Summary
Här presenterar vi protokoll för att samla och microinjecting precellular västra havren rootworm embryon i syfte att utföra funktionella-genomiska analyser såsom könsceller omvandling och CRISPR/Cas9-gen editering.
Abstract
Den västra havren rootworm (VCT) är en viktig skadegörare på majs och är välkänt för sin förmåga att snabbt anpassa sig till pest förvaltningsstrategier. RNA-interferens (RNAi) har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att studera WCR biologi, har men sina begränsningar. Specifikt, RNAi själv är övergående (dvs inte resulterar i långsiktiga Mendelian arv av den associera fenotypen), och det kräver att veta DNA sekvensen av målgenen. Det senare kan vara begränsande om fenotypen av intresse styrs av dåligt bevarade, eller ens nya gener, eftersom att identifiera användbara mål skulle vara en utmaning, om inte omöjligt. Därför bör antalet verktyg i WCRS genomisk verktygslåda utökas genom utveckling av metoder som kan användas för att skapa stabila mutant stammar och aktivera sekvens-oberoende undersökningar av WCR genomet. Häri, detalj vi de metoder som används för att samla och microinject precellular WCR embryon med nukleinsyror. Medan de protokoll som beskrivs häri syftar till skapandet av transgena WCR, kunde CRISPR/Cas9-gen editering också utföras med samma protokoll, med den enda skillnaden är sammansättningen av lösningen injiceras i embryon.
Introduction
Den västra havren rootworm (VCT), Diabrotica virgifera virgifera, är en viktig skadegörare på majs1. Intressant, WCR visas att övervinna kontroll mäter snabbare än mest jordbruks skadedjur eftersom de inte bara anpassa sig fysiologiskt men också behaviorally2,3,4,5, 6. under det senaste årtiondet, RNA-interferens (RNAi), ett kraftfullt funktionella genomisk verktyg, har undersökts som en potentiell kontrollmetod för WCR7,8, och har också använts som ett sätt för att studera gen funktion9. Men medan RNAi utförs ofta av Mikroskop av dubbelsträngat RNA (dsRNA) i andra arter, är injektion-baserade RNAi sällsynt i WCR. I själva verket finns det endast ett fåtal rapporter av RNAi via Mikroskop av dsRNA till WCR9. Anledningen är att WCR kan uppnå hög-nivåer av genen knockdown via intag av dsRNA7,10, även tillåter studier av embryonala effekter av utfodring dsRNA mor11. Även denna metod gör WCR ett utmärkt ämne för funktionell genomanalys via RNAi, har det avtagit framsteg i utvecklingen av metoder för embryonala Mikroskop hos denna art.
Trots kraften av RNAi finns det några nackdelar. Till exempel svara inte alla gener lika på RNAi. Denna variation kan göra tolkningen av resultaten av en funktionell genomik assay svårare. Även RNAi är övergående och genererar inte ärftliga mutationer. Däremot, kan könsceller omvandling, en annan funktionell genomisk redskap, generera ärftliga mutationer via införandet av ett markerat överförbara element i genomet12,13. Detta gör könsceller omvandling ett utmärkt verktyg för att skapa mutant stammar för användning i långsiktiga genetiska studier. Omvandling kan också användas för att rädda en mutation genom att leverera en fungerande kopia av genen till en mutant genomet14. Dessutom är könsceller omvandling hörnstenen i en mängd olika molekylära genetiska tekniker. Förutom att slå ut eller undsättning geners funktion, kan könsceller omvandling användas för enhancer svällning15, gen svällning16, Gal4-baserade ektopisk uttryck17och genome-wide mutagenes18.
Mer nyligen, verktyg som möjliggör avancerad editering har utvecklats. Dessa verktyg inkluderar transkription Activator-Like effektor nukleaser (TALEN) och CRISPR/Cas9-nuclease system19,20. Fördelen med dessa nya verktyg är att de erbjuder forskare förmågan att inducera en dubbelsträngat DNA paus på nästan vilken plats som helst inom nästan alla genomet. När inducerad, dessa pauser kan repareras genom icke-homolog ände att gå, som kan presentera borttagningar eller infogningar i riktade genen, eller genom homologi-regisserad reparation, som i närvaro av en konstruerad konstruktion, kan katalysera den byte av hela gener eller genetiska regioner21,22. Dessa metoder kräver dock Mikroskop av DNA, RNA och/eller protein i mycket unga embryon.
Enkelt ännu viktigare, till skillnad från den dsRNAs som används för RNAi, nukleinsyror och proteiner som används för könsceller omvandling och editering inte kan passera cellmembran. Mikroskop för kontrollplasmid-DNA, mRNA eller proteiner måste därför äga rum under syncytial blastoderm scenen (dvs innan insekten embryot cellularizes). Detta gör tidpunkten för injektioner en kritisk faktor. Till exempel i Drosophila melanogastermåste embryon injiceras inom två timmar efter ägg lekmanna-12. Därför måste utvecklingen av en framgångsrik embryonal Mikroskop protokoll för WCR beakta de bästa förutsättningarna för kvinnliga äggläggning, samt den bästa metoden för att samla in tillräckliga mängder precellular embryon.
Ett försök att få ett brett utbud av molekylära genetiska verktyg på WCR biologi kräver utveckla metoder för att samla och microinjecting precellular WCR embryon. Här tillhandahåller vi detaljerade instruktioner, tillsammans med tips och tricks, hjälpa andra att använda transformation-baserade tekniker på WCR forskning. Förutom att utvidga transgena tekniker till WCR för användning i funktionella genetiska studier, aktivera dessa tekniker även kraftfulla nya pest control strategier såsom gen enhet23,24 ska testas i denna ekonomiskt viktiga Pest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. koloni-nivå uppfödning av WCR vuxna
- Få en tillräcklig mängd WCR vuxna (500-1000) från ett pålitligt företag eller forskning laboratorium (se Tabell av material för ett exempel) och placera i en 30 cm3 bur.
Obs: Användning av en icke-diapausing stam rekommenderas. - Förbereda WCR artificiell diet efter tillverkarens protokollet och häll ett 1 cm tjockt lager i en 38 oz behållare (se Tabell för material). Efter blandning, Förvara oanvända kost vid 4 ° C i upp till 2 månader.
- Sätta en petriskål (100 x 15 mm) med vuxen diet (10-15 g) i en 30 cm3 bur. Lägg till mer kost när maten är låg eller torrt.
- Sätta en kolv (300 mL) med vatten, täckt med en bomullstuss, som används för att hålla på plats en bomull rulle (6 ”x 3/8”), att tjäna som en vattentäkt. Byt vatten när det börjar ta slut.
- Upprätthålla WCR vid 26 ° C med 60% luftfuktighet och en 14:10 ljus cykel i en insekt uppfödning inkubator.
2. embryosamlingsgrupper och justering
- Gör en ägg uppsamlingskammaren med 1% agar i vatten i en steril 100 x 15 mm2 petriskål. Förvara vid 4 ° C efter agar stelnar.
- Samla in nyligen lagda ägg, placera ett enda lager av filterpapper, följt av 4 lager av cheesecloth (varje snitt till storlek) på ytan av agar (figur 1A).
Obs: Cheesecloth kan återanvändas, efter att ha tvättat i blekmedel och autoklaveras, men det är inte nödvändigt göra detta för den första användningen. Filter papper bör inte återanvändas och behöver inte steriliseras. - Placera ägget samling plattan in WCR buren så sent på dagen som möjligt (slutet av arbetsdagen) och täck med aluminiumfolie tält. Lämna över natten.
Obs: Med lamporna om från klockan 10 till klockan 12 (14 h) förseningar äggläggning, därigenom underlätta insamling av yngre ägg för Mikroskop utan lab personal att placera uppsamlingskammaren i bur sent på natten. - Ta bort ägg uppsamlingskammaren omkring 8 eller 9 A.M.
- Använd pincett för att plocka upp 1 lager cheesecloth i taget och placera i en bägare (500 mL) vatten. Tvätta ägg bort av cheesecloth av försiktigt under omrörning (figur 1B och 1 C).
- Använda en glödlampa pipett för att överföra ägg till en annan bägare (500 mL) vatten. Upprepa 2-3 x för att rengöra äggen.
- Använda glödlampa pipetten för att överföra ägg på filterpapper (figur 1 d) samtidigt minimera mängden vatten överföring.
- Strimlat svart filterpapper så bred som en glasskiva och tejpen ordentligt i bilden att se till att ligger papperet Plant (figur 2A).
Obs: Svart filterpapper hjälper förbättra sikten under luppen genom att minska mängden reflekterat ljus. - Tillämpa icke-giftiga lim (se Tabell av material för ett exempel) att pappersfiltret fina linjer (figur 2B). Hålla de lim linjerna tunnare än diametern av ett ägg att undvika att få äggen belagd i limmet.
- Använd en fin pensel att försiktigt flytta WCR ägg ett i taget från deras filterpapper till lim linje. Försök att lägga äggen på lim innan det torkar och hålla minst en äggets avstånd mellan varje ägg.
- Maximera injektion effektivitet genom att placera flera rader med ägg på ett filterpapper bild (figur 3).
- Efter alla ägg läggs på filterpapperet, vänta tills alla limmet torkar innan Mikroskop.
Obs: För könsceller omvandling och för CRISPR/Cas9-medierad genomet redigering, injicera alla embryon vid lunchtid (12 P.M.) så att det äldsta embryot är inte mer än 19 h gammal. Dock för RNAi finns det ingen tidsbegränsning eftersom, WCR, dsRNA kan flytta mellan celler. I själva verket för RNAi, kan åldrande embryon resultera i bättre överlevnad.
3. beredning av kontrollplasmid-DNA och injektionsnålar
- Förbereda högkvalitativa supercoiled plasmid DNA använder en endotoxinfria kommersiella kit (se Tabell av material för ett exempel).
- För att bereda injektionslösningen, kontrollera koncentrationen av varje plasmid och sedan kombinera helper plasmid (250 ng/µL slutlig koncentration), donator plasmid (750 ng/µL slutlig koncentration) och fenolrött buffert (20% slutlig koncentration). Vortex lösningen kort och Centrifugera under 3 minuter på högsta hastighet till fällning partiklar som kan täppa till nålen.
- Dra borosilikatglas nålar (ytterdiameter 1 mm, I.D. 0,58 mm, 10 cm längd) med hjälp av flammande/brun typ mikropipett avdragare. För lagring, säker drog nålar på dubbelhäftande tejp i en petriskål eller andra tydliga behållare.
Obs: För mikropipett avdragare systemet, de inställningar som användes var: värme = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Återfyllning injektionsnålen med hjälp av en mikro-loader spets (se Tabell för material) att Pipettera 0,5 - 1,0 µL ner inuti nålen, avsmalnande i slutet. Ta bort bubblor från spetsen på nålen om något inträffar.
- In injektionsnålen i nålen hållaren.
- Öppna spetsen på nålen genom att försiktigt bryta med ett fint par pincett, eller försiktigt röra/dra spetsen på täckglas eller glas bilden.
Obs: Målet är att ha den minsta öppning som fortfarande tillåter injektion mixen att komma ut (mindre öppningar kräver i allmänhet högre insprutningstryck). Avfasade nålar kräver inte detta steg eftersom de redan är öppen.
4. Mikroskop och efter injektion vård
- Med hjälp av en fin pensel, noggrant våta ytan av 1-3 ägg med sterilt vatten, in nålen och injicera lösningen. Injicera varje ägg innan ytan torkar. Leta efter utseendet en liten mängd av röd färg inuti äggen under injektion för att indikera den framgångsrika Mikroskop. Krossa eller ta bort alla ägg som ser skadat, tom, eller annars inte kan injiceras.
Obs: Även om insprutningstryck varierar beroende på nålen bore storlek, 10-13 psi är en bra utgångspunkt. - Efter alla ägg injiceras, papperet filter från glasskiva.
- Placera filterpappret på ytan av en 1% agar maträtt (beskrivs ovan).
- Använda plast paraffin film att försegla skålen, och sätta i en 26 ° C insekt uppfödning inkubator för 12 dagar.
Obs: Paraffin filma kommer att förhindra korskontaminering av mögel mellan rätter. Någon annan behandling att förebygga mögel och bakterietillväxt kan dock minska överlevnaden av de injicerade embryona.
5. odling och kläckning av embryon
- Börja kontrollera embryon 12 dagar efter injektionen för nyligen kläckta larver och fortsätta dagligen för de kommande 2 veckorna.
- Överföra larver, med en fin pensel, att en uppfödning låda med grodda majs och jord.
Obs: Mögel kan växa i agar skålen, men larverna kläcks fortfarande i de flesta fall. Leta efter larver noggrant inom mögel att fånga dem alla. Vissa larver kan flytta till locket på skålen och kan fastna i kondens. - Bakre larver vid 26 ° C efter standard WCR uppfödning metoder25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En viktig faktor vid utveckling av detta protokoll var det embryonala utvecklingsstadiet vid tiden för Mikroskop. Könsceller omvandling kräver specifikt, Mikroskop av DNAs före embryonala cellularization. Detta beror på att DNAs inte kan enkelt passera cellmembran. Försök att visualisera stadierna av WCR embryonala utvecklingen med en kärnvapen fläck var misslyckat eftersom dechorionation av WCR embryon i huvudsak upplöser alla de skyddande membran som är ansvarig för integriteten hos embryot. Dock var denna linje av enkäten ersatts av en annan svårighet – förvärva tillräckliga mängder embryon i tid. I fältet WCR honorna lägger sina ägg i jorden, alltså bör det ingen överraskning att honorna i labbet, endast lägger ägg i mörkret. Detta försvårar kort dagtid samlingar (2-4 h). För att lösa problemet, en enda övernattning ägg lay utfördes och konstaterades för att ge stora mängder embryon. Även om processen för att samla in (figur 1) och lägga ut (figur 2) embryon för Mikroskop är något mödosamma, om gjort snabbt möjliggör detta protokoll Mikroskop av embryon som är mellan 2-19 h gammal vid tiden för injektion och nr äldre än 24 h om injektioner utförs senare under dagen. Jämförelse av utvecklingen gånger mellan WCR och andra arter antyder att WCR embryon fortfarande precellular på 24 h inlägget lägga ägg (se diskussion).
De första försöken på könsceller omvandling av WCR involverade samtidig injektion (figur 3) av helper (transposase källa) och givare (transposon) plasmider in precellular embryon. Den omvandling markören för givare plasmiden var en grönt fluorescerande protein (andra) gen drivs av en konstitutivt aktiv promotorn från Tribolium castaneum (alpha-tubulin arrangören26). Embryonala överlevnaden var låg (tabell 1), men 26 G0 vuxna återvanns. För att avgöra om givaren elementet infogas i någon könsceller, G1 embryon som screenades för andra uttryck. Även om fluorescerande avkomma identifierades faktiskt (figur 4), screening WCR embryon med intensiva ljuskällan visat sig vara dödliga27. Nästa omgång av könsceller omvandling utnyttjas en ny givare plasmid, en som har en röd fluorescerande protein (DsRed) gen drivs av en konstitutivt aktiv promotorn från Drosophila melanogaster (heat shock protein 70 arrangören28 ). Medan överlevnaden var mycket bättre (tabell 1), produceras de överlevande vuxna bara en enda DsRed-positiv larv (figur 5). Dessa experiment var dock särskilt informativ i två avseenden. Först, det upptäcktes att Mikroskop orsakade förseningar i utvecklingen, vilket resulterar i en längre tid-till-lucka. Snarare än alla embryon kläckning inom 2 veckor, injicerade embryon kläckts mellan 12 och 26 dagar post Mikroskop, vilket kräver en längre övervakning tid att säkerställa att alla ungarna samlades. För det andra, det märktes att nyligen kläckta larverna var ganska aktiv. De kröp på locket där de skulle få fastnat och ibland rymt från agar skålen. Dessa frågor kunde övervinnas genom tätning petriskålar med en paraffin film och undersöka lock och agar noggrant om ungarna.
Den slutliga versionen av detta injektion protokoll testades av microinjecting WCR embryon med buffert ensam eller med helper och öga-promotor (3xP329) märkt givare DNA plasmider. Som en ytterligare kontroll, en annan uppsättning av embryon sköttes identiskt men var inte microinjected. Fyra uppsättningar av embryon injicerades med antingen injektionslösning. Totalt 485 embryon injicerades med buffert och av dessa, 148 kläckts (hatch rate = 30,5%, tabell 1). 1,450 embryon injiceras med plasmid DNAs, 289 kläckts (rate = 26,8%). Intressant, av de 470 embryon som genomgick samma ägg-hantering förhållanden, men utan Mikroskop, endast 250 kläckts (rate = 53,2%). Att överlevnaden av uninjected embryon är 20% högre än överlevnaden för injicerade embryon förväntas kan på grund av oundvikliga skador som orsakats av Mikroskop. Dock liten skillnad ses mellan buffert injektering och DNA, vilket tyder på mängden DNA läggs är godtagbart för WCR (se diskussion). Dessa resultat visar också att överlevnaden förbättrats under tidigare insatser. Framgångsrik etablering av transgena linjerna med hjälp av denna metod har varit rapporterade någon annanstans27.
Figur 1: insamling av ägg. (A) ägg uppsamlingskammaren. B) zoomad-i syn på ett avsnitt av en ägg kammare efter 24-h ägg låg. Observera att pilarna anger platsen för några ägg. C) tvätta ägg av cheesecloth. D) den slutliga överföringen av WCR ägg. Obs, klammern anger regionen med tätt packade WCR embryon (dvs minimal vatten). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: förbereder en injektion bild. (A) svart filterpapper tejpade tätt ett standard objektglas. B) zoomad-i syn på ett avsnitt av en injektion Skjut under förberedelseprocessen. Obs, pil #1 anger platsen för en rad av ägg, #2 partiell linje av lim och #3 pin används för att sprida limmet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: injicera embryon. En injektion vattenrutschkana med åtta rader av ägg. På grund av vinkeln på injektionsnålen, kan på varandra följande rader av embryon injiceras genom att helt enkelt flytta scenen. Observera den röda färgen i injektionsnålen hjälpmedel kraftigt visualisering av injektionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Transgena G1 embryo. Embryon från en WCR vuxen som var samtidig injiceras med piggyBac-baserad helper och givare plasmider som ett tidigt embryo. Ljusa gröna embryot är positivt för förbättrad grönt fluorescerande protein (andra) uttryck medan andra inte. ANDRA uttryck drivs av den Tribolium castaneum alpha-tubulin arrangör26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Transgena G1 larv. 3rd-instar larver vars förälder var samtidig injiceras med piggyBac-baserad helper och givare plasmider som ett tidigt embryo. Röda glödande larven till vänster är positivt för DsRed uttryck, medan larven till höger inte är. DsRed uttryck är driven av i Drosophila melanogaster värme chock 70 arrangören28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Experiment | Behandling | Ägg | Kläckts | Hatch Rate |
| EXP. #1 | ΑtubEGFP-givare | 910 | 57 | 6,3% |
| EXP. #2 | hsp70DsRed-givare | 1580 | 211 | 13,4% |
| EXP. #3 | 3xP3EGFP-givare | 1450 | 389 | 26,8% |
| Buffert | 485 | 148 | 30,5% | |
| Nr-injektion | 470 | 250 | 53,2% |
Tabell 1: Mikroskop data. Kläcks priser från tre Mikroskop experiment på WCR embryon, visar det totala antalet ägg injiceras, det totala antalet larver som framgångsrikt kläckts och andelen hatch.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fastän Mikroskop av WCR med dsRNAs i syfte att RNAi har varit rapporterade9, detta är det första protokollet att fastställa bästa praxis för microinjecting precellular WCR embryon, en kritisk process för att genomföra könsceller omvandling och/eller CRISPR/Cas9 genomet redigering i denna art. Framgångsrika Mikroskop WCR embryon är beroende av många faktorer, liksom omvandling effektivitet. Diskuteras nedan är några av de stora frågorna påverkar resultatet av användning av detta protokoll för könsceller omvandling i denna skalbagge.
Att erhålla precellular embryon
Som nämnts ovan, korsar DNA inte cellmembran de sätt dsRNA kan. Detta innebär att det är av avgörande betydelse att DNA, mRNA eller proteiner injiceras innan cellularization sker. Eftersom tidpunkten för injektion är kritiska, var det viktigt att fastställa ett sannolikt fönster för framgångsrika Mikroskop baserat på hur lång tid det tar de nondiapausing WCR stam30 att slutföra embryogenes. Detta har beräknats baserat på detaljerade studier av tidpunkten för syncytial blastoderm scenen i en annan skalbagge, Tribolium castaneum. Cellularization uppstår i Tribolium, ~ 8 h post ägg lay vid 30 ° C31. Eftersom det tar ~3.5 dagar för Tribolium komplett embryogenes vid 30 ° C, rum cellularization äger en tiondel av vägen in i processen. Eftersom WCR embryon ta nästan 2 veckor att utveckla, uppstår cellularization kanske inte förrän andra dagen inlägg ägget låg. Det antogs därför att fönstret för framgångsrika Mikroskop är minst 24 h lång, vilket är praktiskt, eftersom WCR kräver övernattning ägg om för att ge tillräckliga mängder ägg för Mikroskop. Även denna metod användes för framgångsrika genmodifiering27, är det tänkbart att resultaten kan förbättras genom att injicera yngre embryon, förutsatt hantering mycket tidiga embryon inte orsaka dem skada.
DNA kvalitet och koncentration
Det är inte förvånande att DNA-koncentration spelar en nyckelroll i framgångsrik omvandling. Det har länge tänkt att hålla den slutliga koncentrationen av plasmid DNA under 1 mg/mL var nödvändig för att undvika potentiell toxicitet för den injicerade embryon32. Även om det är nu oklart om de toxicitet av tidigare berodde på DNA själv eller var istället resultatet av föroreningar som förts över från plasmiden reningsprocessen, denna tumregel har orubbligt följts under två decennier. Dock nyligen upptäckte vi att överstiger 1 mg/mL gräns var inte bara möjligt utan också att göra så kan uppnå högre omvandling priser, vilket leder till spekulationer om att avsaknad av ägg toxicitet kan bero på framsteg i plasmiden rening kit, vilket resulterar i färre föroreningar. Tanke på den tid som krävs för att bakre WCR, är någon ökning av omvandling priser bra, även om det resulterar i något högre dödlighet.
Mjukgörande ägg yta innan Mikroskop
Till skillnad från Tribolium, måste yttersta ytan (chorion) av ett WCR embryo mjukas upp innan Mikroskop. Detta är ett kritiskt steg även när du använder quartz nålar. Helst vatten bör tillämpas på ett enda embryo omedelbart före injektion, men kan tillämpas på grupper av 2 till 3 embryon i taget om Mikroskop kan ske innan chorions reharden. Utan detta steg misslyckas nålar i allmänhet att penetrera chorion, därigenom orsakar injektion försöket misslyckas och potentiellt skadliga spetsen på nålen. Dessutom om nålen råkar framgångsrikt penetrera en torr chorion, läcker injektionslösningen normalt tillbaka ut på grund av trycket inuti embryot blir högre än omgivande pressar. Det är dock lätt att skilja torr från våt (mjukt) embryon. I synnerhet när det är torrt, embryon har en distinkt styv, rund form, medan tillägg av vatten orsakar dem att förlora deras sfäriskt utseende. Mjukgörande inte bara tillåter att nålen lätt tränga in chorion men också minskar trycket inuti embryot nog som injektionslösningen inte läcker ut.
Fukt och mögel
Injicerade embryon hålls i en varm, fuktig miljö under hela embryogenes. Dessa villkor inte bara ger den perfekta miljön för WCR utveckling men också främja tillväxten av mögel. Under denna två-veckors period växer mögel ofta på agar rätter bostäder WCR embryon. Tyvärr embryon kräver hög luftfuktighet, och försök att minska det resulterade i mycket lägre hatch priser. Intressant, hade förekomsten av mögel generellt liten inverkan på hatch priser, med de flesta embryon kläckning utan problem. Dessutom är antimykotisk behandlingar skadliga för WCR embryon, så det bästa sättet att minska mögeltillväxt verkar vara att undvika kontaminering; rengöring verktyg, behållare och Mikroskop system före användning, och försöker hålla den tid microinjecting till ett minimum eftersom mögelsporer är utbredd i många laboratoriemiljöer.
Slutsatser
Detta protokoll syftar till att aktivera fler forskare att anställa transgena tekniker i sin WCR forskning och förhoppningsvis kommer stöd i utvecklingen av ytterligare transgenics-baserad teknik för användning i denna insekt. Sofistikerade transgenics-baserade experiment som utförs i Tribolium kunde potentiellt anpassas för WCR, inklusive mutagenes33 och CRISPR-baserade genomet redigering34. Eftersom dessa tekniker kräver Mikroskop precellular embryon, kommer att detta protokoll vara användbara inte bara för transposon-baserade funktionella genomisk studier och/eller CRISPR/Cas9-medierad gen editering men också för genetik-baserade pest förvaltningsstrategier 35 , 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett bidrag från Monsanto havren Rootworm kunskap forskningsprogrammet, bevilja nummer AG/1005 (till MDL och YC) och nystartade fonder till MDL från NCSU. FC stöddes av bidrag från Monsanto havren Rootworm kunskap forskningsprogram (AG/1005) och National Science Foundation, bevilja nummer MCB-1244772 (MDL). Författarna förklarar inget konkurrerande intressen. FC och MDL avlad och utformade experiment; FC, PW och SP utfört experimenten; FC och MDL analyseras resultaten. och FC, NG och MDL skrev manuskriptet. Vi tackar Teresa O'Leary, William Klobasa och Stephanie Gorski för deras experthjälp i screening WCR. Vi tackar också Dr. Wade French (USDA-ARS, North Central jordbruks Research Laboratory, Brookings, SD) för transporter av ägg att fastställa lab kolonier och tillhandahålla uppfödning protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).
- Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
- Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
- Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
- Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
- Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
- Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
- Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162 (2010).
- Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
- Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
- Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
- Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
- O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
- Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Jeggo, P. A.
- Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
- Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
- Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
- Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
- Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
- Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
- Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
- Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
- Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11 (2007).
- Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).
