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Article de méthode

Détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté

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⸱

DOI :

10.3791/58317

⸱

12 août 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Genetics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Dans cet article

Résumé

Un flux de travail par écoulement cytometry ou prime de centrifugation est conçu pour détecter, quantifier et isoler les corps apoptotiques d’un échantillon d’apoptotic à haute pureté.

Résumé

Corps apoptotiques (ApoBDs), les microvésicules et les exosomes sont les principaux membres de la famille de vésicule extracellulaire, avec ApoBDs étant un des plus grand type. Il a été proposé que les ApoBDs peuvent aider clairance cellulaire ainsi que communication intercellulaire via trafic biomolécules. Les approches conventionnelles utilisées pour l’identification et l’isolement des ApoBDs sont souvent limités par l’absence de quantification précise et pureté de l’échantillon faible. Nous décrivons ici un flux de travail pour confirmer l’induction de l’apoptose, valider la formation ApoBD et isoler ApoBDs à haute pureté. Aussi nous décrire et comparer cellule activée par fluorescence triant (FACS) et les approches de centrifugation différentielle basée à isoler ApoBDs. En outre, la pureté des ApoBDs isolées sera confirmée en utilisant un préalablement établir écoulement cytometry-base coloration et méthode d’analyse. Pris ensemble, à l’aide de l’approche décrite, THP-1 monocyte apoptose et apoptose cellulaire démontage a été induite et validé, et ApoBD provenant des monocytes THP-1 ont été isolés à une pureté de 97 à 99 %.

Introduction

L’apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, bien étudiée est nécessaire pour maintenir l’homéostasie physiologique et éliminer les cellules potentiellement nocifs dans le corps humain1. Après l’induction de l’apoptose, cellules apoptotiques (ApoCells) peuvent subir une série de changements morphologiques et démonter dans petites vésicules membranaires appelées ApoBDs. Dans l’ensemble, ce processus est connu comme le démontage de cellules apoptotiques et peut être divisé en 3 étapes distinctes, basées sur la morphologie2,3. Étape 1 (membrane plasmique blebbing) se caractérise par la formation de structures ressemblant à des ballons sur la surface des cellules appelées bulles4,5. Étape 2 (formation de protrusion apoptotiques) comprend la formation de protrusions membranaires longue comme apoptopodia, apoptopodia-perles et microtubules pointes6,7,8. Enfin, étape 3 (formation ApoBD) comprend la fragmentation des protubérances apoptotic et/ou ApoCells pour générer ApoBDs6,9. Résultats antérieurs ont suggéré un rôle de ApoBDs en facilitant le dégagement de cellules apoptotiques et médiation communication intercellulaire. Par exemple, il est proposé que la fragmentation d’un ApoCell en ApoBDs peut produire des petits morceaux de « petits » qui pourrait être facilement enlevés en entourant les phagocytes2,10,11. En outre, ApoBDs pourrait contenir une série de molécules comme l’ADN, l’ARN et des protéines qui peuvent être victimes de la traite aux cellules environnantes afin de faciliter la communication de cellule-cellule12,13,14. Pour fonctionnellement étudier ces processus, il est essentiel de confirmer trois paramètres clés, y compris (i) la validation d’induction de l’apoptose et de la formation de ApoBD, (ii) l’isolement du ApoBDs et (iii) la confirmation de la pureté de la ApoBD.

Auparavant, un certain nombre de méthodes, y compris cytométrie de flux et de microscopie électronique ont été utilisé pour étudier l’apoptose et ApoBDs15,16,17,18. Cependant, ApoBD détection et quantification sont souvent difficiles, voire négligé. Par exemple, l’apoptose plus couramment utilisé d’axée sur la cytométrie en flux dosage emploie annexine V (A5, une protéine qui se lie l’externalisés ' manger-me' signal phosphatidylsérine (PtdSer)) et l’acide nucléique stain (PI) de l’iodure de propidium19. Cependant, en utilisant cette combinaison universelle tache, analyse suppose qu’il y a seulement trois types de sous-ensembles de cellules (cellules viables, ApoCells et cellules nécrosées) dans l’échantillon. En outre, bien que considéré comme « un étalon-or » par de nombreux chercheurs de l’apoptose, des analyses de cytométrie en flux et l’analyse ultérieure des données exclut souvent ApoBDs par une première étape de blocage en sélectionnant les événementsintermédiaires-haute FSC/SSC. Par conséquent, nous avons récemment mis au point un essai de cytométrie en flux roman A5 et TO-PRO-3, une autre tache d’acides nucléique qui peut être sélectivement absorbé par la caspase 3/7-activé pannexine 1 (PANX1) canaux7,20. Comme les caspases induite par 3 PANX1 activation précède PtdSer exposition aux premiers stades de l’apoptose, TO-PRO-3 taches différentiellement apoptotiques et nécrotiques cellules. En outre, cette approche combinée avec notre roman gating stratégie inclut des événements tout acquis au cours de l’analyse des données et ainsi, six des sous-ensembles de cellule/particule sont identifiés, notamment : (i) des cellules viables (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5faible , TO-PRO-3faible), (ii) A5– ApoCells précoce (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5basse, TO-PRO-3intermédiaire), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5haute , TO-PRO-3intermédiaires), les cellules nécrotiques (iv) ou ApoCells fin (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5haute, TO-PRO-3élevé), (v) ApoBDs (FSC/SSCfaible, A5intermédiaire, TO-PRO-3faible / intermédiaires) et (vi) débris (FSC/SSCfaible, A5basse, TO-PRO-3bas)20. Notre approche met l’accent sur l’importance d’analyser tous les sous-ensembles de cellules/particules et, plus important encore, la séparation des ApoBDs des cellules et des débris de20. Ainsi, cette approche montre une technique efficace pour valider l’induction de l’apoptose et ApoBD formation en même temps.

Traditionnellement, les ApoBDs ont été isolés par le biais de diverses méthodes de centrifugation différentielle par laquelle ApoBDs peut être séparé de cellules ou d’autres vésicules extracellulaires basés sur la densité. Cependant, ces méthodes de centrifugation sont souvent limités par la pureté de la ApoBD faible, absence d’une étape de quantification pour confirmer la pureté de l’échantillon, et/ou incapacité à séparer les cellules spécifiques au type ApoBDs17,21,22. Par conséquent, nous avons récemment développé deux approches, une base de FACS et une nouvelle approche axée sur la centrifugation différentielle peut être couplée à notre méthode de cytométrie en flux précédemment établie pour valider l’induction de l’apoptose et échantillon de pureté23. ApoBD isolation grâce à notre approche axée sur les FACS peut enrichir ApoBDs jusqu'à 99 % de pureté et peut être couplée avec une variété d’anticorps spécifiques à un type cellulaire à isoler ApoBDs des populations de cellules mixtes, les échantillons de tissus et les fluides corporels,23. En outre, notre approche révisée de centrifugation différentielle démontre une méthode efficace pour isoler ApoBDs à > 90 % pureté23.

Dans cet article, nous décrivons en détail notre procédure expérimentale afin de valider l’induction de l’apoptose et détecter et quantifier la formation ApoBD. Les flux de travail de ApoBD d’isolation à l’aide de méthodes centrifugation différentielles et axés sur les FACS est également élaborés et comparés. Les données représentatives démontrent que la méthodologie décrite fournit un outil de pointe efficace pour de futures études de ApoBD.

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Protocole

1. l’induction de l’apoptose

  1. Centrifuger les échantillons de cellules à 300 g pendant 5 min et jeter le surnageant pour enlever les débris de cellules préexistantes.
    Remarque : Lorsque vous utilisez les cellules adhérentes, cellules des graines à l’avance et laver avec 1 x solution tamponnée au phosphate (PBS) avant l’induction de l’apoptose.
  2. Déterminer le nombre de cellules et de prélever des cellules.
    Remarque : Selon l’isolement après test, nous recommandons un numéro de cellulaire de départ d’au moins 1 x 107 cellules.
  3. Resuspendre dans les médias (respectif milieu contenant du sérum de veau foetal de 10 % (vol/vol), 50 UI/mL de pénicilline, 50 µg/mL de mélange de streptomycine) pour une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.
  4. Aliquote ~ 2 x 106 cellules / puits d’une plaque 6 puits.
  5. Pour induire l’apoptose, retirez le couvercle de la plaque et irradier les cellules à 150 mJ/cm2 , à l’aide d’un irradiateur UV. Cela devrait prendre environ 30-60 s.
    Remarque : Avant l’irradiation, assurez-vous que ~0.5 x 106 cellules sont conservées pour le contrôle de cellule « Broussaille ».
    Remarque : L’apoptose peut également être induite via d’autres méthodes telles qu’anti-SAF ou sérum famine6.
  6. Incuber à 37° C, 5 % de CO2 pour 2 à 8 heures, selon la lignée cellulaire.
  7. À l’aide d’un microscope optique haut banc, visualiser les cellules afin de confirmer la présence d’apoptose morphologies, telles que blebbing et apoptopodia formation ApoBD formation.
    Remarque : 40 X grossissement est suffisant
  8. À l’aide d’une pipette P1000, pipette et prélever des échantillons de l’apoptose.
  9. Laver la plaque avec du PBS 1 x et se combinent avec l’échantillon restant afin d’assurer un rendement maximal.
  10. Frais virés ~1/10th pour « Tout Apoptotic l’échantillon » (de Windows WAS) contrôler.
  11. Recueillir l’échantillon « Non traitée ».
  12. Centrifuger les échantillons WAS tant broussaille à 3 000 x g pendant 6 min.
  13. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS 1 x et mis de côté sur la glace.
  14. Pour ApoBD isolement, continuent à chaque étape 2 ou 3 avec l’échantillon restant d’apoptotic.

2. ApoBD Isolation via FACS

  1. Centrifuger l’ensemble de l’échantillon à 3 000 x g pendant 6 min.
  2. Enlever la majorité du liquide surnageant sans déranger le culot.
  3. Remettre en suspension dans une solution colorante contenant 1 mL de tampon de liaison x A5 1, 75 µL de A5-FITC et 2 µL de TO-PRO-3 par 1 x 107 cellules.
  4. Incuber les échantillons dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min.
  5. Ajouter 1 à 2 mL de tampon de liaison 1 x A5 et centrifuger échantillon à 3 000 x g pendant 6 min enlever tache excédentaire.
    Remarque : Pour les populations de cellules mixtes ou des échantillons de tissus, effectuer un anticorps coloration étape en utilisant une combinaison de marqueurs spécifiques à un type de cellule dans 1 tampon de liaison x A5 et incuber sur la glace pendant 20 min (ou selon le protocole du fabricant) avant la centrifugation à 3 000 x g pendant 6 min.
  6. Resuspendre le culot d’échantillon dans 3 mL de tampon de FACS (PBS 1 x, 1 tampon de liaison x A5, 10 % FSC, 2 mM EDTA) par 1 x 107 cellules.
  7. Filtrer à travers un tamis de cellule 70 µm dans un fond rond, tube en polypropylène (cytométrie en flux) et conserver les échantillons sur la glace et dans l’obscurité.
  8. Allumez la machine FACS et effectuer standard mis en place à l’aide d’une buse de 100 µm, effectuer le délai de chute et assurer un flux stable.
  9. Charger l’échantillon, puis affectez-lui ~ 1000 événements/s de vitesse d’acquisition.
  10. Ajuster la FSC, SSC, APC (a-PRO-3) et des tensions FITC (A5) et positionner les événements dans les parcelles de FACS pour s’assurer que les populations peuvent être clairement séparées.
  11. Enregistre les 20 000 événements.
  12. Mettre en place une stratégie de blocage que dans la partie 4.
  13. Dans la disposition de la sorte, ajouter la dernière porte de ApoBD que la population de tri désirée.
  14. Commencer à acquérir de l’échantillon et effectuer une sorte de test en recueillant 5 000-10 000 ApoBDs dans un nouveau tube contenant ~ 250 µL de tampon de FACS.
  15. Effectuer un système de retour de chasse et charge tri ApoBDs.
  16. Acquérir et enregistrer test-tri ApoBDs.
  17. Vérifiez que la pureté de ApoBD est ~ 99 % en comparant FSC (axe y) vs A5 (événements de l’axe des abscisses).
    NOTE : A5 coloration peut réduire légèrement lors de ré-analyser les échantillons en raison de laser de blanchiment.
  18. Lorsqu’on atteint haute pureté, charger l’échantillon original et continuer jusqu'à ce que le nombre désiré de ApoBDs a été obtenu de tri.
    Remarque : Si nécessaire, double tri peut être effectuée afin d’isoler en même temps ApoCells et ApoBDs.
    Remarque : Lors du tri sur une longue période de temps, nous recommandons d’incubation le tube de prélèvement à 4 ° C.
  19. Une fois que le tri est terminé, recueillir une petite portion de post-tri ApoBDs, trier après ApoCells, broussaille et WAS pour valider l’apoptose et confirmer post-tri pureté.
    Remarque : Bien que le tri test et pureté post-tri ne devraient pas significativement, c’est basé sur les paramètres de flux et de la stabilité.

3. ApoBD Isolation par Centrifugation différentielle

  1. Centrifuger l’échantillon apoptotic restant à 300 x g pendant 10 min.
  2. Récupérer le surnageant, en laissant environ 500 µL pour ne pas perturber le culot cellulaire et ajouter dans un nouveau tube conique de 15 mL.
  3. Retirer le reste 500 µL et Resuspendre le culot dans 2 mL de PBS 1 x (ce qui représente la « fraction enrichie en ApoCell ».
  4. Centrifuger le liquide surnageant collecté pendant 20 min à 3 000 g.
  5. Recherchez une boulette et retirer délicatement le surnageant (le surnageant peut contenir de petites vésicules extracellulaires, y compris des microvésicules et exosomes).
  6. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS 1 x (ce qui représente la fraction enrichie « ApoBD »)
  7. Collecter 100 µL de chaque viabilisé, les WAS, enrichie en ApoCell et les échantillons enrichis ApoBD dans un nouveau fond rond, tube de polystyrène (cytométrie en flux).
  8. Ajouter 100 µL de tache contenant 2 x A5 tampon de liaison au 1/100 A5-FITC et 1 : 1 000 a-PRO-3
  9. Incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.
  10. Analyser des échantillons par cytométrie en flux, à l’aide de la stratégie de blocage comme décrit ci-dessus pour valider la succès induction de l’apoptose et la pureté de la fraction enrichie en ApoBD.

4. cytométrie Gating stratégie

  1. Plot TO-PRO-3 (axe y) contre FSC (axe x) pour séparer les cellules nécrotiques (a-PRO-3élevé) de tous les autres événements non-perméabilisées (a-PRO-3faible ou intermédiaire).
  2. Sélectionnez tous les événements non-perméabilisées et tracer les SSC contre A5. Porte deux populations dont la population (P1), SSCintermédiaire/haut, A5faible ou intermédiaire piles 1 et 2 (P2), tous les autres événements.
  3. Dans P2, plot TO-PRO-3 contre A5 et sélectionnez événementsintermédiaires/haut A5 d’exclure tous les débris cellulaires.
  4. Sélectionnez tous les événements positifs de l’A5 et tracer FSC contre A5. Séparer (FSCfaible) ApoBDs de ApoCells (moyen/hautFSC).
    Remarque : Lors de l’ouverture de porte ApoBDs pour ApoBD d’isolation via l’approche axée sur les FACS, nous recommandons une dernière étape en sélectionnant ApoBDs et comparant a-PRO-3 en A5, tous les événements. Cela garantit que la porte de tri finale utilise fluorescence plutôt que des paramètres FSC/SSC.
  5. Pour l’analyse des cellules viables, sélectionnez P1, puis effectuez l’une des deux stratégies de blocage. Pour une analyse générale de cellules viables, intrigue FSC contre A5 et sélectionner toutes les cellules demoyen/haut FSC, donc enlever les débris de cellules restants. Sinon, pour une analyse approfondie, des cellules viables peuvent être séparés du A5– ApoCells précoce et en a-PRO-3 contre FSC. Select TO-PRO-3faible, cellules viables de la FSCintermédiaire/haut et TO-PRO-3intermédiaire, FSCintermédiaire/haut A5– ApoCells précoce.

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Résultats

En utilisant la procédure décrite ici, apoptose des monocytes THP-1 a été induite et ApoBDs ont été détectés et isolés via une base de FACS ou une approche de centrifugation différentielle (Figure 1). Tout d’abord, l’apoptose a été induite par l’irradiation UV et échantillons ont été prélevés après 2-3 h d’incubation quand exposé de cellules apoptotiques morphologies, incluant blebbing, formation de protrusion membranaire apoptotic et la génération de ApoBDs<...

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Discussion

Depuis sa première description dans les années 1950, le domaine de l’apoptose a progressé nettement, devenir un domaine de recherche important. Malgré l’intérêt général et des efforts considérables, certains aspects de l’apoptose, en particulier la formation d’ApoBDs, n’ont pas été bien étudiés en raison de l’absence de méthodologies appropriées. Citons notamment la limitation dans le suivi de la progression de l’apoptose et de la formation de ApoBD simultanément à l’aide de la cytométrie en flux traditionnels analyse A5...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cela a fonctionné a été pris en charge par des subventions de santé nationale et Conseil de recherches médicales (GNT1125033 et GNT1140187) et Australian Research Council (DP170103790) à I.K.H.P.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules, par exemple monocytes humains THP-1 en culture (numéro de clone : TIB-202)ATCC-RPMI
1640 mediumLife Technologies22400-089
Mélange pénicilline-streptomycineLife Technologies15140122
FSCGibco10099-141
1x PBS--
Annexin V FITCBD
iodureLife TechnologiesT3605TO-PRO-3 peut provoquer des irritations cutanées, oculaires et respiratoires. Évitez tout contact direct.
10x Tampon de liaison Annexine VBD Bioscience556454
EDTASigma-Aldrich1001710526
Tube à centrifuger (15 mL)Cellstar188271
Tube à microcentrifuger (1,5 mL)Sarstedt72.690.001
Incubateur de culture tissulaire (37 ° ; C, 5 % CO2)--
CentrifugeuseBeckman Coulter392932
FACS ARIA III Cytomètre en flux, configuré avec deux lasers pour la détection FITC et APCCytomètre en flux BD Bioscience-FACS
Canto II, configuré avec deux lasers pour la détection FITC et APCBD Bioscience-FACS
Diva 6.1.1 logicielBD Bioscience-
Logiciel FlowJo 8.8.6--
  ; UV Stratalinker 1800Stratagene-
Bioscience-TO-PRO-3

Références

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