Summary
プロトコルの目的は、コンシス テント ・ フラクチャをもたらす破壊生成パラメーターを最適化することです。このプロトコルは、ボーンのサイズと動物間に存在する形態の変化を占めています。さらに、コスト効率の高い、調節可能な破壊装置を説明します。
Abstract
動物モデルにおける一貫性のある安定した骨折の信頼性の高い世代は、骨再生の生物学を理解し、治療とデバイス開発に不可欠です。ただし、利用可能な傷害モデルは無駄な動物とリソースや不完全なデータの不整合が悩まされています。この破壊の不均一性の問題に対処するため記載法の目的は、それぞれの動物に固有の破壊生成パラメーターを最適化し、コンシス テント ・ フラクチャの場所とパターンを生成します。このプロトコルは、ボーンのサイズとマウス系統間に存在可能性があります、ラットなど他の種でコンシス テント ・ フラクチャを生成する合わせることができる形態の変化を占めています。さらに、コスト効率の高い、調節可能な破壊装置を説明します。現在の安定した破砕技術と比較して、最適化のプロトコルと新しい破壊装置安定破壊パターンと位置整合性の向上を示しています。閉じた破壊発生手順において通常破壊の不均一性を最小限に抑え、誘導のトラウマの精度は説明プロトコル増加サンプル タイプに固有のパラメーターを使用して最適化。
Introduction
骨折治癒の研究大臨床と経済問題に対処する必要があります。毎年以上 1200 万骨折はアメリカ合衆国1, 原価計算 $ 800 億年2あたりで扱われます。男性または女性の苦しみの一生に破壊する可能性は 25%、44%、それぞれ3。骨折治癒に関連する問題は人口年齢として増加併存疾患とともに増加する期待されます。勉強してこの問題に対処するには、堅牢なモデル破壊発生と安定化が必要です。齧歯動物モデルは、この目的に最適です。彼らは臨床的に意味を提供し、アドレス特定の条件 (すなわち、複数けが、オープン、クローズ、虚血、感染骨折) を変更することができます。臨床シナリオの他、動物破壊モデルは骨の生物学の治療とデバイスの開発を理解することにとって重要です。しかし、介入の違いを勉強しよう矛盾破壊発生によって導入された変動によって複雑になる可能性があります。したがって、動物モデルでの再現性と一貫して閉じた割れ目を生成する筋骨格系の研究分野に不可欠です。
正しく適切な遺伝的背景、性別、年齢、および環境条件を確保することによって潜在的な主題の不均一性の制御、にもかかわらず臨床的に関連する一貫性のある骨の傷害の生産は重要な変数に影響を与える再現性であり、制御する必要があります。一貫性のない骨折を使用して統計の比較実験の騒音と高変動4; 悩まされていますさらに、破壊の可変性は、サンプル サイズや粉砕または挿骨折で安楽死する必要性を向上させる必要があるのため不必要な動物の死につながります。記載法の目的は、サンプル タイプに固有の破壊生成パラメーターを最適化することで、コンシス テント ・ フラクチャの場所とパターンをもたらします。
破壊発生の現在のモデルは、それぞれ独自の長所と短所を持つ 2 つの広範なカテゴリに分類されます。開放骨折 (骨切り術) モデルは、その後骨折が骨を切断または弱くなり、その後、手動でそれを壊す5,6,7,8によって誘導される骨を公開する手術を受けます。このメソッドの利点は、骨折部位とより一貫性のある破壊位置とパターンの直接可視化です。しかし、アプローチの生理学的および臨床関連性と損傷の発生メカニズムは、限定されます。また、外科的アプローチと汚染のリスクにさらされている齧歯動物で長時間の閉鎖破壊発生の open メソッドが必要です。
閉じた技術オープン技術の制限の多くに対処します。閉じた技術を骨折骨や周囲の組織は、人間の臨床的傷害で見られるそれらに類似の損傷を誘導する外部から鈍力外傷を使用して生成します。最も一般的な方法は、1984年9Bonnarens とアインによって記述されていた。彼らは、任意の外部の皮膚の傷を引き起こすことがなく、骨を破壊する鈍的外傷を与えるために使用されている加重ギロチンをについて説明します。このメソッドは、遺伝学10,11, 薬物療法12,13,14,15, 力学16,の効果を研究に広く採用されている17、生理18,19,20癒しのマウスおよびラットの骨。閉じたメソッドの利点は、生理学的に関連する骨折は、実験の再現性と厳しさが破壊の不均一性によって制限されます。一貫性のない破壊の発生は、限られたグループ間の差別化、失われた標本、統計的有意性を達成するために必要な動物の増加の結果します。
破壊発生と安定化の変動を制御することは、意味のある結果を生成する不可欠です。正しく破壊修理の生物学を勉強、するためにシンプルで確実な破壊のモデルが必要です。モデル変数マウスの遺伝的背景の齧歯動物種、骨型 (大腿骨または脛骨、たとえば) に翻訳する必要があります、突然変異を誘発しました。さらに、理想的な手順は技術的に単純な一貫性のある結果を生みます。アドレス破壊の不均一性に記載メソッドはパラメーターを最適化し、年齢、性別、および遺伝子型に関係なく一貫して閉じた割れ目を生成するために使用することができます制御された破壊装置の建設。
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Protocol
このプロトコルは、動物が不必要は使用されず、すべての不必要な苦痛および苦脳; を免れていることを確保するため開発されました。それはすべての連邦、州、地方及び制度の法令と動物の研究を支配するガイドラインに準拠しています。プロトコルは、全学研究室実験動物医学專門動物医学プログラムの獣医師によって監督の指導の下で開発されました。プロトコルが見直され、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されました。
1. 破壊タワー建設
注: すべての部分は、材料 (材料表) に記載されています。詳細な技術的な図面は、補足図 1-12で加工、3 D プリント パーツを提供しています。サブアセンブリの図面は、すべてマウントされた部分 (補足数字 1 2、7、および9) のファスナー詳細します。
-
サブアセンブリをサポートします。
注: サポート サブアセンブリの図面、補足の図 1を参照してください。- ビーム支援 ― 水平断面の中間点でビーム サポート--顎セクションを接続します。
- ビーム支援 ― 顎セクション、梁サポート - 水平方向のセクションからの 2 の上面にビーム サポート - 垂直 1を取り付けます。
- (端からの 7) の中間点に水平断面梁サポートの上面にビーム サポート - 垂直 2を接続します。
- ビーム、サポート プレートのマウントをビーム サポート - 垂直 1のビーム サポート - 垂直 2端に取り付けます。プレート サポート終了はビームをサポート - 垂直 2のバックにフラッシュする必要があります。
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Ram サブアセンブリ
注: ram サブアセンブリの図面、補足図 2を参照してください。- マシンのブロックを停止するとブロック ガイド(補足図 3);ロッド ラム(補足図 4)。ネジ整列(補足図 5);プレートをマウント(補足図 6)。
- ビーム支援プレート マウントサポート サブアセンブリにプレートのマウントを取り付けます。
- 次の順序でスライド、最初直線スリーブ軸受;ブロック ガイド;第 2線形スリーブ軸受;ブロックを停止棒の Ram。ガイドとブロックをプレート マウントに取り付けます。
- ロッド ラムのねじ部に 3 つの ⅜ のナットを取り付けます。1 つは電磁石で従事するロッドの端と同じ高さにする必要があります。他の 2 は、破壊の深さを調整する使用されます。
- 前方に直面し、ブロック ガイドのネジ穴に位置合わせネジを挿入するロッド ラムにグローブを合わせます。
-
磁石サブアセンブリ
注: 磁石サブアセンブリの図面、補足の図 7を参照してください。- はんだワイヤーにつながる電磁石(極性は電磁石の操作のための要因ではない)。破壊装置の位置、床に達するため十分な長さを許可します。使用ジッパー ネクタイまたは強調する添付ファイルの別の形態は、ワイヤを和らげます。
- 電源の最後を除去し、足のペダルに接続します。最後に、「オフ」(ノーマル ・ オープン) の構成でフットペダルにワイヤを接続します。確実に電磁石のフット スイッチが押されていないときに回路をテストします。骨折する前にここ ram に格納されます。
- マウント マグネット(補足図 8Aと8B) を印刷添加剤の製造装置を使用してまたはアルミニウムから一部の機械します。
- マウント マグネットに電磁石を接続します。
- 2角かっこをビーム サポート - 磁石に添付します。
- 次の順序でスレッドの上部隅ブラケットを介してロッド磁石と追加 1 つの ¼ のナット;マウント マグネット。2 つの ¼ のナット;下部の角ブラケット。各端に 2 つの ¼ のナットを使用してアセンブリを固定します。
-
完全なアセンブリ
注: 完全なアセンブリの図面、補足の図 9を参照してください。- 磁石サブアセンブリをビーム、サポート プレート マウントの上面に接続します。
- 磁石棒、Ramとの関わり、梁サポート - 磁石の配置を調整します。
注: 足のペダルが押されたときにロッドが解放しない場合は、ビーム サポート - 磁石を動かすことによって電磁石とロッドの接触面積を減らします。 - マシン、角かっこは顎脚(補足図 10)。
- 2ブラケット脚顎をビーム サポート--顎セクションに接続します。削除、ram のチップが各顎から等しい距離にする必要があります。
- プラットフォームの破壊を配置 (補足数字 11Aと11 b) 顎の上。
- 印刷治具の位置決めの破壊(補足図 12Aと12 b) と治具ピン ゲージ(補足図 13Aと13B) 添加剤の製造装置を使用してまたは機械、アルミニウムからの部分。
注: 手順 2 で詳細な最適化の手順で治具の寸法が計算されます。 - プラットフォームの破壊に位置決めの治具破壊を取り付けます。
- ロッド Ramの 2 つのストップ ナットを使用して影響の深さを調整できることを確認します。
- マウント マグネットを上下に移動することによって、影響の速度を調整できることを確認します。
- ブラケット脚顎の近くまたは棒の Ramから更に移動することによって破壊の幅を調整ことができることを確認します。
2. 破壊最適化
- 破壊位置
- 5 安楽死動物の代表的なサンプルでフラクチャするのには (大腿骨または脛骨)、手足のレントゲン写真を取得します。
注: サンプルは年齢、遺伝子型、セックスを用いた実験的プロトコルで使用される標本に一致する必要があります。1 つだけ骨折肢の最終議定書を呼び出す、場合でも、両方のサンプルの手足が使用されます。 - 下肢骨に true 左右・前方/後方ビューを取得する x 線ビームに接線方向の位置。分析のための尺度を提供する画像の面で知られている次元のオブジェクトを配置します。
- 注: 場合、大腿骨をイメージング、下肢は大腿骨が脛骨と同じ軸平面では、完全な拡張子でを確認します。
- 目的をマークする手足のレントゲン写真で骨折の場所 (図 1の破線) を骨折しました。(図 1A) のマークの破壊のレベルに踵骨脛骨関節から測定します。すべての試験片の平均破壊長さ (FL) を計算します。大腿骨骨折、顆間ノッチから測定します。
- 5 安楽死動物の代表的なサンプルでフラクチャするのには (大腿骨または脛骨)、手足のレントゲン写真を取得します。
- 破壊位置決め治具
- 1 つサポート アンビルの外表面からギロチンの影響 (CGI) (図 2) の中心までの距離を測定します。フロリダ、破壊位置決め治具深度 (JD) を計算する手順、2.1.4 からCGIを減算します。マシンまたは 3 D プリント U 字路高さと幅、アンビルとJD (図 3A) に等しい深さに等しい。サンプル図面と CAD ファイルに含まれている補足図 12Aと12 b。
注: 治具で四肢を配置すると、足の甲がギロチンの影響から最も遠い面に対して嘘する必要があります。クリアランスがリムの必要な場合 U 型チャンネルを変更します。 - 大腿骨骨折に対する腹臥位または仰臥位脛骨骨折 (図 4) の破壊装置に供試体を配置します。破壊位置決め治具の終わりに対して足の甲を押します。下肢骨折までギロチンを押して手動で。治具サイズおよび破壊位置 (図 2B) を確認するため骨折した手足のレントゲン写真を取得します。
- 破壊場所があまりにも骨の遠位場合にJDを増やすか破壊位置があまりにも骨の近位の場合、 JDを減らします。
- 1 つサポート アンビルの外表面からギロチンの影響 (CGI) (図 2) の中心までの距離を測定します。フロリダ、破壊位置決め治具深度 (JD) を計算する手順、2.1.4 からCGIを減算します。マシンまたは 3 D プリント U 字路高さと幅、アンビルとJD (図 3A) に等しい深さに等しい。サンプル図面と CAD ファイルに含まれている補足図 12Aと12 b。
- Pin パラメーターの安定化
- Pin の長さ:ステップ 2.1 で得られたレントゲン写真を使用して、脛骨骨折に対する後方外果の骨折大腿骨の大転子を顆間ノッチ レベルに脛骨プラトーから下肢長 (LL) を測定します。骨の長さを 0.9 ピン長さ (PL) (図 1 aおよび3 b) を計算するに掛けます。
-
ピン幅:ステップ 2.1 で得られたレントゲン写真、骨折肢 (図 1A) で最小の延髄直径 (MD) を測定します。延髄の直径および長さにほぼ同等のゲージの針よりも 1.5 x PLを選択します。
注: 14 週齢の c57bl/6 j マウスの近似ピン サイズは 22 G、1 で、27 G、大腿骨や脛骨のための 1 それぞれ。
- ピン切断ゲージ
- 2.4.1 マシンまたは 3 d プリント針の長さ (CGL) (図 3BマイナスPLと同じ長さのゲージ。補足数字 13 aと13B)。1 つの端は針のハブに対して残りの部分にオーバー ハングを持つ必要があります、他はピンをカットする必要がありますを示す必要があります。サンプル図面と CAD ファイルに含まれている補足図 13 aと13B。
- 髄内ピン破壊安定
- ステップ 2.1 から非フラクチャ試験片を使用して、半ば大腿骨、膝関節を公開する中間脛骨から電気クリッパーや脱毛クリームで毛を削除します。
- 脛骨を固定: 波膝蓋靱帯の外側の針を挿入します。内側膝蓋靭帯を撤回、脛骨軸に針の先端を合わせます。リーマのモーションを使用して、優しく脛骨プラトーを破るし、髄腔に針をガイドします。
- 大腿骨を固定: 波膝蓋靱帯の外側の針を挿入します。内側膝蓋靭帯を撤回、顆間ノッチで大腿骨の軸に針の先端を合わせます。リーマのモーションを使用して、優しく顆間ノッチの関節面に違反し、髄腔に針をガイドします。
- 露出針がゲージの長さに等しくなるまで連ステップ 2.4 で製造されたゲージを使用します。ゲージで示されるレベルで針をカットするのに十分な部屋 (~ 3 mm) を提供するために針を撤回します。
注: は必ず危険な投射物はなりませんので、削減しながら針 (プラスチック) の近位端を保持してください。 - 圧着ピン カッターを使用して pin の遠位端の 0.3 mm とゲージのレベルでピンをカットします。針の直径よりも大きい × 直径 1.5 棒を用いた関節面にピンをシンクします。
注意: 針骨の接点を増やすことによって針や移行の回転を防ぐ圧着します。 - 針肢の髄腔の長さを拡張し、近位または遠位端 (図 1C) から突き出ていないを確認するレントゲン写真を取得します。
- 影響の深さ
- ステップ 2.1 で得られたレントゲン写真を使用して、目的の破壊 (図 1A) のレベルで皮質の直径を測定します。すべての試験片の平均皮質直径 (CD) を計算します。
- 手順 2.2 で製造された破壊位置決め治具の破壊装置のステップ 2.5 から固定試用試験片を配置します。無傷の肢に影響を与える ram を置きます。
注: 削除する ram を許可しません。この手順で最適化する必要があります骨まま。 - 軟部組織の圧縮がない、骨を破壊する ram に十分な下向きの力を適用します。0.75 x CD (図 2) に影響を与える深さ (ID) を調整します。
注: 骨折、軟部組織のないとき、理想的な影響深度は 0.5 x のCDです。その他の軟部組織の圧縮に 0.75 アカウントを使用します。
- アンビル幅
- マウス脛骨、大腿骨 (図 2) 0.4 cm にアンビル幅 (AW) を設定します。
注: ラットなど大きい標本のためより広い幅の使用をお勧めします。
- マウス脛骨、大腿骨 (図 2) 0.4 cm にアンビル幅 (AW) を設定します。
- ラム重量
- ネズミの標本には 250 g の最小重量をお勧めします。
注: 付加的な重量は ram に大きい標本 (図 2) のスレッドことができます。
- ネズミの標本には 250 g の最小重量をお勧めします。
- 衝撃速度
- 落下高さ (DH) を 2 cm (図 2) に設定します。最初の位置に ram を配置するには、アクティブ化された電磁石に接続します。
- 破壊装置に試験四肢を配置します。手順 2.2 で製造された破壊位置決めジグに対して足の甲を押します。簡単に ram を解放するフット スイッチを押すし、開始位置にリセットします。
- 影響を受ける試験肢を病室します。破壊 (図 1D) の証拠を手足を分析します。
注: これは、微妙な制御の影響の深さと低速を使用する場合。 - 破壊が生成されない場合手順 2.9.1 - 2.9.3 と落下高さを 2 cm 増します。
- 骨折が生成された場合落下高さを記録し、1.1 を乗算します。これは新しいDHです。
- 2.9.5 のステップからDHを使用すると、次の試験四肢を破壊します。
- 破壊が生成されない場合は、手順 2.9.1 - 2.9.6 開いてを繰り返して、ドロップ高さを 2 cm 高きます。
- 骨折が生成された、繰り返し手順 2.9.6 開いて - 2.9.7 まですべてのテスト サンプルが使用されます。最終的なDHおよび最適化からすべてのパラメーター (FL、 CGI、 JD、 PL、 MD、 PS、 CGL、 CD、 ID、 AWとRW) を記録します。試験標本の年齢、性別、品種、重量を記録します。
3. 閉鎖-安定破壊発生
-
セットアップ
- すべての機器と機器を介してオートクレーブ、ホット ビーズの浸漬、またはそれに相当を滅菌します。
- 手術台に発熱体を置き、最適な温度に設定します。手術用ドレープを持つ要素をカバーしてください。0.75 でサークルを途中でカットで 3 × 3 の手術用覆布の2を準備します。
- 各トライアル (図 2) の前に破壊の塔の調整を確認します。ID、 AW、 RW、 DHを性別、年齢、および調査されるべき標本の遺伝子に特定の最適化のプロトコルから派生した値に設定します。
- 重量を量る、動物の体重を記録します。
-
手術
- 吸入麻酔薬を使用してマウスを十分に落ち着いた (イソフルラン: 誘導の 4-5%; メンテナンスのため 1-2%) または別の確立研究所麻酔プロトコル。呼吸数は、55 100 呼吸/分をする必要があります。動物の後肢のつま先ピンチに応答しないでください。
- 術後鎮痛ブプレノルフィンの最初の用量を管理 (0.1 mg/kg 皮下)。
- 眼は、角膜の乾燥を防ぐために潤滑します。
- 半ば脛骨から半ば大腿骨、膝関節を公開する電気クリッパーで動物の髪を削除します。非反応性のテープを使用して余分な毛のサイトをクリーンアップします。70% で湿らせたウェット綿棒と固定サイトの準備江藤。切開領域からすべての髪を削除する必要に応じて繰り返します。
- 準備し、ポビドン ヨード、70% の代替綿棒で固定部分をきれいに江藤。無菌性を確保するため 2 つの代替綿棒シーケンスを使用します。
- 皮膚が適切に駆除された後、ドレープは手術部位の周り配置されます。
- 手順 2.5 で説明したプロトコルを使用して、フラクチャした後に、手足を固定します。ピンが髄腔の長さを拡張しますが、近位または遠位端から突き出ていないを確認するレントゲン写真を取得します。
- 電磁石をオンにし、開始位置に配置する影響 ram を接続します。
- 大腿骨骨折に対する腹臥位または仰臥位脛骨骨折のそれを置くことによって破壊装置に供試体を配置します。固定された手足は、アンビルと破壊位置決め治具治具の外側に対して押された足の甲でされるべきであります。
- 一方、1 つの手と足を押すと手足のみを確保する影響でターゲット領域の ram、簡単に ram を解放するフット スイッチを押します。開始位置で ram を交換します。
- レントゲン写真を取得し、骨折の場所と種類を確認します。
-
術後管理
- 回復中に 15 分毎動物まで麻酔は意識、胸骨の内股を維持することが、動物を監視歩行。動物は 72 h の期間に及ぶことを確認します。
- 家動物は完全に回復するまで個別に。
- ブプレノルフィンと 48 時間の期間にわたって鎮痛を維持 (0.1 mg/kg 皮下) 12 時間間隔を投与します。
- 監視し、毎日 7-10 d か、安楽死まで動物の健康状態を記録します。
-
後破壊解析
- フロリダ、 PL、 CD、 MD、および破壊のパターンを測定します。マスター データ ファイルの測定値を記録します。
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Representative Results
以前私たちの研究室で使用されるギロチン 2004 年に開発された、アインホルン21で公開されたモデルに基づいていた。デザインで十分に骨の形態の任意の違いを考慮して調整を許さなかった、肢の位置決め再現性を可能にしなかった。さらに、前の装置がそれを動作するように 2 人を必要。したがって、我々 は、設計エンジニア リング、そして、新しい破壊装置を内蔵します。主な設計目標は、破壊の深さ、衝撃力、3 点接触、動物の位置の高品質調整する可能性だった。デザインは、2008年22記載の Marturano 破壊装置に基づいています。彼らのデザインの制限要因はだった破壊深さと影響の速度の間のリンクです。破壊深さと動物の位置を変更することがなく衝撃速度は調整されませんでした。これはちょうど 1 つを変更することは不可能、破壊パラメーターを最適化する際、一度に変数。さらに、それは長管骨骨折の位置を簡単に調整する方法を提供しませんでした。ここで示した設計の破壊と ram の速度の深さを調整する方法を変更すること、破壊のすべての変数の高解像度、独立した調整を許可します。さらに、装置は単一のユーザーで操作できる、費用対効果は、場所固有の骨折を生成するため動物位置を調整できます。
17 週齢の c57bl/6 j 男性マウスの脛骨骨折の最適化は、5 つの試料を用いて行った。目標は単純なの横骨折に脛骨腓骨の挿入のレベルのすぐ下を生成します。脛骨遠位端サイト非組合の結果、さらに、脛骨の同質地域を提供し腓骨の損傷に関連付けられている分析の合併症を避けるひと骨破壊の一般的なサイトです。マウスは安楽死され、中で radiographed。脛骨、腓骨の挿入の遠位部分に踵骨脛骨関節から平均FL 0.556 ± 0.025 cm。 アンビル幅 0.4 cm を使用して、CGI は 0.2 cm、0.356 cm のJDを求めた。位置決め治具は、コンピューター支援設計ソフトウェアを使用して、アクリロニ トリル ・ ブタジエン ・ スチレン (ABS) (図 3B) 3 D プリンターを使用して 0.01 mm 程度の解像度で印刷に建設されました。1 つの試用版脛骨、治具設計、骨折の位置を使用してレントゲン写真 (図 1B) によって確認されました。
ここに提示された結果を得るのためのPL 1.579 センチ、平均量の 90% を基に算出した (1.754 ± 0.031 cm)。(MD) 平均延髄直径 0.05 cm であった。27 x 3.175 cm の針のサイズは、必要なPLを超えるし、髄運河 (27 = 0.041 cm) を埋めるに選ばれました。切削ゲージは、切断 (図 3B) 端子のレベルを区別するため 1.596 センチメートルの長さで構成しました。残りの 9 つの脛骨のそれぞれが、固定されました。皮質直径 0.073 cm の影響深度 (ID) を計算する使用された 0.098 cm であった。
初期の脛骨は、ない破壊につながった 1 cm の落下高さで影響を受けていた。落下高さ 1 cm から 2 cm 増加しました。新しい高さは、単純横骨折になりました。その後破壊の落下高さ 2.2 cm に 10% 増加しました。これは、最初のドロップで単純横骨折を作り出した。2.2 cm ですべての残り脛骨が骨折しました。合計では、9/9 (100%)、骨折脛骨のピン曲げなし単純な横骨折の結果。ターゲット破壊の長さにターゲット ピン長さおよび破壊に関する実験的に実験 pin の長さの割合は 101.1%、97.6% であった。最後のパラメーターは、表 1代表的な大腿骨データも含まれますで報告されます。
上記開発最適化されたパラメーターを使用して、前と最適化後の骨折を比較する試みを行った。回顧のレントゲン写真は、最適化なしの単純なギロチン21を使用して私たちのラボで生成された前の脛骨骨折から得られました。簡単に言えば、脛骨は 0.029 cm ワイヤーを使用して固定されていました。抵抗が感じられるまで、ワイヤーが挿入された 3 mm、切り取り、および場所に駆動を撤回します。その後、マウスは脛骨腓骨の挿入時約影響の点でギロチンの下で置かれました。ギロチンは、10 cm のレベルから、外されました。骨折の追加のデータセットが収集された調節可能なギロチンと最適化のプロトコル (表 1) から派生したパラメーターを使用して、生成されました。各グループには、遺伝子型一致、14 週齢のマウスに 58 骨折が含まれています。レントゲン写真分析を行った実験的破壊の長さ (EFL): 踵骨脛骨関節から骨折、実験的ピン長さ (EPL)、骨の長さ、および破壊パターンまでの距離。
調節可能な破壊装置を使用し、パラメーターの最適化 (p < 0.001) の単純な横骨折 (図 5) の世代の向上します。最適化前のグループは時間の 98.28% (57/58) 単純横骨折を生成後最適化グループと比較して時間の 46.55% (27/58) のみ単純横骨折が生成されます。後最適化グループに 1 つだけの標本の位置決めの治具で、犬歯のため複雑骨折していた。最適化のプロトコルで説明されている方法に基づき、pin のカットの長さは、総骨長さの 90% を収集します。最適化前のグループ (p < 0.001) でのみ 83.67% 92.43% 最適化パラメーターおよび切削ピンゲージを使用して、骨の長さ後最適化グループで実験 pin の長さの割合だった最適化には、破壊の場所、ピン長、ピンに骨の長さの割合 (0.001 <p ) の変動も大幅減少しました。結果は、表 2に報告されます。
図 1: 最適化と単純な脛骨骨折の生成します。これらのパネルは、マウス脛骨の外側の線を表示します。(A) このパネル前破壊測定を示しています。黄色の破線は、理想的な破壊位置をマークします。破壊の長さ (フロリダ)、下肢長 (LL)、延髄直径 (MD)、皮質径 (CD) 測定オーバーレイは、レントゲン写真で示されます。(B) このパネルでは、破壊の場所のテストを示しています。固体の矢印は、位置決めの治具パラメーターをテストする非安定化の脛骨骨折のレベルを示します。このパネル (C) ピンの長さ (PL) をテストする前の骨折レントゲン写真でピンの長さテストを示していますと切削ゲージ。PLが髄運河LL塗りつぶしの 90% になるし、近位または遠位がはみ出さない。(D) このパネルは、最適化のあと破壊発生を示しています。矢印のアウトラインは、単純な横脛骨骨折のレベルを示します。影響のレベルでは、ピンは曲がっていません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 調節可能な破壊デバイス設計。この図は、正面、横と破壊装置のパース ビューを示しています。正面には、主要なデバイス コンポーネントのアノテーションが含まれています。側面ビューには、影響の深さ (ID)、落下高さ (DH) とアンビル幅 (AW) の調整を示す拡大の詳細が含まれます。付加的な重量は、赤矢印で示された影響 ram の上部の重みでハイパースレッディングによる ram に追加できます。アンビル幅調整詳細の点線は、影響の行を示します。サポート アンビル (CGI) の外の表面にギロチン インパクトの中心を使用して、正確かつ精密破壊レベルを生成する位置決め治具の深さを計算します。位置決めの治具は、図 3Aで詳細に表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 位置決めの治具と切断ゲージ デザインします。(A) このパネルはマウス位置決め治具の詳細を表示します。治具の深さ (JD) は、下肢骨折の場所を変更する調整できます。JDを増やすが骨折を近位移動し、遠位骨折を移動JDを減少します。このパネル (B) では、針およびピン切断ゲージの詳細を示しています。Pin の長さ (PL) は、下肢長 (LL) (図 1A) の 90% にする必要があります。切削ゲージ長さ (CGL) は、針の長さからPLを引いてから派生されます。カッティング ゲージを構築されているこの例では (CGL = 1.6 cm) 27 G 針を区別するため (長さ = 3.175 cm)、切断後 1.58 cm のPLを残してします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 脛骨と大腿骨骨折の位置決め。(A) マウス脛骨の上下写真のとおりと (B) positing 治具の大腿骨。(A.1) 脛骨骨折に対する仰臥位にマウスを配置サポート アンビルの中心に脛骨のと、足の甲に押し付け治具。(B.1) 大腿骨骨折、マウスはジグに対して押された足の背と腹臥位で配置されます。黄色の破線は、アンビルの影響の場所を示します。(A.2とB.2)下写真は、インパクトの時にアンビルの場所を示しています。研究者の手の位置は、ram の作動と干渉しないでください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.前と破壊発生の後の最適化。これらのパネル表示最適化前 (A) と (B) 後最適化破壊グループから代表的な骨折の側面写真。グループのサイズは、58 マウスだった。固体の矢印と矢印のアウトラインは、前と後の最適化のグループの破壊のレベルをそれぞれ示します。(A.1 - A.5)骨折生成最適化前は、高度な粉砕と破壊レベルの変動を示しています。ピン径のみ部分的に長さの変動性の高い髄運河で塗りつぶします。ピンの長さの矛盾は (A.3) 非安定化骨折と (A.3 - A.5) ピンの露出で起因しました。破壊深さ制御の欠如の結果 (A.4) ベントでピンと粉砕 (A.1 - A.5) に貢献しました。骨折発生後最適化 (パラメーターの完全なセットのテーブル 1を参照)、(図 3A) 位置決め治具の使用をもたらした破壊場所 (黄色の矢印のアウトライン) の変動の少ない。髄運河をいっぱいピン選択した前の骨折のレントゲン写真に基づくピン幅の最適化。ピン切断ゲージ (図 3B) の使用は、一貫性のある pin の長さにつながった。落下高さと衝撃の深さの最適化は、粉砕や曲がっているピンのない単純な横骨折を生産しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 省略形 | 脛骨 | 大腿骨 | ||
| 前の破壊パラメーター | ||||
| アンビル幅 (cm) | AW | 0.40 | 0.40 | |
| ラム重量 (g) | RW | 272.00 | 272.00 | |
| 事前測定を破壊します。 | ||||
| 手足の長さ (cm) mean±SD | LL | 1.75±0.03 | 1.32±0.05 | |
| 皮質直径 (cm) mean±SD | CD | 0.10±0.00 | 0.15±0.01 | |
| 延髄直径 (cm) mean±SD | MD | 0.05±0.00 | 0.09±0.01 | |
| ピンの大きさ (ゲージ/cm) | PS | 27/3.175 | 23/3.810 | |
| センターのギロチン インパクト (cm) = AW /2 | CGI | 0.20 | 0.2 | |
| 破壊の長さ (cm) mean±SD | フロリダ | 0.56±0.02 | 0.64±0.01 | |
| 最適化 | ||||
| ピンの長さ (cm) = 0.9 * LL | PL | 1.58 | 1.19 | |
| 奥行き (cm) に影響を与える = 0.75 * CD | ID | 0.07 | 0.11 | |
| ゲージの長さ (cm) を切断 = PS の-の PL | CGL | 1.60 | 2.62 | |
| 奥行き (cm) を治具 = FL - CGI | ゴミメールが大量 | 0.36 | 0.44 | |
| 落下高さ (cm) | DH | 2.20 | 4.40 | |
| 骨折後の測定 | ||||
| 実験的ピン長さ (cm) mean±SD | EPL | 1.60±0.06 | 1.19±0.04 | |
| ピンの長さ (%) に実験的ピン長さ | 101.1% | 100.0% | ||
| 実験的骨折の長さ (cm) mean±SD | 英語 | 0.54±0.01 | 0.62±0.06 | |
| 長さ (%) を破壊する破壊に関する実験的長さ | 97.6% | 97.1% | ||
| 単純横骨折 (%) | 9/9 (100%) | 9/9 (100%) | ||
表 1: 破壊の発生前に、と新しいギロチン システムの開発後のパラメーターです。
| 最適化前 | 後の最適化 | テスト | 意義 | |
| 実験的骨折の長さ (cm) mean±SD | 0.74±0.28 | 0.52±0.05 | t | < 0.001 |
| F | < 0.001 | |||
| 実験的ピン長さ (cm) mean±SD | 1.47±0.21 | 1.57±0.09 | t | < 0.001 |
| F | < 0.001 | |||
| 骨の長さ (%)、mean±SD ピンします。 | 83.67±11.97 | 92.43±5.29 | t | < 0.001 |
| F | < 0.001 | |||
| 単純横骨折 (%) | 46.55 | 98.28 | ピアソン | < 0.001 |
表 2: 破壊パラメーター最適化前に、と後の結果します。
補足図 1: サポート サブアセンブリ図面。この図は、サポート コンポーネントのアセンブリの図面を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 2: Ram サブアセンブリ図面。この図では、コンポーネント ram のアセンブリのための技術的な図面を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 3: 技術的な図面をブロックします。この図は、製造停止・破壊装置のためのブロックをガイドに使用できる技術的な図面を示しています。私たちは、アルミニウムを使用しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 4: ロッド、テクニカル ドローイングの Ram します。この図は、破壊装置の ram の製造に使用できる技術的な図面を示しています。我々 はステンレス鋼を使用しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 5: スクリュー、整列技術図面。この図では、ram に合わせてソケット キャップ ネジを変更する使用ことができます技術的な図面を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 6: パテ、技術的な図面をマウントします。この図では、破壊装置の取り付けプレートを製造するための技術的なデッサンです。私たちは、アルミニウムを使用しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 7: 磁石サブアセンブリ図面。この図は、磁石部品のアセンブリの図面を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 8: マウント、マグネット製図と CAD ファイル。この図は、技術的な図面と磁石マウントを製造するために使用できます (B) CAD ファイルに (A) を示しています (ファイル形式: *.stl)。3 D プリントされた我々 ポリ乳酸 (PLA) を使用して、部品。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 9: 完全なアセンブリ図面と CAD ファイル。この図を示します (A) 技術的な図面コンポーネントと (B) の完全な破壊のアセンブリの CAD ファイル (ファイル形式: *.iam)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 10: ブラケット、脚顎製図します。この図は、破壊用脚金具の製造に使用できる技術的な図面を示しています。ブラケットは市販 8020 角かっこから加工されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 11: プラットフォーム、破壊、製図と CAD ファイル。この図は、技術的な図面と破壊プラットフォームを製造するために使用できます (B) CAD ファイルに (A) を示しています (ファイル形式: *.stl)。3 D プリントされた我々 ポリ乳酸 (PLA) を使用して、部品。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 12: 治具、位置決めの破壊、製図と CAD ファイル。この図は、技術的な図面と肢位置決め治具を製造するために使用できます (B) CAD ファイルに (A) を示しています (ファイル形式: *.stl)。3 D プリントされた我々 ポリ乳酸 (PLA) を使用して、部品。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 13: 治具、ピンゲージ、製図と CAD ファイル。この図は、技術的な図面と、ピン切断ゲージを製造に使用することができます (B) CAD ファイルに (A) を示しています (ファイル形式: *.stl)。3 D プリントされた我々 ポリ乳酸 (PLA) を使用して、部品。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この破壊の最適化と世代のプロトコルは、破壊パラメーターに派生し、正確、再現性のある、横骨折を生成する低侵襲の手順を実行する効率的な方法を研究者を提供します。さらに、このプロトコルは、研究者の間の法の整合性を促進する破壊生成パラメーターの共通セットを確立します。これらのパラメーターは、さまざまなパラメーター (例えば年齢、性別、性別、および遺伝子型) に基づく破壊基準を確立する共通の破壊データベースの作成を有効にします。破壊変数の最適化試料の不均質 - 無駄な時間、失われたリソース、および使用不可能なデータの量を減らすが大幅に減少します。
正確かつ正確な骨折を生成するには、標準化された一連の特異性の高度を生産し、破壊の場所の可変性を減らす破壊生成パラメーターを確立することが重要です。破壊発生に加えて、適切な安定化も破壊カルス形成を促進して非組合員の確率を減らすために必要です。髄内固定実験的および臨床的に四肢の長管骨骨折を安定させるために使用される一般的な固定方法です。内部的に執着骨折が直接組織分化、破面で骨吸収を伴うプロセスの回復しない傾向があり、組合経由でその後破壊のカルス形成および改造します。これらのプロセスは、破壊接合部で運動と髄腔内ピンの移行によって妨げられることができます。このプロトコルは、骨折部位の固定の後で変位の程度を削減し洗練された手術機器や技術の不必要な被害を引き起こす可能性が使用せずピン移行の範囲を制限固定方式を利用します。皮質骨の組織。特定のサンプルの種類ごとの髄内接触を最大化する pin パラメーターのセットを生成する適切なカルス形成と骨改造の必要な安定性を提供します。
髄内ピンが配置されると、次の重要なステップは単純横骨折を生成します。骨折を介して適用外部から鈍力外傷を生成するプロトコルには、粉砕骨折を生成し、固定ハードウェアに損傷を与える可能性があります。これらの合併症を軽減するため、各サンプル セット23の平均皮質直径 x 0.5 に等しくなるように、影響の深さを制御することが重要です。破壊粉砕は、外部の鈍力外傷処置中に無理な力に起因できます。影響の速度は、重大なしきい値を超えた場合、き裂伝播速度は複数破壊サイト24で生じる応力波を生成します。応力波の生産の粉砕の可能性を減らすための衝撃速度しきい値以下ながらも、破断が生じるに十分な運動エネルギーを生成する ram の体重とドロップ高さを確立する重要です。高衝撃速度は、前に生成された25は骨折は、過剰なエネルギー吸収を生成する骨の急速載荷になります。破壊伝播時に読み込み中に吸収される過剰なエネルギーが解放される非直線的粉砕が生成されます。低衝撃速度とエネルギーの読み込みが遅い、生産高衝撃速度と急速載荷26に比べて線形破壊の確率が高い。粉砕の発生率を最小限に抑えるためにこのプロトコルはマウスの標準 ram 重量 250 g を使用する - これはより大きい種に合わせて調整することができます。非常に若い動物または知られている骨の病気 (例えば、骨または骨硬化症) とのそれらを作業するとき ram 体重減少する必要があります。ドロップの高さだけ 1 つの変数を調整することが同時に最適化されているときに一貫性のある ram の重量を使用することが重要です。種特異的な理想的な衝撃速度の計算は供試体の軟組織形態とサイズのわずかな変化のための会計でより一貫性のある骨折を生成します。
上記の方法は他の破壊世代プロトコルの多くの欠点を排除します。ただし、いくつかの側面は、効率的に目的の結果を生成する訓練を必要があります。プロシージャの 1 つの可能な合併症は、かなり骨や軟部組織の損傷を引き起こす可能性があります、不正確なピン配置です。これは主に、アプローチの限られた可視性と十分な二国間の手の器用さの欠如です。オープン切開せず内部固定は、プロシージャを実行するユーザーからスキルのかなりの量を要求できます。したがって、それは彼または彼女に持っている十分な訓練 - 死体、癒しのプロセス全体で合併症を引き起こすことができる余分な軟部組織の損傷を避けるために - 必要な場合重要です。(膝蓋靭帯、脛骨プラトーおよび大腿骨の顆間ノッチ) プロトコルで指定されている構造を認識し最小限の軟部組織損傷と一貫性のある、正確な固定を出す助けになります。ただし、説明研究の目標は、ピン配置の詳細な手順を提示すること、むしろ理想的な骨折を生成するメソッドを記述します。
近位端、大腿骨または脛骨の遠位端のを介して任意のリーマを避けるためにカッティング ゲージの使用が勧めします。大腿骨の近位端をドリルと、軟部組織への不必要な損傷を引き起こすか、治癒過程におけるモビリティと損傷の合併症を引き起こして、股関節の骨。同様に、脛骨の遠位端をリーマと足首の構造、歩行力学、読み込み、およびカルス形成を変更することが損傷します。
破壊位置の精度を高めるため、デバイス内肢の適切なポジショニングを確認するカスタム肢位置決め治具を設計できます。正確かつ正確な衝撃は一貫して目的の場所に骨折を生成に不可欠です。当研究室は、現在 2 つの治具を採用しています: - 脛骨骨折と半ば大腿骨骨折ですがモジュラー設計および 3 D 印刷の汎用性のための他の 1 つはさまざまな場所で骨折を生成する機能の研究者を与えます。特定の場所に骨折を生成するように設計カスタム治具の追加は、オペレーターのエラーの可能性を制限することによって精度と破壊発生の精度の両方を増加します。
このメソッドのほとんどの制限は、他の既存の閉じた破砕技術において直面する問題に似ていません。過度の軟部組織や脂肪高齢や肥満のマウスに見られるように、骨折の発生が低下します。これは通常力のしていない影響を与える深さの欠如不足のために注意することが重要です。この制限は、ram の重量や骨折部位に適用される運動エネルギーを増加する速度を増やすことによって克服できます。このメソッドは、内部固定に骨の骨内表面を混乱させるし、治癒に影響を与えることができますにも依存します。骨破壊も発生すると臨床的に髄内釘、骨折整復する内の貢献を検討している場合、創外固定やプレートより良いオプションが可能性があります。追加の制限は、初期パラメーターを確立するいけにえの動物の必要なサンプルただし、破壊変数より多くのサンプルの種類を確立データベースを開発すると、その他のいけにえサンプルの必要性が減少します。
記述のプロトコルは、閉じた破壊生成手順で通常見られる破壊の不均一性を最小限に抑え、サンプル タイプに固有の標準化されたパラメーターを使用することによるトラウマの精度を向上します。最新破壊世代プロトコル マウス種のみに適用されますで、適度にコンシス テントなフラクチャします。彼らは頻繁に最適な結果を得るための特定のサンプル タイプを使用する必要や、系統内の変化を考慮しません。プロトコルはマウス系統間に存在可能性があります、他の種でコンシス テント ・ フラクチャを生成に対応できるサイズや骨の形態変化のアカウントをここで紹介します。さらに、このプロトコルの広範な応用は研究者間の標準化された破壊言語の採用をサポートします。一般的な変数と類似したプロトコルを使用してメソッドの一貫性を改善し、研究間の比較を強化します。さらに集団破壊生成パラメーターの汎用性を高める追加破壊モデルで使用される破壊の最適化のプロトコルの可能性がある、上記で説明したパラメーターはマウス長管骨を特定、データベース。この破壊最適化プロトコルを用いたは破壊位置とパターンの整合性を向上させることにより均一な使用可能なサンプルの生産を増やします。サンプルのより高いパーセントの利回りが実験室のリソースの無駄を省き、必要な動物の数を減らすし、研究効率を向上させます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この出版物で報告された研究は、国立研究所の関節炎、筋骨格系に支えられて、賞の下で健康の国民の協会の皮膚疾患番号 F30AR071201 と R01AR066028。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Support Subassembly | Supplementary Figure 1 | ||
| Beam, Support--Jaw Section | 80/20 | 1003 x 9.00 | w/ #7042 at A, C, in Left End |
| Beam, Support--Horizontal Section | 80/20 | 1002 x 14.00 | |
| Beam, Support--Vertical 1 | 80/20 | 1050 x 10.50 | w/ #7042 at A in Left End and at A in Right End |
| Beam, Support--Vertical 2 | 80/20 | 1010 x 10.50 | w/ #7042 at D, B in Left End and at A in Right End |
| Beam, Support--Plate Mount | 80/20 | 1030 x 8.00 | w/ #7036 at Left End |
| Beam, Support--Magnet | 80/20 | 1010 x 13.50 | w/ #7042 at A, C, in Right End |
| Anchors (3) | 80/20 | 3392 | |
| Double Anchor (3) | 80/20 | 3091 | |
| Bolt Assembly (6) | 80/20 | 3386 | 1/4-20 x 3/8" |
| Button Head Socket Cap Screw (6) | 80/20 | 3604 | 1/4-20 x 3/4" |
| Ram Subassembly | Supplementary Figure 2 | ||
| Block, Stop | Custom | Supplementary Figure 3 | |
| Block, Guide | Custom | Supplementary Figure 3 | |
| Rod, Ram | Custom | Supplementary Figure 4 | |
| Alignment Screw | Custom | Supplementary Figure 5 | |
| Plate, Mounting | Custom | Supplementary Figure 6 | |
| Linear Sleeve Bearing (2) | McMaster-Carr | 8649T2 | |
| Hex Nut (3) | McMaster-Carr | 92673A125 | 3/8-16 UNC |
| Socket Cap Screw (8) | McMaster-Carr | 92196A108 | 4/40 x 3/8" |
| Socket Cap Screw (6) | McMaster-Carr | 92196A032 | 4/40 x 1 1/8" |
| Socket Cap Screw (1) | McMaster-Carr | 92196A267 | 10/32 3/8" |
| Magnet Subassembly | Supplementary Figure 7 | ||
| Mount, Magnet | Custom | Supplementary Figure 8 | |
| Power Supply | McMaster-Carr | 70235K23 | |
| Foot Switch | McMaster-Carr | 7376k2 | |
| Electromagnet | McMaster-Carr | 5698k111 | |
| Wire - 10 feet | McMaster-Carr | 9936k12 | |
| Rod, Magnet | McMaster-Carr | 95412A566 | 1/4" Threaded Rod x 7" |
| Corner Bracket (6) | 80/20 | 4108 | |
| Socket Cap Screw (1) | McMaster-Carr | 92196A705 | 10/32 1 1/4" |
| Hex Nut (4) | McMaster-Carr | 92673A113 | 1/4-20 UNC |
| Complete Assembly | Supplementary Figure 9 | ||
| Bracket, Leg Jaw (2) | Custom | Supplementary Figure 10 | |
| Platform, Fracture | Custom | Supplementary Figure 11 | |
| Jig, Positioning-Fracture | Custom | Supplementary Figure 12 | |
| Other | |||
| Pin Cutter | Medical Supplies and Equipment | 150S | |
| Needles | Sigma | Z192430, Z192376 | 23g x 1.5" - mouse femur, 27g x 1.25" - mouse tibia |
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