Summary
Qui presentiamo protocolli per la raccolta e microinjecting mais precellular embrioni di Diabrotica allo scopo di eseguire dosaggi funzionali-genomica come trasformazione di germline ed editing CRISPR/Cas9-genomico.
Abstract
La diabrotica del mais (WCR) è un parassita importante di mais ed è ben noto per la sua capacità di adattarsi rapidamente alle strategie di lotta. Anche se l'interferenza del RNA (RNAi) ha dimostrato di essere un potente strumento per lo studio della biologia WCR, ha i suoi limiti. In particolare, il RNAi sé è transitoria (cioè non provocare a lungo termine eredità mendeliana del fenotipo associato), e richiede la conoscenza della sequenza del DNA del gene target. Quest'ultimo può essere limitante se il fenotipo di interesse è controllato da geni scarsamente conservati, o anche romanzo, perché sarebbe difficile identificare gli obiettivi utili, se non impossibile. Di conseguenza, il numero di strumenti nella casella degli strumenti genomico di WCR dovrebbe essere ampliato dallo sviluppo di metodi che potrebbero essere utilizzati per creare ceppi mutanti stabile e attivare sondaggi indipendente dalla sequenza del genoma del WCR. Nel presente documento, dettagliamo i metodi utilizzati per raccogliere e microinject precellular embrioni WCR con acidi nucleici. Mentre i protocolli descritti nel presente documento sono finalizzati alla creazione di transgenici WCR, editing CRISPR/Cas9-genomico potrebbe essere eseguita anche utilizzando gli stessi protocolli, con l'unica differenza è la composizione della soluzione iniettata gli embrioni.
Introduction
Diabrotica del mais (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, è un parassita importante di mais1. È interessante notare, WCR sembra superare controllo misure più rapidamente di artropodi di interesse agrario più poiché essi non solo adattarsi fisiologicamente ma anche comportamentale2,3,4,5, 6. nell'ultimo decennio, interferenza del RNA (RNAi), un potente strumento di genomico funzionale, è stato studiato come un metodo di controllo potenziale per WCR7,8ed è stato utilizzato anche come mezzo per studiare il gene funzione9. Tuttavia, mentre RNAi è effettuato frequentemente dal microinjection di RNA double-stranded (dsRNA) in altre specie, basati su iniezione RNAi è raro in WCR. In realtà, ci sono soltanto alcuni rapporti di RNAi tramite microiniezioni di dsRNA in WCR9. Il motivo è che WCR possono raggiungere livelli elevati di gene atterramento tramite ingestione di dsRNA7,10, permettendo anche lo studio degli effetti embrionali di alimentazione dsRNA di madre11. Mentre questo metodo rende WCR un ottimo soggetto per analisi genomica funzionale tramite RNAi, ha rallentato progressi nello sviluppo di metodologie per il microinjection embrionale in questa specie.
Nonostante la potenza del RNAi, ci sono alcuni svantaggi. Ad esempio, non tutti i geni rispondono ugualmente a RNAi. Questa variabilità può rendere l'interpretazione dei risultati di un'analisi di genomica funzionale più difficile. Inoltre, RNAi è transitoria e non genera mutazioni ereditabili. D'altra parte, la trasformazione di germline, un altro strumento di genomico funzionale, può generare mutazioni ereditabili tramite inserimento di un elemento trasponibile contrassegnato nella genoma12,13. Questo rende la trasformazione di germline un ottimo strumento per la creazione di ceppi mutanti per uso a lungo termine studi genetici. Trasformazione può essere utilizzata anche per salvare una mutazione formulando una copia funzionale del gene per un genoma mutante14. Inoltre, la trasformazione di germline è la pietra angolare di un'ampia varietà di tecniche di genetica molecolare. Oltre a buttare giù e/o salvataggio di funzione del gene, germline trasformazione può essere utilizzata per enhancer intrappolamento15, gene dell'intrappolamento16, espressione ectopica basata su Gal417e genoma mutagenesi18.
Più recentemente, sono stati sviluppati strumenti che consentono la modifica del genoma sofisticato. Questi strumenti includono trascrizione Activator-Like effettrici nucleasi (TALEN) e il sistema CRISPR/Cas9-nucleasi19,20. Il vantaggio di questi nuovi strumenti è che essi offrono ai ricercatori la capacità di indurre una rottura del DNA double-stranded in quasi qualsiasi posizione all'interno di quasi qualsiasi genoma. Una volta indotta, queste rotture possono essere riparate attraverso entrambe le estremità non-omologo entrare, che possono introdurre le eliminazioni o inserimenti nel gene mirato, o riparazione di omologia-diretto, che in presenza di un costrutto ingegnerizzato, può catalizzare la sostituzione dell'intero geni o regioni genetiche21,22. Tuttavia, questi metodi richiedono la microiniezione di DNA, RNA e/o della proteina negli embrioni molto giovani.
Cosa importante, a differenza di RNAds utilizzato per RNAi, acidi nucleici e proteine utilizzate per germline trasformazione ed editing genomico non può facilmente attraversare le membrane cellulari. Di conseguenza, microiniezione di plasmide DNAs, mRNA, e/o proteine deve avvenire durante la fase di blastoderm sinciziale (cioè prima che l'embrione dell'insetto cellularizes). Questo rende la tempistica delle iniezioni un fattore critico. Ad esempio, nella Drosophila melanogaster, embrioni necessario essere iniettata entro due ore dopo uovo laici12. Di conseguenza, lo sviluppo di un protocollo di successo embrionali microiniezione per WCR deve tener conto le migliori condizioni per la posa di uovo femminile, così come il metodo migliore per la raccolta di una quantità sufficiente di embrioni precellular.
Un tentativo di portare una vasta gamma di strumenti di genetica molecolare su biologia WCR richiede lo sviluppo di metodologie di raccolta ed microinjecting precellular embrioni WCR. Qui forniamo istruzioni dettagliate, insieme a suggerimenti e trucchi, per aiutare gli altri a utilizzare tecniche basate sulla trasformazione nella ricerca WCR. Oltre a estendere tecnologie transgeniche a WCR per uso negli studi di genomici funzionali, queste tecniche consentono anche potente nuove strategie di controllo dei parassiti come gene unità23,24 per essere testato in questo economicamente importante dei parassiti.
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Protocol
1. a livello di Colonia allevamento del WCR adulti
- Ottenere una quantità sufficiente di adulti WCR (500-1.000) da un laboratorio affidabile azienda o ricerca (Vedi Tabella materiali per un esempio) e posto in una gabbia di3 cm 30.
Nota: È consigliabile l'uso di un ceppo non-diapausing. - Preparare la dieta artificiale WCR, seguendo il protocollo del produttore e versare uno strato dello spessore di cm 1 in un contenitore di 38 oz (Vedi Tabella materiali). Dopo la miscelazione, è possibile memorizzare inutilizzato dieta a 4 ° C fino a 2 mesi.
- Mettere una capsula Petri (100 x 15 mm) con adulti dieta (10-15 g) in una gabbia di3 cm 30. Aggiungere più dieta quando il cibo è scarso o asciutto.
- Mettere in un pallone (300 mL) con acqua, coperto con un batuffolo di cotone, che viene utilizzato per tenere in posizione un rotolo di cotone (6 "x 3/8"), per servire come una fonte d'acqua. Cambiare l'acqua quando sta per esaurirsi.
- Mantenere WCR a 26 ° C con 60% di umidità ed un 14:10 luce ciclo in un insetto allevamento incubatrice.
2. gruppi di raccolta e di allineamento
- Prenotare una camera di raccolta di uovo utilizzando 1% agar in acqua in una sterile 100 x 15 mm2 piastra di Petri. Conservare a 4 ° C dopo l'agar solidifica.
- Per raccogliere le uova appena deposte, posizionare un singolo strato di carta da filtro, seguita da 4 strati di garza (ogni taglio al formato) sulla superficie dell'agar (Figura 1A).
Nota: Garza può essere riutilizzata, dopo essere stato lavato in candeggina e sterilizzato nell'autoclave, ma non è necessario eseguire questa operazione per il primo utilizzo. Carta da filtro non dovrebbero essere riutilizzato e non ha bisogno di essere sterilizzato. - Luogo piastra di raccolta uova in gabbia WCR più tardi nel corso della giornata come possibile (fine della giornata lavorativa) e coprire con una tenda di carta stagnola. Lasciare durante la notte.
Nota: Avere le luci da 10 a deposizione delle uova 12 A.M. (14 h) ritardi, facilitando così la raccolta delle uova più giovane per il microinjection senza richiedere personale di laboratorio a luogo camera di raccolta in gabbia a tarda notte. - Rimuovere la vaschetta di raccolta uova circa 8 o 9
- Usare pinze per raccogliere 1 strato di garza in un momento e il luogo in un becher (500 mL) di acqua. Lavare le uova al largo di garza di mescolando delicatamente (Figura 1B e 1C).
- Utilizzare una pipetta per trasferire le uova in un altro Becher (500 mL) di acqua. Ripetere 2-3 volte per pulire le uova.
- Utilizzare la pipetta per trasferire uova su carta da filtro (Figura 1), riducendo al minimo la quantità di riporto di acqua.
- A listarelle nero carta da filtro largo come un vetrino e nastro saldamente alla diapositiva per assicurarsi che la carta appoggiato in piano (Figura 2A).
Nota: Nero carta da filtro aiuta a migliorare la visibilità sotto il microscopio, riducendo la quantità di luce riflessa. - Applicare la colla non tossico (per un esempio, vedere Tabella materiali ) per la carta da filtro in linee sottili (Figura 2B). Mantenere le linee di colla più sottile rispetto al diametro di un uovo per evitare che le uova rivestite in colla.
- Utilizzare un pennello fine per spostare delicatamente WCR uova uno per uno da loro carta da filtro per la linea di colla. Tenta di deporre le uova sulla colla prima si asciuga e mantenere distanza di almeno un uovo tra ogni uovo.
- Massimizzare l'efficienza di iniezione inserendo più righe di uova nella diapositiva di una carta da filtro (Figura 3).
- Dopo tutte le uova sono disposte su carta da filtro, attendere fino a quando tutta la colla asciuga prima microiniezione.
Nota: Per la trasformazione di germline e per editing genomico CRISPR/Cas9-mediata, iniettare tutti gli embrioni di mezzogiorno (12) affinché l'embrione più antica è vecchio non più di 19 h. Tuttavia, per RNAi, non c'è nessuna limitazione di tempo perché, a WCR, dsRNA può spostarsi tra le celle. Infatti, per RNAi, embrioni di invecchiamento potrebbero comportare meglio tassi di sopravvivenza.
3. preparazione del plasmide DNAs e aghi per iniezione
- Preparare il DNA del plasmide supercoiled alta qualità utilizzando un'endotossina-libero commerciale kit (Vedi Tabella materiali per un esempio).
- Per preparare la soluzione per iniezione, controllare la concentrazione di ogni plasmide e quindi combinare plasmide helper (concentrazione finale di 250 ng / µ l), donatore plasmide (concentrazione finale di 750 ng / µ l) e buffer di rosso fenolo (concentrazione finale di 20%). Vortice la soluzione brevemente e centrifugare per 3 min a velocità massima per far precipitare le particelle che potrebbero intasare l'ago.
- Tirare aghi di vetro borosilicato (O.D. 1 mm, D.I. 0,58 mm, lunghezza 10 cm) utilizzando un estrattore di Flaming/marrone tipo micropipetta. Per deposito, fissare aghi tirati il nastro adesivo su due lati in una capsula di Petri o altro contenitore chiaro.
Nota: Per il sistema di estrattore micropipetta, le impostazioni utilizzate erano: calore = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Recupero informazioni l'ago per iniezione utilizzando un micro-caricatore suggerimento (Vedi Tabella materiali) per dispensare 0,5 - 1,0 µ l giù all'interno dell'ago, vicino l'estremità appuntita. Rimuovere le bolle dalla punta dell'ago, qualora si verificassero.
- Il porta-aghi, inserire l'ago per iniezione.
- Aprire la punta dell'ago rompendo delicatamente con un bel paio di pinze, o delicatamente toccando/trascinando la punta sul vetrino coprioggetto o vetro.
Nota: L'obiettivo è di avere l'apertura più piccola che ancora permette il mix di iniezione a venire fuori (aperture più piccole richiedono generalmente più alta pressione di iniezione). Aghi smussati non richiedono questo passaggio, poiché essi sono già aperti.
4. microinjection e cura post-iniezione
- Usando un pennello fine, accuratamente bagnare la superficie di 1-3 uova con acqua sterile, inserire l'ago e iniettare la soluzione. Iniettare ogni uovo prima che la superficie si asciughi. Cercare l'aspetto una piccola quantità di colore rosso all'interno di uova durante l'iniezione per indicare il successo microiniezione. Schiacciare o rimuovere eventuali uova che guarda danneggiato, vuoto, o in caso contrario non può essere iniettata.
Nota: Anche se la pressione di iniezione variabile in base alla dimensione di foro di spillo, 10-13 psi è un buon punto di partenza. - Dopo tutte le uova sono iniettate, rimuovere la carta da filtro dal vetrino.
- Posizionare il filtro di carta sulla superficie di un piatto di 1% agar (descritto sopra).
- Usare paraffina plastica pellicola per sigillare il piatto e messo in un insetto di 26 ° C allevamento incubatore per 12 giorni.
Nota: Il film di paraffina aiuta a prevenire la contaminazione incrociata di muffa tra piatti. Tuttavia, qualsiasi altro trattamento per prevenire la crescita batterica e muffa potrebbe ridurre la sopravvivenza degli embrioni iniettati.
5. coltura e da cova di embrioni
- Avviare il controllo di embrioni 12 giorni dopo l'iniezione per le larve appena schiuse e continuare ogni giorno per le prossime 2 settimane.
- Trasferire le larve, usando un pennello fine, a una casella di allevamento con cereale germogliato e suolo.
Nota: Muffa potrebbe crescere nel piatto di agar, ma le larve si schiudono ancora nella maggior parte dei casi. Cercare larve attentamente all'interno dello stampo per catturarli tutti. Alcune larve potrebbero spostare il coperchio del piatto e potrebbero rimanere bloccati nella condensazione. - Posteriore larve a 26 ° C, seguendo standard WCR allevamento metodi25.
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Representative Results
Una considerazione importante durante lo sviluppo di questo protocollo è stato il palcoscenico dello sviluppo embrionale al momento della microiniezione. In particolare, trasformazione di germline richiede microiniezione di DNAs prima del cellularization embrionale. Questo è perché DNAs non può facilmente attraversare le membrane cellulari. Tentativi di visualizzare le fasi dello sviluppo embrionale WCR usando una macchia nucleare erano infruttuosi, perché dechorionation di embrioni WCR essenzialmente tutte le membrane protettive responsabile dell'integrità dell'embrione si dissolve. Tuttavia, questa linea di indagine è stata soppiantata da un'altra difficoltà – l'acquisizione di una quantità sufficiente di embrioni in modo tempestivo. Nel campo, WCR femmine depongono le uova nel terreno, così non dovrebbe essere nessuna sorpresa che in laboratorio, le femmine depongono solo uova al buio. Questo rende difficile breve raccolte durante il giorno (2-4 h). Per ovviare a questo problema, un singolo Deposita uovo durante la notte è stata eseguita ed è stato trovato per produrre grandi quantità di embrioni. Anche se il processo di raccolta (Figura 1) e che stabilisce gli embrioni (Figura 2) per il microinjection è un po' laborioso, se fatto in fretta questo protocollo consente a microiniezione di embrioni che sono compresi tra 2-19 h vecchio al momento dell'iniezione e non più vecchi di 24 ore se le iniezioni vengono eseguite nel corso della giornata. Confronto dei tempi di sviluppo tra WCR e altre specie di suggerisce che gli embrioni WCR dovrebbero ancora essere precellular alle 24 h post uovo laici (vedi discussione).
I primi tentativi di trasformazione di germline del WCR coinvolto co-iniezione (Figura 3) del supporto (fonte transposase) e donatore (trasposoni) plasmidi negli embrioni precellular. L'indicatore di trasformazione per il plasmide donatore era un gene della proteina fluorescente verde (EGFP) guidato da un promotore costitutivamente attivo da tribolio Tribolium (alfa-tubulina promotore26). Tassi di sopravvivenza embrionale erano basse (tabella 1), ma 26 G0 adulti sono stati recuperati. Per determinare se l'elemento di donatore inserito in tutte le cellule di germe, G1 embrioni sono stati schermati per l'espressione di EGFP. Anche se fluorescente progenie sono stati infatti identificati (Figura 4), gli embrioni WCR con la sorgente di luce intensa di screening ha dimostrato di essere letale27. Il prossimo round di germline trasformazione utilizzato un nuovo plasmide del donatore, uno che possiede un gene proteina fluorescente rosso (DsRed) guidato da un promotore costitutivamente attivo da Drosophila melanogaster (heat shock proteins 70 promotore28 ). Mentre i tassi di sopravvivenza erano che molto migliorata (tabella 1), gli adulti sopravvissuti prodotto solo una singola larva DsRed-positiva (Figura 5). Tuttavia, questi esperimenti erano particolarmente ben informativi per quanto riguarda due. In primo luogo, si è scoperto che microiniezione ha causato ritardi nello sviluppo, risultante in un tempo estesa a tratteggio. Piuttosto che tutti gli embrioni da cova entro 2 settimane, embrioni iniettati covato tra 12 e 26 giorni post microiniezione, richiedendo così un lungo periodo di monitoraggio per garantire tutti i hatchlings sono stati raccolti. In secondo luogo, si è notato che le larve appena schiuse erano abbastanza attive. Hanno strisciato sul coperchio dove avrebbero ottenere bloccati e a volte fuggiti dal piatto di agar. Questi problemi sono stati superati Petri con un film di paraffina di tenuta ed esaminando coperchi e agar con attenzione per i neonati.
La versione finale di questo protocollo di iniezione è stata testata da microinjecting embrioni WCR con buffer da solo, o con supporto e occhio-promotor (3xP329) contrassegnato plasmidi di DNA del donatore. Come un ulteriore controllo, un'altra serie di embrioni sono stati gestiti in modo identico, ma non sono stati microiniettati. Quattro set di embrioni sono stati iniettati con una soluzione iniettabile. Un totale di 485 embrioni sono stati iniettati con buffer e di quelli, 148 covato (tasso di tratteggio = 30,5%, tabella 1). Di 1.450 embrioni iniettati con il plasmide DNAs, 289 covato (tasso = 26,8%). È interessante notare che, di 470 embrioni che hanno subito le stesse condizioni di uovo-manipolazione, ma senza microiniezione, solo 250 covato (tasso = 53,2%). Che il tasso di sopravvivenza degli embrioni uninjected è superiore ai tassi di sopravvivenza per embrioni iniettati 20% deve essere previsto a causa di inevitabili danni dovuti a microiniezione. Tuttavia, è visto poca differenza tra buffer iniezione e iniezione di DNA, che suggerisce la quantità di DNA che viene aggiunto è accettabile per WCR (vedi discussione). Questi risultati mostrano anche che i tassi di sopravvivenza migliorata negli sforzi precedenti. Stabilimento di successo di linee transgeniche utilizzando questo metodo è stato segnalato altrove27.
Figura 1: raccolta uova. A) camera di raccolta di uova. B) Zoomed-in vista di una sezione di una camera di uovo dopo 24 h uovo laici. Si noti che le frecce indicano la posizione di un paio di uova. C) lavaggio delle uova fuori una garza. D) il trasferimento finale delle uova WCR. Nota, parentesi indica la regione con embrioni WCR densamente imballati (cioè acqua minimo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: preparazione di una diapositiva di iniezione. A) nero filtro carta strettamente legato a un vetrino da microscopio standard. B) Zoomed-in vista di una sezione di un'iniezione diapositiva durante il processo di preparazione. Nota, freccia #1 indica la posizione di una fila di uova, #2 parziale linea di colla e #3 il pin utilizzato per distribuire la colla. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: iniettando embrioni. Una diapositiva di iniezione con otto righe di uova. Dato l'angolo dell'ago per iniezione, le righe successive di embrioni possono essere iniettate semplicemente muovendo il palco. Nota il colorante rosso nell'ago per iniezione aiuta notevolmente la visualizzazione dell'iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Embrione di1 G transgenici. Embrioni da un adulto WCR che era co-iniettate con piggyBac-base di plasmidi helper e donatore come un embrione precoce. L'embrione verde brillante è positivo per l'espressione della proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) mentre gli altri non sono. Espressione di EGFP è guidato dal tribolio Tribolium alfa-tubulina promotore26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Larva di transgenici G1 . 3 °-instar larve cui padre è stato co-iniettato con piggyBac-base di plasmidi helper e donatore come un embrione precoce. La larva d'ardore rossa sulla sinistra è positiva per l'espressione DsRed, mentre la larva sulla destra non è. DsRed espressione è guidato dalla scossa di Drosophila melanogaster calore 70 promotore28. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Esperimento | Trattamento | Uova | Covato | Tasso di tratteggio |
| Exp. #1 | ΑtubEGFP-donatore | 910 | 57 | 6,3% |
| Exp. #2 | hsp70DsRed-donatore | 1580 | 211 | 13,4% |
| Exp. #3 | 3xP3EGFP-donatore | 1450 | 389 | 26,8% |
| Buffer | 485 | 148 | 30,5% | |
| No-iniezione | 470 | 250 | 53,2% |
Tabella 1: dati di Microinjection. A partire da tre esperimenti di microiniezione sugli embrioni WCR, mostrando il numero totale di uova iniettato, il numero totale delle larve che correttamente covate e il tasso di tratteggio si schiudono.
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Discussion
Anche se microinjection di WCR con RNAds ai fini della RNAi è stato segnalato9, questo è il primo protocollo per stabilire le migliori pratiche per microinjecting precellular embrioni WCR, un processo critico per lo svolgimento di germline trasformazione e/o CRISPR/Cas9 genoma di editing in questa specie. Successo microiniezione di embrioni WCR è dipendente da molti fattori, come l'efficienza di trasformazione. Discussi di seguito alcune delle questioni principali stanno influenzando il risultato dell'utilizzo di questo protocollo per trasformazione di germline in questo coleottero.
Ottenere embrioni precellular
Come accennato in precedenza, DNA non attraversa le membrane cellulari che il dsRNA modo possibile. Ciò significa che è di importanza critica che DNA, mRNA, e/o proteine essere iniettato prima cellularization si verifica. Poiché il tempo di iniezione è fondamentale, era importante determinare una finestra probabile per il microinjection successo basato su quanto tempo ci vuole il nondiapausing WCR ceppo30 per completare l'embriogenesi. Questo è stato calcolato basato su studi dettagliati della tempistica della fase blastoderm sinciziale in un altro scarabeo, tribolio Tribolium. In Tribolium, cellularization si verifica ~ 8 h post Deposita uovo a 30 ° C31. Dato che ci vogliono giorni ~3.5 per Tribolium per l'embriogenesi completa a 30 ° C, cellularization avviene un decimo del modo nel processo. Poiché gli embrioni WCR prendono quasi 2 settimane per sviluppare, cellularization non può verificarsi fino a quando il secondo uovo post giorno laici. Di conseguenza, è stato presupposto che la finestra per il microinjection successo è almeno 24 h di lunga, che è utile, poiché WCR richiedono uova durante la notte per fornire una quantità sufficiente di uova per il microinjection. Mentre questo metodo è stato usato per transgenesi successo27, è ipotizzabile che i risultati potrebbero essere migliorati iniettando più giovani embrioni, purché la manipolazione di embrioni molto presto non causare loro un danno.
Concentrazione e la qualità del DNA
Non è sorprendente che la concentrazione di DNA svolge un ruolo fondamentale nella trasformazione di successo. Si è a lungo pensato che mantenendo la concentrazione finale del plasmide DNA inferiore a 1 mg/mL è stato necessario per evitare la potenziale tossicità al embrioni iniettati32. Anche se ora non è chiaro se i problemi di tossicità del passato erano dovuto il DNA stesso o invece erano il risultato di contaminanti derivanti dal processo di purificazione del plasmide, questa regola è stata fermamente rispettate per due decenni. Tuttavia, abbiamo recentemente scoperto che superiore a 1 mg/mL limite era non solo possibile, ma anche che in questo modo può ottenere maggiore velocità di trasformazione, che porta alla speculazione che l'assenza di tossicità dell'uovo può essere dovuto gli avanzamenti in kit di purificazione del plasmide, con conseguente meno contaminanti. Dato il tempo necessario per posteriore WCR, qualsiasi aumento nei tassi di trasformazione è utile, anche se il risultato è leggermente più alti tassi di mortalità.
Addolcimento superficie dell'uovo prima di microiniezione
A differenza di Tribolium, la superficie più esterno (corion) di un embrione WCR deve essere ammorbidita prima microiniezione. Questo è un passo fondamentale anche quando si utilizzano aghi di quarzo. Idealmente, acqua dovrebbe essere applicato a un singolo embrione immediatamente prima dell'iniezione, ma può essere applicato a gruppi di 2 o 3 embrioni alla volta se microiniezione può essere realizzato prima di chorions reharden. Senza questo passaggio, aghi generalmente riuscirà a penetrare il corion, causando quindi il tentativo di iniezione a fallire e potenzialmente danneggiare la punta dell'ago. Inoltre, se l'ago dovesse penetrare con successo un corion asciutto, la soluzione per iniezione in genere perdite indietro fuori a causa della pressione all'interno dell'embrione sono superiori a pressione ambiente. È, tuttavia, facile distinguere asciutto da embrioni (ammorbiditi) bagnati. In particolare, quando è asciutto, gli embrioni hanno un distinto rigida, forma rotonda, mentre l'aggiunta di acqua li induce a perdere il loro aspetto sferico. Rammollimento non solo permette l'ago penetrare senza fatica il corion, ma riduce anche la pressione all'interno dell'embrione abbastanza che la soluzione di iniezione non fuoriuscire.
Umidità e muffa
Embrioni iniettati si svolgono in un ambiente caldo, umido durante l'embriogenesi. Queste condizioni non solo offrono l'ambiente ideale per lo sviluppo WCR, ma anche promuovono lo sviluppo della muffa. Durante questo periodo di due settimane, la muffa si sviluppa frequentemente sui piatti agar alloggiamento gli embrioni WCR. Purtroppo, gli embrioni richiedono elevata umidità e tentativi di ridurlo provocato tassi molto più bassi di tratteggio. È interessante notare che, la presenza di muffa generalmente ebbe poco impatto sulla schiusa, con la maggior parte degli embrioni da cova senza problemi. Inoltre, trattamenti antifungini sono dannosi per gli embrioni WCR, quindi il modo migliore per ridurre la crescita di muffa sembra essere quella di evitare la contaminazione; pulizia strumenti, contenitori e sistema di microiniezione prima dell'uso e cercando di mantenere il tempo trascorso microinjecting al minimo, dal momento che le spore della muffa sono prevalenti in molti ambienti di laboratorio.
Conclusioni
Questo protocollo è destinato a permettere ai ricercatori più impiegare tecnologie transgeniche nella loro ricerca WCR e speriamo che sarà di aiuto nello sviluppo di tecnologie basate su transgenetica aggiuntive per l'utilizzo in questo insetto. Sofisticati basati su transgenetica esperimenti condotti in Tribolium potrebbero potenzialmente essere adattati per WCR, tra cui mutagenesi33 e basati su CRISPR genoma34di editing. Poiché queste tecniche richiedono la microiniezione degli embrioni precellular, questo protocollo sarà utile non solo per studi di genomica funzionale basato su trasposoni e/o CRISPR/Cas9-mediata del genoma modifica ma anche per strategie di lotta basata su genetica 35 , 36.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del programma di ricerca di Monsanto mais Diabrotica conoscenza, assegnare un numero AG/1005 (a MDL e YC) e fondi di Start-up per MDL dal NCSU. FC è stata sostenuta da sovvenzioni da parte mais Diabrotica Knowledge Research Program di Monsanto (AG/1005) e la National Science Foundation, concedere numero MCB-1244772 (MDL). Gli autori non dichiarano interessi concorrenti. FC e MDL ideato e progettato gli esperimenti; FC, PW e SP effettuati gli esperimenti; FC e MDL ha analizzato i risultati; e FC, NG e MDL ha scritto il manoscritto. Ringraziamo Teresa O'Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski per loro assistenza di esperti in selezione WCR. Ringraziamo anche il dottor Wade French (USDA-ARS, laboratorio di ricerca agricola Centrale Nord, Brookings, SD) per le spedizioni di uova di stabilire colonie di laboratorio e fornendo protocolli di allevamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
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