonen bis zum Mittag (12:00), damit der älteste Embryo nicht mehr als 19 h alt ist. Jedoch für RNAi gibt es keine zeitliche Begrenzung, da im WCR, DsRNA zwischen den Zellen bewegen kann. In der Tat könnte bessere Überlebensraten für RNAi, Alterung Embryonen führen.
3. Vorbereitung der Plasmid-DNA und Injektionsnadeln
- Bereiten Sie qualitativ hochwertige supercoiled Plasmid-DNA mit Hilfe einer Endotoxin-freie kommerzielle kit (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel).
- Um die Injektionslösung vorzubereiten, überprüfen Sie die Konzentration der einzelnen Plasmid und verbinden Sie Helfer Plasmid (250 ng/µL Endkonzentration), Spender Plasmid (750 ng/µL Endkonzentration) und Phenol rot Puffer (20 % Endkonzentration). Wirbel die Lösung kurz und Zentrifuge für 3 min bei maximaler Geschwindigkeit Partikel ausgefällt, die die Nadel verstopfen könnten.
- Ziehen Sie Borosilikatglas Nadeln (O.D. 1 mm, I.D. 0,58 mm, Länge 10 cm) mit einem flammenden/braun Typ Mikropipette Abzieher. Für die Lagerung deaktivieren sichere zog Nadeln auf doppelseitiges Klebeband in einer Petrischale oder andere Container.
Hinweis: Für die Mikropipette Puller System, die verwendeten Einstellungen waren: Wärme = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Abgleich die Injektionsnadel mithilfe einen Mikro-Loader Spitze (siehe Tabelle der Materialien) zu pipettieren 0,5 - 1,0 µL nach unten in die Nadel in der Nähe das spitz zulaufende Ende. Entfernen Sie Luftblasen aus der Spitze der Nadel, wenn auftreten.
- Legen Sie die Injektionsnadel in den Nadelhalter.
- Öffnen Sie die Spitze der Nadel durch sanft brechen mit einer feinen Pinzette oder sanft berühren/ziehen die Spitze auf das Deckglas oder Glas Folie.
Hinweis: Das Ziel ist es, die kleinste Öffnung haben, noch die Injektion Mischung zu kommen, erlaubt (kleinere Öffnungen erfordern in der Regel höheren Einspritzdruck). Abgeschrägte Nadeln erforderlich nicht diesen Schritt, da sie bereits geöffnet sind.
4. Mikroinjektion und nach der Injektion Pflege
- Mit einem feinen Pinsel, vorsichtig die Oberfläche von 1 bis 3 Eiern mit sterilem Wasser nass, Stechen Sie die Nadel und die Lösung zu injizieren. Jedes Ei zu injizieren, bevor die Oberfläche trocknet. Suchen Sie das Erscheinungsbild eine kleine Menge der roten Farbe in Eiern während der Einspritzung an die erfolgreiche Mikroinjektion. Zerquetschen Sie, oder entfernen Sie alle Eizellen, die suchen Sie beschädigt, leer, oder sonst können nicht injiziert werden.
Hinweis: Obwohl Einspritzdruck je nach Bohrung Nadelstärke variiert, 10-13 Psi ist ein guter Ausgangspunkt. - Nachdem alle Eizellen injiziert werden, entfernen Sie das Filterpapier aus der Glas-Folie.
- Legen Sie das Filterpapier auf die Oberfläche einer 1 % Agar-Schale (oben beschrieben).
- Verwenden Sie Kunststoff Paraffin Film zu versiegeln die Schüssel, und legen Sie in einem 26 ° C Insekt Aufzucht Inkubator für 12 Tage.
Hinweis: Der Paraffin-Film verhindert Kreuzkontamination von Schimmel zwischen den Gerichten. Eine andere Behandlung, Schimmel und Bakterienwachstum zu verhindern könnte jedoch das Überleben der injizierten Embryonen reduzieren.
(5) kultiviert und schlüpfen der Embryonen
- Fangen Sie an Embryonen 12 Tage nach der Injektion für die frisch geschlüpften Larven überprüfen und weiterhin täglich für die nächsten 2 Wochen.
- Larven, mit einem feinen Pinsel um eine Aufzucht Box mit gekeimtes Getreide und Boden zu übertragen.
Hinweis: Schimmel in der Agar-Schale wachsen könnte, sondern Larven schlüpfen nach wie vor in den meisten Fällen. Suchen Sie nach Larven sorgfältig in die Form, um sie alle zu fangen. Einige Larven auf den Deckel der Schale bewegen könnte und möglicherweise in der Kondensation stecken. - Hinten Sie Larven bei 26 ° C standard WCR Aufzucht Methoden25nach.
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Representative Results
Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung dieses Protokolls war die Phase der Embryonalentwicklung zum Zeitpunkt der Mikroinjektion. Insbesondere erfordert Keimbahn Transformation Mikroinjektion von DNA vor der embryonalen Cellularization. Und zwar deshalb, weil DNAs Zellmembranen leicht überschreiten können. Versuche, die Phasen des WCR Embryonalentwicklung mit einem nuklearen Fleck visualisieren blieben erfolglos, weil Dechorionation WCR Embryonen im Wesentlichen alle verantwortlich für die Integrität des Embryos schutzhäuten auflöst. Jedoch wurde diese Linie der Untersuchung durch eine weitere Schwierigkeit – Erwerb von Embryonen in ausreichender Menge in einer fristgerechten Weise verdrängt. Im Feld WCR Weibchen legen ihren Eiern im Boden, so sollte es keine Überraschung, dass im Labor, Frauen nur im Dunkeln Eiablage. Dies erschwert die kurze tagsüber Sammlungen (2-4 h). Um dieses Problem zu überwinden, wurde eine einzelne Übernachtung Ei legen und wurde festgestellt, dass große Mengen an Embryonen ergeben. Obwohl der Prozess des Sammelns (Abbildung 1) und auslegen (Abbildung 2) Embryonen für die Mikroinjektion etwas mühsam, wenn schnell erledigt ist ermöglicht dieses Protokoll Mikroinjektion von Embryonen, die zwischen 2-19 h alt zum Zeitpunkt der Einspritzung und keine älter als 24 h wenn Injektionen im Laufe des Tages durchgeführt werden. Vergleich der Entwicklungszeiten zwischen WCR und andere Arten legt nahe, dass WCR Embryonen noch precellular bei 24 h post Ei zu legen (siehe Diskussion) sein sollte.
Die ersten Versuche der Keimbahn Umwandlung der WCR beteiligt Co-Injektion (Abbildung 3) Helfer (Transposase Quelle) und Geber (Transposon) Plasmide in precellular Embryonen. Der Transformation-Marker für die Spender-Plasmid wurde ein grün fluoreszierendes Protein (EGFP) Gen konstitutiv aktiv Förderer von Tribolium Castaneum (Alpha-Tubulin Veranstalter26) angetrieben. Embryonalen Überlebensraten waren gering (Tabelle 1), aber 26 G0 Erwachsene wurden geborgen. Um festzustellen, ob der Spender-Element Keimzellen, G1 Embryonen eingefügt wurden zum EGFP Ausdruck überprüft. Obwohl fluoreszierende Nachkommen tatsächlich identifiziert wurden (Abbildung 4), screening WCR Embryonen mit der intensiven Lichtquelle erwies sich als tödliche27. Die nächste Runde der Keimbahn Transformation verwendet eine neue Spender Plasmid, man besitzt ein rot fluoreszierenden Proteins (DsRed)-Gen, angetrieben von einem konstitutiv aktiv Förderer von Drosophila Melanogaster (Heat Shock Protein 70 Veranstalter28 ). Während Überlebensraten waren viel besser geworden (Tabelle 1), produziert die Überlebenden Erwachsenen nur eine einzige DsRed-Positive Larve (Abbildung 5). Allerdings waren diese Experimente in zweierlei Hinsicht besonders aufschlussreich. Erstens wurde es entdeckt, dass Mikroinjektion führte zu Verzögerungen in der Entwicklung, was zu einer längeren Zeit zu Luke. Alle Embryonen schlüpfen innerhalb von 2 Wochen geschlüpft injizierte Embryonen zwischen 12 und 26 Tage Post Mikroinjektion, erfordern somit eine längere Überwachung um sicherzustellen, dass alle Jungtiere gesammelt wurden. Zweitens wurde festgestellt, dass die frisch geschlüpften Larven ziemlich aktiv waren. Sie krochen auf den Deckel wo sie würde stecken, und manchmal aus der Agar-Schale entkam. Diese Probleme waren überwinden durch Abdichtung Petrischalen mit einer Paraffin-Folie und Deckel und Agar für Jungtiere sorgfältig zu prüfen.
Die endgültige Version dieses Protokolls Injektion wurde von microinjecting WCR Embryonen mit Puffer allein oder mit Helfer und Auge-Promotor (3xP329) markiert Spender DNA Plasmide getestet. Als zusätzliche Kontrolle, einen anderen Satz von Embryonen identisch behandelt wurden, aber nicht mikroinjiziert waren. Vier Sätze von Embryonen wurden mit beiden Injektionslösung injiziert. Insgesamt 485 Embryonen wurden injiziert mit Puffer und von diesen, 148 geschlüpft (Luke Rate = 30,5 %, Tabelle 1). 1.450 Embryonen mit Plasmid DNA injiziert, 289 geschlüpft (Quote = 26,8 %). Interessanterweise, der 470 Embryonen, die die gleichen Ei-Handling-Bedingungen unterzogen, aber ohne Mikroinjektion, nur 250 geschlüpft (Quote = 53,2 %). Dass die Überlebensrate der uninjected Embryonen 20 % höher als die Überlebensraten für injizierten Embryonen ist aufgrund der unvermeidlichen Schäden durch Mikroinjektion zu erwarten. Allerdings ist kaum ein Unterschied zwischen Puffer Injektion und DNA-Injektion, was darauf hindeutet, die Menge an DNA hinzugefügt wird ist akzeptabel für WCR gesehen (siehe Diskussion). Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die Überlebensraten in früheren Bemühungen verbessert. Erfolgreiche Etablierung der transgenen Linien, die mit dieser Methode wurde an anderer Stelle berichtet,27.
Abbildung 1: Ei-Sammlung. (A) Ei Sammelkammer. B) Zoomed-Ansicht eines Teils der ein Ei Kammer nach 24-h-Ei zu legen. Beachten Sie, dass die Pfeile zeigen die Position ein paar Eier. C) Waschen von Eiern aus Gaze. D) die endgültige Übertragung von WCR Eiern. Beachten Sie, dass die Klammer die Region mit dicht gepackten WCR Embryonen (d. h. minimal Wasser) zeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Vorbereiten einer Injektion Folie. (A) schwarzes Filterpapier mit Klebeband fest an einen standard Objektträger. B) Zoomed-Ansicht eines Abschnitts einer Injektion während des Vorbereitungsprozesses schieben. Hinweis, Pfeil #1 gibt den Speicherort der eine Reihe von Eiern, #2 Teilzeile Kleber und #3 Pin verwendet, um den Kleber zu verbreiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Injektion von Embryonen. Eine Injektion Folie mit acht Reihen von Eiern. Aufgrund des Winkels der Injektionsnadel können aufeinanderfolgende Zeilen von Embryonen injiziert werden, durch einfaches Verschieben der Bühne. Hinweis der rote Farbstoff in die Injektionsnadel hilft stark Visualisierung der Injektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Transgene G1 Embryo. Embryonen aus einem WCR Erwachsenen das Co injiziert mit PiggyBacwar-auf der Basis Helfer und Spender Plasmide als einen frühen Embryo. Der hellen grünen Embryo ist positiv für verbesserte grün fluoreszierendes Protein (EGFP) Ausdruck, während die anderen nicht. EGFP Ausdruck richtet sich nach der Tribolium Castaneum Alpha-Tubulin -Promotor-26. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Transgene G1 Larve. 3. Instar Larven, deren Elternteil Co injiziert mit PiggyBac war-basierte Helfer und Spender Plasmide als frühen Embryo. Die rote glühende Larve auf der linken Seite ist positiv für DsRed Ausdruck, während die Larve auf der rechten Seite nicht. DsRed Ausdruck richtet sich nach der Drosophila Melanogaster Hitzeschock 70 Veranstalter28. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Experiment | Behandlung | Eiern | Ausgebrütet | Schraffur-Rate |
| Exp #1 | ΑtubEGFP-Spender | 910 | 57 | 6,3 % |
| Exp #2 | hsp70DsRed-Spender | 1580 | 211 | 13,4 % |
| Exp #3 | 3xP3EGFP-Spender | 1450 | 389 | 26,8 % |
| Puffer | 485 | 148 | 30,5 % | |
| No-Injektion | 470 | 250 | 53,2 % |
Tabelle 1: Daten der Mikroinjektion. Schlüpfen Sie Preise ab drei Mikroinjektion Experimente an WCR Embryonen, zeigt die Gesamtzahl der Eizellen injiziert, die Gesamtzahl der Larven, die erfolgreich geschlüpft und die Luke Rate.
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Discussion
Obwohl Mikroinjektion des WCR mit DsRNAs zum Zwecke der RNAi gemeldeten9wurde, dies ist das erste Protokoll, best Practices für microinjecting precellular WCR Embryonen, ein kritischer Prozess für die Durchführung von Keimbahn Transformation zu etablieren und/oder CRISPR/Cas9 Genom Bearbeitung in dieser Art. Erfolgreiche Mikroinjektion WCR Embryonen ist abhängig von vielen Faktoren ab, wie transformationseffizienz. Nachfolgend sind einige der wichtigsten Fragen das Ergebnis unter Verwendung dieses Protokolls für die Keimbahn Transformation in dieser Käfer beeinflussen.
Precellular Embryonen zu erhalten
Wie oben erwähnt, kreuzen DNA nicht Zellmembranen, was die Art und Weise DsRNA kann. Dies bedeutet, dass es von entscheidender Bedeutung, dass DNA, mRNA und/oder Proteine injiziert werden, bevor es zu Cellularization kommt. Da der Zeitpunkt der Injektion kritisch ist, war es wichtig zu bestimmen, ein wahrscheinlich Fenster für erfolgreiche Mikroinjektion basierend auf wie lange dauert die Nondiapausing WCR Belastung30 Embryogenese abgeschlossen. Dies wurde basierend auf detaillierten Studien über das Timing der syncytial Blastoderm Bühne in einem anderen Käfer, Tribolium Castaneumberechnet. In Triboliumtritt Cellularization ~ 8 h Post Ei lag bei 30 ° C-31. Da es für Tribolium ~3.5 Tage, vollständige Embryogenese bei 30 ° C dauert, findet Cellularization ein Zehntel des Weges in den Prozess. Da WCR Embryonen fast 2 Wochen entwickeln werden, kann Cellularization nicht auftreten, bis der zweite Tag Post Ei zu legen. Deshalb wurde davon ausgegangen, dass das Fenster für die erfolgreiche Mikroinjektion mindestens 24 Stunden lang, das ist hilfreich, da WCR erfordern Übernachtung Eiablage um ausreichende Mengen von Eiern für die Mikroinjektion zu bieten. Während diese Methode für erfolgreiche Transgenese27verwendet wurde, ist es denkbar, dass die Ergebnisse durch die Injektion von jüngeren Embryonen verbessert werden könnte, sofern Umgang mit sehr frühen Embryonen sie Schaden nicht.
DNA-Qualität und Konzentration
Es ist nicht verwunderlich, dass DNA-Konzentration in erfolgreiche Transformation eine zentrale Rolle spielt. Es hat lange gedacht, dass die Beibehaltung der Endkonzentration von Plasmid DNA unter 1 mg/mL potenzielle Toxizität der injizierten Embryonen32zu vermeiden. Obwohl es jetzt unklar ist, ob die Toxizität Fragen der Vergangenheit durch die DNA selbst wurden oder stattdessen das Ergebnis von Verunreinigungen aus dem Plasmid Reinigungsprozess übernommen wurden, diese Faustregel konsequent wurden seit zwei Jahrzehnten eingehalten hat. Jedoch wir vor kurzem entdeckt, dass mehr als 1 mg/mL Grenze war nicht nur möglich, sondern auch, dass dadurch höhere Umwandlung zu erreichen was zu Spekulationen, die Abwesenheit einer Ei Toxizität aufgrund der Fortschritte in Plasmid-Reinigung-Kits möglicherweise, was weniger Schadstoffe. Da den Zeitaufwand für hinten WCR, dürfte in Transformation Preise hilfreich, auch wenn es zu leicht erhöhten Sterblichkeit führt.
Enthärtung Ei Oberfläche vor Mikroinjektion
Im Gegensatz zu Triboliummuss die äußerste Oberfläche (Chorion) des WCR Embryos vor Mikroinjektion abgeschwächt werden. Dies ist ein entscheidender Schritt, auch bei Verwendung von Quarz-Nadeln. Im Idealfall Wasser auf einem einzigen Embryo unmittelbar vor der Injektion angewendet werden sollten, sondern kann auf Gruppen von 2 bis 3 Embryonen gleichzeitig angewendet werden, wenn Mikroinjektion erreicht werden kann, bevor Chorions reharden. Ohne diesen Schritt fehl Nadeln in der Regel das Chorion, wodurch des Injektion Versuch zum Scheitern verurteilt und potenziell schädliche die Nadelspitze zu durchdringen. Darüber hinaus sollte die Nadel erfolgreich eine trockene Chorion durchdringen, entweicht die Injektionslösung in der Regel zurück durch den Druck im Inneren des Embryos höher ist als der Umgebungsdruck. Es ist jedoch leicht zu trocken aus nassen (weiche) Embryonen unterscheiden. Speziell, wenn trocken, Embryonen haben eine ausgeprägte Starr, runde Form, während die Zugabe von Wasser bewirkt, dass sie ihre kugelförmigen aussehen zu verlieren. Enthärtung nicht nur ermöglicht die Nadel leicht durchdringen das Chorion, sondern reduziert auch den Innendruck der Embryo genug, den die Injektionslösung nicht austreten.
Feuchtigkeit und Schimmel
Eingespritzte Embryonen sind in einer warmen, feuchten Umgebung im gesamten Embryogenese statt. Diese Bedingungen nicht nur bieten die perfekte Umgebung für WCR Entwicklung, sondern fördern auch das Wachstum von Schimmel. Während dieser zwei-Wochen-Frist wächst Schimmel häufig auf dem Agar Geschirr Gehäuse WCR Embryonen. Leider die Embryonen erfordern hohen Luftfeuchtigkeit, und Versuche, es zu reduzieren führte zu wesentlich geringeren schlüpfraten. Interessanterweise hatte das Vorhandensein von Schimmel in der Regel wenig Einfluss auf schlüpfraten, mit die meisten Embryonen schlüpfen ohne Probleme. Darüber hinaus sind antimykotische Behandlung schädlich für WCR Embryonen, so dass der beste Weg, um Schimmelbildung zu reduzieren scheint zu sein, um Verunreinigungen zu vermeiden; Reinigung von Werkzeugen, Container und Mikroinjektion System vor dem Gebrauch, und versucht, die Zeit microinjecting auf ein Minimum reduziert, da die Pilzsporen sind weit verbreitet in vielen Laborumgebungen zu halten.
Schlussfolgerungen
Dieses Protokoll soll mehr Forscher transgene Technologien in ihrer WCR Forschung beschäftigen können und wird hoffentlich helfen bei der Entwicklung von zusätzlichen gentechnisch veränderten Pflanzen basierenden Technologien für den Einsatz in dieses Insekt. Anspruchsvolle gentechnisch veränderten Pflanzen basierenden Experimente in Tribolium könnte potenziell WCR, einschließlich Mutagenese33 und CRISPR-basierte Genom Bearbeitung34angepasst. Da diese Techniken Mikroinjektion precellular Embryonen erforderlich ist, wird dieses Protokoll nicht nur für Transposon-funktionale genomischer Studien und/oder CRISPR/Cas9-vermittelten Genom-Bearbeitung sondern auch für Genetik-basierte Pest Managementstrategien nützlich 35 , 36.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Forschungsprogramm von Monsanto Mais Maiswurzelbohrer wissen, MDL aus NCSU Nummer AG/1005 (, MDL und YC) und Startkapital gewähren. Gewähren Sie FC wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Monsantos Mais Maiswurzelbohrer wissen Research Program (AG/1005) und der National Science Foundation, Nummer MCB-1244772 (MDL). Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt. FC und MDL konzipiert und gestaltet die Experimente; FC, PW und SP durchgeführt die Experimente; FC und MDL analysiert die Ergebnisse; und FC, NG und MDL schrieb das Manuskript. Teresa O'Leary, William Klobasa und Stephanie Gorski danken wir für ihre kompetente Unterstützung in screening-WCR. Wir danken Dr. Wade French (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) für Sendungen von Eiern, Lab Kolonien und die Aufzucht Protokolle zu etablieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
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