Détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté

L’apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, bien étudiée est nécessaire pour maintenir l’homéostasie physiologique et éliminer les cellules potentiellement nocifs dans le corps humain¹. Après l’induction de l’apoptose, cellules apoptotiques (ApoCells) peuvent subir une série de changements morphologiques et démonter dans petites vésicules membranaires appelées ApoBDs. Dans l’ensemble, ce processus est connu comme le démontage de cellules apoptotiques et peut être divisé en 3 étapes distinctes, basées sur la morphologie^2,3. Étape 1 (membrane plasmique blebbing) se caractérise par la formation de structures ressemblant à des ballons sur la surface des cellules appelées bulles^4,5. Étape 2 (formation de protrusion apoptotiques) comprend la formation de protrusions membranaires longue comme apoptopodia, apoptopodia-perles et microtubules pointes^6,7,8. Enfin, étape 3 (formation ApoBD) comprend la fragmentation des protubérances apoptotic et/ou ApoCells pour générer ApoBDs^6,9. Résultats antérieurs ont suggéré un rôle de ApoBDs en facilitant le dégagement de cellules apoptotiques et médiation communication intercellulaire. Par exemple, il est proposé que la fragmentation d’un ApoCell en ApoBDs peut produire des petits morceaux de « petits » qui pourrait être facilement enlevés en entourant les phagocytes^2,10,11. En outre, ApoBDs pourrait contenir une série de molécules comme l’ADN, l’ARN et des protéines qui peuvent être victimes de la traite aux cellules environnantes afin de faciliter la communication de cellule-cellule^12,13,14. Pour fonctionnellement étudier ces processus, il est essentiel de confirmer trois paramètres clés, y compris (i) la validation d’induction de l’apoptose et de la formation de ApoBD, (ii) l’isolement du ApoBDs et (iii) la confirmation de la pureté de la ApoBD.

Auparavant, un certain nombre de méthodes, y compris cytométrie de flux et de microscopie électronique ont été utilisé pour étudier l’apoptose et ApoBDs^15,16,17,18. Cependant, ApoBD détection et quantification sont souvent difficiles, voire négligé. Par exemple, l’apoptose plus couramment utilisé d’axée sur la cytométrie en flux dosage emploie annexine V (A5, une protéine qui se lie l’externalisés ' manger-me' signal phosphatidylsérine (PtdSer)) et l’acide nucléique stain (PI) de l’iodure de propidium¹⁹. Cependant, en utilisant cette combinaison universelle tache, analyse suppose qu’il y a seulement trois types de sous-ensembles de cellules (cellules viables, ApoCells et cellules nécrosées) dans l’échantillon. En outre, bien que considéré comme « un étalon-or » par de nombreux chercheurs de l’apoptose, des analyses de cytométrie en flux et l’analyse ultérieure des données exclut souvent ApoBDs par une première étape de blocage en sélectionnant les événements^{intermédiaires-haute} FSC/SSC. Par conséquent, nous avons récemment mis au point un essai de cytométrie en flux roman A5 et TO-PRO-3, une autre tache d’acides nucléique qui peut être sélectivement absorbé par la caspase 3/7-activé pannexine 1 (PANX1) canaux^7,20. Comme les caspases induite par 3 PANX1 activation précède PtdSer exposition aux premiers stades de l’apoptose, TO-PRO-3 taches différentiellement apoptotiques et nécrotiques cellules. En outre, cette approche combinée avec notre roman gating stratégie inclut des événements tout acquis au cours de l’analyse des données et ainsi, six des sous-ensembles de cellule/particule sont identifiés, notamment : (i) des cellules viables (FSC/SSC^{intermédiaire/haut}, A5^faible , TO-PRO-3^faible), (ii) A5^– ApoCells précoce (FSC/SSC^{intermédiaire/haut}, A5^basse, TO-PRO-3^{intermédiaire}), (iii) A5⁺ ApoCells (FSC/SSC^{intermédiaire/haut}, A5^haute , TO-PRO-3^{intermédiaires}), les cellules nécrotiques (iv) ou ApoCells fin (FSC/SSC^{intermédiaire/haut}, A5^haute, TO-PRO-3^élevé), (v) ApoBDs (FSC/SSC^faible, A5^{intermédiaire}, TO-PRO-3^{faible / intermédiaires}) et (vi) débris (FSC/SSC^faible, A5^basse, TO-PRO-3^bas)²⁰. Notre approche met l’accent sur l’importance d’analyser tous les sous-ensembles de cellules/particules et, plus important encore, la séparation des ApoBDs des cellules et des débris de²⁰. Ainsi, cette approche montre une technique efficace pour valider l’induction de l’apoptose et ApoBD formation en même temps.

Traditionnellement, les ApoBDs ont été isolés par le biais de diverses méthodes de centrifugation différentielle par laquelle ApoBDs peut être séparé de cellules ou d’autres vésicules extracellulaires basés sur la densité. Cependant, ces méthodes de centrifugation sont souvent limités par la pureté de la ApoBD faible, absence d’une étape de quantification pour confirmer la pureté de l’échantillon, et/ou incapacité à séparer les cellules spécifiques au type ApoBDs^17,21,22. Par conséquent, nous avons récemment développé deux approches, une base de FACS et une nouvelle approche axée sur la centrifugation différentielle peut être couplée à notre méthode de cytométrie en flux précédemment établie pour valider l’induction de l’apoptose et échantillon de pureté²³. ApoBD isolation grâce à notre approche axée sur les FACS peut enrichir ApoBDs jusqu'à 99 % de pureté et peut être couplée avec une variété d’anticorps spécifiques à un type cellulaire à isoler ApoBDs des populations de cellules mixtes, les échantillons de tissus et les fluides corporels,²³. En outre, notre approche révisée de centrifugation différentielle démontre une méthode efficace pour isoler ApoBDs à > 90 % pureté²³.

Dans cet article, nous décrivons en détail notre procédure expérimentale afin de valider l’induction de l’apoptose et détecter et quantifier la formation ApoBD. Les flux de travail de ApoBD d’isolation à l’aide de méthodes centrifugation différentielles et axés sur les FACS est également élaborés et comparés. Les données représentatives démontrent que la méthodologie décrite fournit un outil de pointe efficace pour de futures études de ApoBD.

1. l’induction de l’apoptose

1. Centrifuger les échantillons de cellules à 300 g pendant 5 min et jeter le surnageant pour enlever les débris de cellules préexistantes.
   Remarque : Lorsque vous utilisez les cellules adhérentes, cellules des graines à l’avance et laver avec 1 x solution tamponnée au phosphate (PBS) avant l’induction de l’apoptose.
2. Déterminer le nombre de cellules et de prélever des cellules.
   Remarque : Selon l’isolement après test, nous recommandons un numéro de cellulaire de départ d’au moins 1 x 10⁷ cellules.
3. Resuspendre dans les médias (respectif milieu contenant du sérum de veau foetal de 10 % (vol/vol), 50 UI/mL de pénicilline, 50 µg/mL de mélange de streptomycine) pour une concentration finale de 1 x 10⁶ cellules/mL.
4. Aliquote ~ 2 x 10⁶ cellules / puits d’une plaque 6 puits.
5. Pour induire l’apoptose, retirez le couvercle de la plaque et irradier les cellules à 150 mJ/cm² , à l’aide d’un irradiateur UV. Cela devrait prendre environ 30-60 s.
   Remarque : Avant l’irradiation, assurez-vous que ~0.5 x 10⁶ cellules sont conservées pour le contrôle de cellule « Broussaille ».
   Remarque : L’apoptose peut également être induite via d’autres méthodes telles qu’anti-SAF ou sérum famine⁶.
6. Incuber à 37° C, 5 % de CO₂ pour 2 à 8 heures, selon la lignée cellulaire.
7. À l’aide d’un microscope optique haut banc, visualiser les cellules afin de confirmer la présence d’apoptose morphologies, telles que blebbing et apoptopodia formation ApoBD formation.
   Remarque : 40 X grossissement est suffisant
8. À l’aide d’une pipette P1000, pipette et prélever des échantillons de l’apoptose.
9. Laver la plaque avec du PBS 1 x et se combinent avec l’échantillon restant afin d’assurer un rendement maximal.
10. Frais virés ~1/10^th pour « Tout Apoptotic l’échantillon » (de Windows WAS) contrôler.
11. Recueillir l’échantillon « Non traitée ».
12. Centrifuger les échantillons WAS tant broussaille à 3 000 x g pendant 6 min.
13. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS 1 x et mis de côté sur la glace.
14. Pour ApoBD isolement, continuent à chaque étape 2 ou 3 avec l’échantillon restant d’apoptotic.

2. ApoBD Isolation via FACS

1. Centrifuger l’ensemble de l’échantillon à 3 000 x g pendant 6 min.
2. Enlever la majorité du liquide surnageant sans déranger le culot.
3. Remettre en suspension dans une solution colorante contenant 1 mL de tampon de liaison x A5 1, 75 µL de A5-FITC et 2 µL de TO-PRO-3 par 1 x 10⁷ cellules.
4. Incuber les échantillons dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min.
5. Ajouter 1 à 2 mL de tampon de liaison 1 x A5 et centrifuger échantillon à 3 000 x g pendant 6 min enlever tache excédentaire.
   Remarque : Pour les populations de cellules mixtes ou des échantillons de tissus, effectuer un anticorps coloration étape en utilisant une combinaison de marqueurs spécifiques à un type de cellule dans 1 tampon de liaison x A5 et incuber sur la glace pendant 20 min (ou selon le protocole du fabricant) avant la centrifugation à 3 000 x g pendant 6 min.
6. Resuspendre le culot d’échantillon dans 3 mL de tampon de FACS (PBS 1 x, 1 tampon de liaison x A5, 10 % FSC, 2 mM EDTA) par 1 x 10⁷ cellules.
7. Filtrer à travers un tamis de cellule 70 µm dans un fond rond, tube en polypropylène (cytométrie en flux) et conserver les échantillons sur la glace et dans l’obscurité.
8. Allumez la machine FACS et effectuer standard mis en place à l’aide d’une buse de 100 µm, effectuer le délai de chute et assurer un flux stable.
9. Charger l’échantillon, puis affectez-lui ~ 1000 événements/s de vitesse d’acquisition.
10. Ajuster la FSC, SSC, APC (a-PRO-3) et des tensions FITC (A5) et positionner les événements dans les parcelles de FACS pour s’assurer que les populations peuvent être clairement séparées.
11. Enregistre les 20 000 événements.
12. Mettre en place une stratégie de blocage que dans la partie 4.
13. Dans la disposition de la sorte, ajouter la dernière porte de ApoBD que la population de tri désirée.
14. Commencer à acquérir de l’échantillon et effectuer une sorte de test en recueillant 5 000-10 000 ApoBDs dans un nouveau tube contenant ~ 250 µL de tampon de FACS.
15. Effectuer un système de retour de chasse et charge tri ApoBDs.
16. Acquérir et enregistrer test-tri ApoBDs.
17. Vérifiez que la pureté de ApoBD est ~ 99 % en comparant FSC (axe y) vs A5 (événements de l’axe des abscisses).
    NOTE : A5 coloration peut réduire légèrement lors de ré-analyser les échantillons en raison de laser de blanchiment.
18. Lorsqu’on atteint haute pureté, charger l’échantillon original et continuer jusqu'à ce que le nombre désiré de ApoBDs a été obtenu de tri.
    Remarque : Si nécessaire, double tri peut être effectuée afin d’isoler en même temps ApoCells et ApoBDs.
    Remarque : Lors du tri sur une longue période de temps, nous recommandons d’incubation le tube de prélèvement à 4 ° C.
19. Une fois que le tri est terminé, recueillir une petite portion de post-tri ApoBDs, trier après ApoCells, broussaille et WAS pour valider l’apoptose et confirmer post-tri pureté.
    Remarque : Bien que le tri test et pureté post-tri ne devraient pas significativement, c’est basé sur les paramètres de flux et de la stabilité.

3. ApoBD Isolation par Centrifugation différentielle

1. Centrifuger l’échantillon apoptotic restant à 300 x g pendant 10 min.
2. Récupérer le surnageant, en laissant environ 500 µL pour ne pas perturber le culot cellulaire et ajouter dans un nouveau tube conique de 15 mL.
3. Retirer le reste 500 µL et Resuspendre le culot dans 2 mL de PBS 1 x (ce qui représente la « fraction enrichie en ApoCell ».
4. Centrifuger le liquide surnageant collecté pendant 20 min à 3 000 g.
5. Recherchez une boulette et retirer délicatement le surnageant (le surnageant peut contenir de petites vésicules extracellulaires, y compris des microvésicules et exosomes).
6. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS 1 x (ce qui représente la fraction enrichie « ApoBD »)
7. Collecter 100 µL de chaque viabilisé, les WAS, enrichie en ApoCell et les échantillons enrichis ApoBD dans un nouveau fond rond, tube de polystyrène (cytométrie en flux).
8. Ajouter 100 µL de tache contenant 2 x A5 tampon de liaison au 1/100 A5-FITC et 1 : 1 000 a-PRO-3
9. Incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.
10. Analyser des échantillons par cytométrie en flux, à l’aide de la stratégie de blocage comme décrit ci-dessus pour valider la succès induction de l’apoptose et la pureté de la fraction enrichie en ApoBD.

4. cytométrie Gating stratégie

1. Plot TO-PRO-3 (axe y) contre FSC (axe x) pour séparer les cellules nécrotiques (a-PRO-3^élevé) de tous les autres événements non-perméabilisées (a-PRO-3^{faible ou intermédiaire}).
2. Sélectionnez tous les événements non-perméabilisées et tracer les SSC contre A5. Porte deux populations dont la population (P1), SSC^{intermédiaire/haut}, A5^{faible ou intermédiaire} piles 1 et 2 (P2), tous les autres événements.
3. Dans P2, plot TO-PRO-3 contre A5 et sélectionnez événements^{intermédiaires/haut} A5 d’exclure tous les débris cellulaires.
4. Sélectionnez tous les événements positifs de l’A5 et tracer FSC contre A5. Séparer (FSC^faible) ApoBDs de ApoCells (^moyen/hautFSC).
   Remarque : Lors de l’ouverture de porte ApoBDs pour ApoBD d’isolation via l’approche axée sur les FACS, nous recommandons une dernière étape en sélectionnant ApoBDs et comparant a-PRO-3 en A5, tous les événements. Cela garantit que la porte de tri finale utilise fluorescence plutôt que des paramètres FSC/SSC.
5. Pour l’analyse des cellules viables, sélectionnez P1, puis effectuez l’une des deux stratégies de blocage. Pour une analyse générale de cellules viables, intrigue FSC contre A5 et sélectionner toutes les cellules de^moyen/haut FSC, donc enlever les débris de cellules restants. Sinon, pour une analyse approfondie, des cellules viables peuvent être séparés du A5^– ApoCells précoce et en a-PRO-3 contre FSC. Select TO-PRO-3^faible, cellules viables de la FSC^{intermédiaire/haut} et TO-PRO-3^{intermédiaire}, FSC^{intermédiaire/haut} A5^– ApoCells précoce.

En utilisant la procédure décrite ici, apoptose des monocytes THP-1 a été induite et ApoBDs ont été détectés et isolés via une base de FACS ou une approche de centrifugation différentielle (Figure 1). Tout d’abord, l’apoptose a été induite par l’irradiation UV et échantillons ont été prélevés après 2-3 h d’incubation quand exposé de cellules apoptotiques morphologies, incluant blebbing, formation de protrusion membranaire apoptotic et la génération de ApoBDs6. Une méthode de cytométrie de flux axées sur l’A5 et de TO-PRO-3 a été utilisée pour confirmer l’induction de l’apoptose des monocytes et ApoBD formation en séparant les cellules viables, les cellules nécrotiques, début ApoCells, ApoCells, ApoBDs et débris (Figure 2). Pris ensemble, analyse en cytométrie en flux a indiqué que le traitement UV entraîne environ 20 % ApoCells (Figure 3).

ApoBDs de monocyte THP-1 ont ensuite été isolées de la WAS via deux approches. Tout d’abord, les échantillons ont été préparés pour une approche axée sur les FACS où seulement une étape de centrifugation simple est nécessaire pour l’échantillon entier apoptotic de granule avant la coloration de grande pureté et FACS. Cette méthode consiste pour les tests fonctionnels quand significativement échantillon haute pureté est requise (par exemple, pour l’analyse de qPCR), quand un certain nombre de ApoBDs est requis, ou lorsque l’acquisition de cellules spécifiques au type ApoBDs auprès d’un échantillon complex. En utilisant cette méthode, ApoBDs ont été isolés à ~ 99 % de pureté (Figure 4).

Ensuite, monocyte THP-1 ApoBDs ont aussi été isolés par une approche de centrifugation différentielle en deux étapes. La première étape comprend l’isolement des cellules viables, les ApoCells et les cellules nécrotiques. La deuxième étape comprend la séparation de grandes ApoBDs de petites vésicules extracellulaires comme microvésicules et exosomes, qui ne peuvent pas être granulées à 3 000 x g. cytométrie s’est déroulée ensuite pour confirmer l’induction de l’apoptose et la pureté d’échantillon ApoBD et démontré un échantillon ApoBD enrichi contenant ~ 97 % ApoBDs (Figure 4). Ceci présente une technique rapide et efficace pour isoler ApoBD à relativement haute pureté et est approprié lorsque la purification ApoBDs partir d’échantillons contenant des cellules du même type.

Figure 1 . Schéma de principe d’isolement ApoBD via soit une approche axée sur les FACS ou différentielle centrifugation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 . Flow cytometry gating stratégie. Six des sous-ensembles de cellule/particules (y compris les cellules viables, A5– ApoCells début, A5+ ApoCells, ApoBDs, les cellules nécrotiques et les débris) ont été identifiés et servant à sélectionner ApoBD d’isolement selon le FACS. a membrane permeabilised cellules nécrotiques sont séparées du non-permeabilised événements. (b) A5basse-intermédiaire, SSC,bas-haut cellules sont séparées du A5basse-haute événements. (b.i) pour une analyse approfondie, TO-POR-3faible des cellules viables peuvent être séparés du TO-PRO-3intermédiaire A5– ApoCells précoce. (b.ii) ou bien, simplement le calcul ApoBD pureté, cellules viables se distingues des événementsbasse FSC. (c) A5faibles débris sont exclus. (d) FSCintermédiaire/haut ApoCells sont séparés des FSCfaible ApoBDs. e toutes les A5-PRO-3intermédiaire/haut ApoBDs sont sélectionnés pour le tri. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 3 . Validation de l’apoptose des monocytes THP-1. Écoulement cytometry analyse des monocytes THP-1 non traitées ou irradiation UV a été réalisée pour déterminer les niveaux de cellules viables, A5– ApoCells début, A5+ ApoCells et les cellules nécrotiques.

Figure 4 . Purification du THP-1 dérivées de monocytes ApoBDs. Analyse en cytométrie en flux a été réalisée sur isolé THP-1 dérivées de monocytes ApoBDs via soit une approche axée sur les FACS ou différentielle centrifugation basée, montrant l’enrichissement des ApoBDs de cellules viables, les ApoCells et les cellules nécrotiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.