Summary
Nous décrivons ici une méthode pour évaluer l’expression de poumon des miARN qui est prévus pour réguler les gènes inflammatoires utilisant des souris exposées à l’ozone ou de l’air filtré à différents stades du cycle oestral.
Abstract
Profilage de microARN (miARN) est devenu d’intérêt pour les chercheurs qui travaillent dans divers domaines de recherche de biologie et de médecine. Les études actuelles montrent un prometteur future de l’utilisation des miARN dans le diagnostic et le soin des maladies pulmonaires. Ici, nous définissons un protocole pour miRNA profilage pour mesurer l’abondance relative d’un groupe des miARN prévues pour réguler les gènes inflammatoires dans le tissu pulmonaire, partir d’un modèle de souris de l’inflammation des voies respiratoires induite par l’ozone. Parce qu’il a été démontré que les niveaux de l’hormone sexuelle peuvent influer sur la régulation de l’immunité innée pulmonaire chez les femelles, cette méthode vise à décrire un miRNA inflammatoire protocole chez les souris femelles, prenant en considération le cycle oestral de profilage stade de chaque animal au moment de l’exposition à l’ozone. Nous abordons également approches bioinformatiques applicable miRNA découverte et cible méthodes d’identification Leduc, un logiciel R/Bioconductor, et logiciel d’analyse fonctionnelle pour comprendre le contexte biologique et les voies associées expression différentielle de miRNA.
Introduction
microARN (miARN) sont courts (19 à 25 nucléotides), naturels, non codantes des molécules d’ARN. Séquences de miARN sont évolutifs conservé selon les espèces, ce qui suggère l’importance des miARN dans la régulation des fonctions physiologiques1. profil d’expression des micro-ARN a été prouvé pour être utile pour identifier les miARN qui sont importants dans la régulation de divers processus, y compris la réponse immunitaire, différenciation cellulaire, processus de développement et l’apoptose2. Plus récemment, les miARN ont été reconnus pour leur utilisation potentielle dans le diagnostic de la maladie et la thérapeutique. Pour les chercheurs qui étudient les mécanismes de régulation génique, mesurant miRNA expression peut éclairer des modèles de systèmes au niveau des processus réglementaires, surtout quand les informations de miRNA sont fusionnées avec le profilage d’ADN messagère et autres données de génome-échelle3. En revanche, miARN ont également montré à être plus stables que les ARNm dans un éventail de types de spécimens et est également mesurables avec une plus grande sensibilité que les protéines4. Cela a conduit à un intérêt considérable dans le développement des miARN comme biomarqueurs pour diverses applications de diagnostiques moléculaires, y compris les maladies pulmonaires.
Dans le poumon, miRNAs jouent un rôle important dans le processus de développement et le maintien de l’homéostasie. En outre, leur expression anormale a été associée à l’apparition et la progression de diverses maladies pulmonaires5. La pneumopathie inflammatoire induite par la pollution de l’air a démontré une plus grande sévérité et pronostic moins favorable chez les femelles, ce qui indique que les hormones et le cycle oestral peuvent réglementer pulmonaire innée immunité et miRNA expression en réponse aux défis environnementaux 6. dans le présent protocole, nous utilisons exposition à l’ozone, qui est une composante majeure de la pollution atmosphérique, pour induire une forme d’inflammation des poumons chez les souris femelles qui se produit en l’absence d’immunité adaptative. En utilisant l’ozone, nous sommes induisant le développement d’hyperréactivité bronchique associé à la lésion des cellules épithéliales des voies respiratoires et une augmentation des neutrophiles et des médiateurs inflammatoires en proximal airways7. Actuellement, il n’y a pas des protocoles bien décrits pour caractériser et analyser des miARN tout le cycle oestral chez des souris exposées à l’ozone.
Ci-dessous, nous décrivons une méthode simple pour identifier les étapes du cycle oestral et miRNA expression dans les tissus pulmonaires chez des souris femelles exposées à l’ozone. Nous abordons également approches bioinformatiques efficace miRNA découverte et cible d’identification, en mettant l’accent sur la biologie computationnelle. Nous analysons les données microarray à l’aide de Leduc, un logiciel R/Bioconductor qui offre une solution intégrée d’analyse de données d’expression de gène des expériences8. Analyse des données de tableau PCR de Leduc a un avantage en termes de puissance sur les procédures de test t basé lorsque vous utilisez le petit nombre de tableaux/échantillons pour comparer l’expression. Pour comprendre le contexte biologique miRNA des résultats d’expression, nous avons ensuite utilisé le logiciel d’analyse fonctionnelle. Afin de comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelles changements et pour prédire les résultats probables, le logiciel combine les datasets miRNA-expression et connaissance de la littérature9. Il s’agit d’un avantage par rapport aux logiciels qu’il suffit de regarder pour l’enrichissement statistique dans le recoupement d’ensembles des miARN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de la Penn State University.
1. évaluation de la phase du Cycle oestral
- Bien retenir une femelle souris C57BL/6 (8-9 semaines) en utilisant la technique de retenue une main souris décrite dans Machholz et al.,10.
- Remplir la pipette en plastique stérile avec 10 μL d’eau ultra pure.
- Introduire l’embout de la pipette en plastique dans le vagin.
- Doucement purger le liquide 4-5 fois pour prélever l’échantillon.
- Placez l’éclat final contenant des sécrétions vaginales sur une lame de verre.
- Observer l’éclat vaginale non colorée sous un microscope optique avec un objectif 20 x.
Remarque : Les animaux qui ne présentent pas de cycles réguliers en raison de la pseudo-grossesse ou d’autres causes doivent être exclus de l’expérience. Il est recommandé d’effectuer des sécrétions vaginales quotidiennes au moins trois cycles consécutifs confirmer la cyclicité.
2. exposition à l’Ozone
- Placer un maximum de 4 souris dans deux récipients en verre 1,2 L avec couvercles de maille de fil et de l’eau ad libitum.
- Mettre un récipient en verre dans la chambre de l’ozone et l’autre dans la salle d’exposition de l’air filtré.
- Ajuster la concentration d’ozone à des concentrations d’ozone 2 ppm et moniteur régulièrement.
Remarque : L’appareil de l’ozone fournit un flux d’air régulé (> 30 changements/h d’air) avec contrôle de température (25 ° C) et humidité relative (50 %). Le système génère de l’ozone, un ozoniseur de décharge électrique, qui est surveillé et contrôlé par un analyseur d’ozone ultraviolet et contrôleurs de débit massique, comme décrit plus haut11. - Supprimer les récipients en verre après 3 h d’exposition à l’air d’ozone/filtré. Retour animaux de cage avec literie, nourriture et eau ad libitum.
3. poumon Collection
- 4 heures après l’exposition, anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale d’un kétamine/xylazine cocktail (90 mg/kg de kétamine, xylazine 10 mg/kg).
Remarque : Pour confirmer un niveau correct de l’anesthésie, vérifiez la souris pour une pédale reflex (pincement de l’orteil ferme) et réglez l’anesthésie si nécessaire. - Humidifier la peau de souris avec l’éthanol à 70 %.
- Faire une incision médiane de 2 cm à l’aide d’un fonctionnement ciseaux et pinces chirurgicales pour exposer la veine cave.
- Sacrifier la souris par résection de la veine cave supérieure et l’aorte. Si nécessaire, introduire une aiguille de calibre 21 G dans la veine cave supérieure les veines rénales à recueillir le sang avant l’exsanguination. Vous pouvez également prélever le sang par ponction cardiaque suite de protocoles standard.
- Utiliser ciseaux chirurgicaux à ciel ouvert la cavité abdominale et enlever les muscles peau/haut, se déplaçant vers le haut vers les côtes.
- Ciseaux chirurgicaux permet de perforer la membrane.
Remarque : Poumons seront effondrera loin du diaphragme. - Découper la cage thoracique à l’aide de ciseaux chirurgicaux pour exposer le cœur et les poumons.
- À l’aide de pinces, prendre un tube de microcentrifuge RNase-libre de 1,5 mL et il submerge dans l’azote liquide pour remplir le tube.
Remarque : Utiliser des lunettes et des gants de protection pour gérer l’azote liquide. - Supprimer les poumons, placez-les dans le libre de RNase microtubes 1,5 mL à rempli d’azote liquide à snap-gel le tissu et attendez quelques secondes jusqu'à ce que le liquide s’évapore.
- Fermer le couvercle du tube et conserver les tissus à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
4. préparation d’ARN
- Pulvériser des poumons entiers à l’aide d’un pulvérisateur de tissu en acier inoxydable.
Remarque : Le pulvérisateur de tissu doit être placé dans l’azote liquide avant de l’utiliser. Nettoyer le pulvérisateur après chaque utilisation avec solution de RNAse. - Diviser les poumons pulvérisés et placer dans deux tubes de 1,5 mL (la moitié du poumon chaque).
- Ajouter 500 µL de guanidinium thiocyanate par tube échantillon et mélanger. Homogénéiser chaque échantillon à l’aide de 18 G, 21 G et aiguilles 23 G, respectivement.
Remarque : Les échantillons peuvent être fortifiés avec 5,6 x 108 exemplaires d’un petit RNA spike-en contrôle (d’une autre espèce) avant de procéder à l’extraction. - Ajouter 500 µL d’éthanol à chaque échantillon et vortexer pendant 15 s.
- Charge le mélange dans une colonne dans un tube de prélèvement et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min. jetez l’accréditif.
-
Pour la DNase I traitement (en colonne) ;
- Ajouter 400 µL de RNA Wash Buffer et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min.
- Dans un tube exempt de RNase, ajouter 5 µL de DNase I et 75 µL de 1Ã de digestion de l’ADN de la mémoire tampon et mélanger. Ajouter le mélange directement à la matrice colonne.
- Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
- Ajouter 400 µL de solution de prelavage RNA à la colonne et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min. jetez les intermédiaires et répétez cette étape.
- Ajouter 700 µL de tampon de lavage RNA à la colonne et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min. jetez l’accréditif.
- Centrifuger à 12 000 x g pendant 2 min retirer le tampon restant. Transférer la colonne dans un tube de RNase-libre.
- Pour éluer l’ARN, ajouter 35 µL d’eau exempte de DNase/RNase directement à la matrice colonne et centrifuger à 12 000 x g pendant 1,5 min.
- Mesurer la concentration d’ARN totale (260 nm) et de la pureté à l’aide d’un spectrophotomètre. Suivez les instructions pour effectuer la quantification du RNA dans un échantillon de 1,5 µL aliquote. Blanc l’instrument avec de l’eau exempte de DNase/RNase utilisé pour l’élution.
Remarque : Un ratio 260/280 de ~2.0 est généralement accepté comme « pure » pour l’ARN. Concentration d’ARN typique varie habituellement entre 750 et 2 500 ng/µL. - Conserver à-80 ° C.
5. miRNA profilage
-
Pour rétro-transcrire les petits ARN, utilisation 200 ng d’ARN total.
- Préparer le mélange de la réaction de transcription inverse sur la glace (volume total par réaction est 20 µL). Pour chaque réaction, ajouter 4 µL de 5 x 2 µL d’eau exempte de RNase, 2 µL de la transcriptase inverse, tampon et 2 µL de x 10 nucléotides mélangent. Mélanger tous les composants et l’aliquote dans 600 µL exempte de RNAse tubes en plastique (10 µL du mélange par réaction).
Remarque : Transcription inverse master mix contient tous les composants requis pour la synthèse de cDNA de premier-brin sauf modèle RNA.
Remarque : Calculer un volume excessif (10 %) lors de la préparation du mélange principal. - Ajouter le modèle RNA (200 ng dans 10 µL) à chaque éprouvette contenant la transcription inverse mélange principal. Mélanger, centrifuger pendant 15 s à 1 000 x get de les stocker sur la glace jusqu’en plaçant dans le thermocycleur ou bloc sec.
- Incuber pendant 60 min à 37 ° C.
- Incuber 5 min à 95 ° C et placer les tubes sur la glace.
- Diluer le cDNA en ajoutant 200 µL d’eau exempte de RNase à chaque réaction de transcription inverse de 20 µL.
- Préparer le mélange de la réaction de transcription inverse sur la glace (volume total par réaction est 20 µL). Pour chaque réaction, ajouter 4 µL de 5 x 2 µL d’eau exempte de RNase, 2 µL de la transcriptase inverse, tampon et 2 µL de x 10 nucléotides mélangent. Mélanger tous les composants et l’aliquote dans 600 µL exempte de RNAse tubes en plastique (10 µL du mélange par réaction).
-
Effectuer une PCR en temps réel à l’aide de la souris la réponse inflammatoire et l’auto-immunité miRNA PCR Array.
- Préparer un mélange de réaction (volume total 1100 µL) : pour chaque réaction, ajouter 550 µL du mélange principal de 2 x PCR, 110 µL de 10 x mix amorce universelle, 340 µL d’eau exempte de RNase et 340 µL du modèle cDNA (réaction diluée de l’étape 5.1.5).
- Ajouter 10 µL du mélange réactionnel dans chaque loge de la miRNA pré-chargés tableau de PCR à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Sceller le miRNA plaque PCR Array avec film adhésif optique.
- Centrifuger la plaque pendant 1 min à 1 000 x g à température ambiante pour enlever les bulles.
- Programmer le cycler en temps réel, à l’étape d’activation initiale de l’ACP à 95 ° C pendant 15 minutes, 3 étapes cyclisme contenant dénaturation pendant 15 s à 94 ° C, recuit pendant 30 s à 55 ° C et extension pendant 30 s à 70 ° C pendant 40 cycles nombre.
Remarque : Instructions pour configurer le cycler en temps réel les conditions suivez fabricant vélo. Exécute l’étape de courbe de dissociation intégrée dans le logiciel de cycler en temps réel. - Effectuer l’analyse des données.
6. analyse de données
- Extraire les valeurs de Ct par le logiciel PCR en temps réel pour chaque échantillon dans un logiciel d’analyse.
Remarque : Ct A valeur de 34 est considérée comme seuil de décision. Si les échantillons contiennent des épi-dans le contrôle (par exemple, cel-mir-39), normaliser les valeurs de Ct à la hausse de contrôle pour chaque échantillon. Valeurs seuils devrez peut-être être réglée manuellement. Valeurs de base sont automatiquement définies. - Normaliser les valeurs de Ct à la Ct moyenne de six contrôles d’entretien ménager de miRNA : SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, en utilisant l’équation suivante :
ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping) - Pour plier le changement calculs, calculer les valeurs de ΔΔCt en utilisant un échantillon spécifique comme le contrôle, à l’aide de l’expression relative équation12:
miRNA expression relative :
2-∆∆Ct, où - ∆∆Ct =-[test ∆Ct - ∆Ct control]
Remarque : Changer le pli de 200 est considérée comme seuil de décision. - Exporter des valeurs d’expression de changement pli pour effectuer une analyse statistique sur R en utilisant le package Leduc Bioconductor8.
- Corriger les comparaisons multiples à l’aide de la méthode de Benjamini-Hochberg13.
Remarque : Une copie du script R est disponible à : http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Ensembles de données et les données analysées sont également disponibles à l’Omnibus de Expression de gène sous le numéro GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.
7. data Analysis : Analyse fonctionnelle logiciel
- Organiser le groupe de données. Inclure les miARN avec leur expression respective journal ratios et les valeurs prédictives. Voir le tableau 1 pour la mise en forme du jeu de données spécifique.
- Logiciel d’analyse fonctionnelle ouverte (version 01-10).
- Télécharger le jeu de données en utilisant le format suivant : format de fichier : « Format Flexible », l’en-tête de colonne contient : « Yes », sélectionnez le type d’identificateur : « miRBase (mature) », plate-forme tableau utilisé pour des expériences : choisir la plate-forme de tableau.
Remarque : Accepte les formats de fichiers sont .txt (fichiers texte délimité par tabulation), .xls (fichiers excel) et .diff (fichiers cuffdiff). - Sélectionnez « Déduire des Observations » et vérifiez que le groupe expérimental d’étiquetage est correct.
- Allez à « Résumé du Dataset » de réviser le montant total des miARN cartographiés et non mappés.
-
Cliquez sur le bouton « nouveau » en haut à gauche du programme. Sélectionnez « Nouveau micro-ARN cible filtre » et télécharger un ensemble de données micro-ARN.
- La valeur Source : TarBase, conclusions d’Experts ingéniosité, miRecords.
- La valeur confiance : expérimentalement observée ou élevé (prévu).
- Sélectionnez « Ajouter des colonnes » d’inclure une variété d’informations biologiques sur les cibles tels que les espèces, maladies, tissus, voies et plus encore.
- Se pour concentrer sur des cibles qui ont changé l’expression dans l’expérience, sélectionnez « Ajouter / remplacer les ARNm dataset ». Utilisez « Expression appairer » pour localiser les microARN avec les niveaux d’expression identiques ou différents.
Remarque : L’analyse de filtre fournira des microARN noms et symboles, cibles de l’ARNm, la source qui décrit la relation de la cible et le niveau de confiance de la relation prévue (Figure 2).
- Cliquez sur « Ajouter à ma voie » pour envoyer l’ensemble de données filtré à une toile de voie et d’explorer les relations biologiques plus.
- Chemin Designer permet de créer un modèle de qualité de publication, des effets de micro-ARN.
-
Une autre option consiste à créer une analyse de base.
- Pour le type de base de l’analyse, sélectionnez « Analyse de l’Expression ».
- Pour le type de mesure, sélectionnez « Expr Log Ratio ».
- Résumé analytique de la filtre : tenir compte seulement des molécules et/ou des relations où : (espèces = mouse) AND (confiance = observées expérimentalement) AND (sources de données = « Ingéniosité Expert Findings », « Ingéniosité ExpertAssist conclusions », « miRecords », « TarBase », ou « TargetScan homme »).
- Sélectionnez un seuil de valeur p = 0,05.
- Exécuter l’analyse.
Remarque : Le rapport comprendra : voies canoniques, analyse régulateurs en amont, les maladies et les fonctions, effets de régulateur, réseaux, molécules et plus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les différents types cellulaires observés dans les frottis sont utilisés pour identifier l’étape de cycle oestral de la souris (Figure 1). Ceux-ci sont identifiés par la morphologie des cellules. Au cours du proestrus, cellules sont presque exclusivement des amas de cellules épithéliales nucléées (Figure 1 a) forme ronde, bien formées. Lorsque la souris est dans la phase d’oestrus, les cellules sont des cellules épithéliales squameuses cornéocytaire, présents dans les amas des (Figure 1 b). Pendant métoestrus, cellules épithéliales cornéocytaire et polynucléaires sont vus (Figure 1). En strus, leucocytes (petites cellules) sont généralement plus fréquents (Figure 1).
Nous avons extrait RNA de quatre poumons de souris suivant le protocole décrit précédemment. Les concentrations d’acide nucléique (ng / µL) se situait entre 1197.9 et 2178.1 avec une moyenne de 1583.1 ± 215 (tableau 1). La moyenne du ratio A260/A280 a oscillé entre 2.010 à 2.020 avec une moyenne de 2.016 ± 0,002. En revanche, les ratios observés de A260/A230 oscillaient entre 2.139 et 2.223 avec une moyenne de 2.179 ± 0.018.
Le tableau 2 montre les résultats de l’expression différentielle obtenus avec Leduc sur R. Nous avons calculé les albums miARN différentiellement exprimés entre souris exposés à l’ozone ou de l’air dans le pro-oestrus (à l’aide de la commande toptable)14filtré. La première colonne donne la valeur de la variation de pli log2-pli dans miRNA expression entre l’ozone et les animaux exposés à l’air filtré. La colonne t représente la statistique t modérée calculée pour chaque miRNA dans la comparaison. Les colonnes p.value et adj.p.value représentent des p-valeurs associées pour chaque comparaison avant et après plusieurs essai réglage, respectivement. Ajustement pour les comparaisons multiples a été fait avec le Benjamini et de Hochberg méthode pour contrôler le taux de fausse découverte15. Représente les journal-cotes que le miARN est différemment de la colonne B exprimés8.
Nous avons réalisé la miRNA cible filtre et core analyse qui inclut l’analyse de voie d’enrichissement. Après avoir téléchargé une liste de 14 miRNAswith le rapport de journal expression significative et la p-valeur, chacun d’eux ont été cartographiés par le filtre de cible de miRNA (tableau 3). Les résultats ont été filtrés et triés pour arriver à certaines voies, en l’occurrence l’immunoréaction « cellulaire ». L’analyse de base fourni des informations sur les voies canoniques, maladies et fonction, régulateurs et réseaux (tableau 4). Le logiciel d’analyse fonctionnelle produit une analyse de réseau qui montre la relation entre les miARN d’intérêt et d’autres molécules (Figure 3).
Figure 1 : Identification des étapes du cycle oestral. (A) pro-oestrus (cellules épithéliales principalement nucléés) ; (B) oestrus (principalement anucléée cornéocytaire cellules) ; (C) métoestrus (tous les trois types de cellules) ; et (D) dioestrus 2 (majorité des leucocytes). Echelle = 100 µm. grossissement = x 20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : résultats représentatifs de l’analyse fonctionnelle logiciel : filtre cible miRNA. Voir le profil complet des miARN à différents stades du cycle oestral. Après avoir effectué le filtre de miRNA, le logiciel fournit des listes détaillées des gènes et des composés impliqués dans les maladies et autres phénotypes, qui peuvent être le filtre et tri pour rejoindre certaines voies, dans ce cas « Réaction immunitaire cellulaire ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : résultats représentatifs de l’analyse fonctionnelle logiciel : réseaux. Comparaison des réseaux affectés par l’exposition aérienne ou l’ozone filtrée chez les femelles à des stades différents du cycle oestral. Diagramme de réseaux biologiques associées miARN dans les poumons des souris femelles exposées à l’air filtré par rapport à l’ozone dans le pro-oestrus (A) ou non-du proestrus stades (B). Ce chiffre a été modifié par Fuentes et al.,6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| ID | Acide nucléique (ng/µL) | A260/A280 | A260/A230 |
| Échantillon 1 | 1197.930 | 2.015 | 2.192 |
| Échantillon 2 | 1355.703 | 2.018 | 2.223 |
| Exemple 3 | 2178.104 | 2.020 | 2.163 |
| Exemple 4 | 1600.837 | 2.010 | 2.139 |
| Moyenne | 1583.144 ± 215 | 2.016 ± 0.002 | 2.179 ± 0.018 |
Tableau 1 : exemple des concentrations de RNA et ratios de l’absorbance à 260, 230 et 280 nm à partir des échantillons de tissus de poumon purifiées provenant de quatre souris. Les concentrations ont été mesurées avec un spectrophotomètre.
| logFC | t | P.Value | adj. P.Val | B | |
| MMU-miR-694 | 1,492 | 4.071 | 0.000153 | 0.009514 | 0,759 |
| MMU-miR-9-5 p | 0,836 | 3.916 | 0.000254 | 0.009514 | 0,289 |
| MMU-miR-221-3P | 0,385 | 3.106 | 0.003014 | 0.075361 | -1.982 |
| MMU-miR - 181d - 5p | 0,597 | 2.891 | 0.005516 | 0.103424 | -2.526 |
| MMU-miR-98-5p | 0,558 | 2.699 | 0.009243 | 0.138649 | -2.987 |
| MMU-miR-712-5p | 0,667 | 2.563 | 0.013169 | 0.164609 | -3.299 |
| MMU-miR - 106 a - 5p | -0.528 | -2.412 | 0.019278 | 0.206547 | -3.632 |
Tableau 2 : Leduc analyse des résultats pour les miARN différentiellement exprimés chez les femelles exposées à l’ozone vs . de l’air filtré dans la scène du proestrus.
| miARN ID | Observation 1 | Observation 1 | Observation 2 | Observation 2 |
| Rapport / Log expr | Valeur P | Rapport / Log expr | Valeur P | |
| MMU-miR-694 | 1,492 | 0.000153 | 0.543319208 | 0.0021385 |
| MMU-miR-9-5 p | 0,836 | 0.000254 | 0.677595421 | 0.004997439 |
| MMU-miR-221-3P | 0,385 | 0.003014 | ||
| MMU-miR - 181d - 5p | 0,597 | 0.005516 | 0.342276659 | 0.106467657 |
| MMU-miR-98-5p | 0,558 | 0.009243 | 0.455392799 | 0.034724699 |
| MMU-miR-712-5p | 0,667 | 0.013169 | ||
| MMU-miR - 106 a - 5p | -0.528 | 0.019278 |
Tableau 3 : exemple format pour multi-observation upload d’ensembles de logiciels d’analyse fonctionnelle de. Plusieurs expressions différentielles expérimentale peuvent être regroupées en une seule feuille de calcul et téléchargées, et que de nombreuses observations au besoin peuvent être ajoutées. Colonnes : ID de miARN 1) ; 2) observation 1 : Expr Log rapport ; 3) observation 1 : Valeur de P ; 4) observation 2 : Expr Log rapport ; 5) observation 2 : Valeur de P.
| Non-pro-oestrus | Pro-oestrus | ||||
| A. gènes ciblés par différentiellement exprimés miARN | |||||
| CAMK2N1 | PAFAH1B2 | SEC23A | ABCB9 | FGD4 | SLC25A27 |
| VOITURES | PDE4B | SNX5 | APOO | FRMD4B | SLC38A1 |
| CYP24A1 | PDE7A | SYT4 | ARHGEF38 | GPR137B | TMCC1 |
| DBF4 | PGM3 | THAP12 | AVEN | HMBS | TRIM71 |
| HMGN2 | PNP | TMED7 | CASP3 | METAP1 | XKR8 |
| KMT5A | REV1 | TNFAIP2 | CCNJ | MITF | ZCCHC11 |
| LRRC17 | RPS19BP1 | TNFRSF10C | CMTR2 | MYC | ZIM3 |
| MDH2 | RRAD | TP53 | CNMD | RGMB | ZNF181 |
| MIS18A | SEC62 | UBE2V2 | DSCR8 | SLC14A1 | |
| ZNF420 | |||||
| B. des différences dans le haut de la page maladies et biofunctions | |||||
| Maladies et troubles | Valeur P | Maladies et troubles | Valeur P | ||
| Maladie inflammatoire | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Anomalies et des blessures | 4.96E-02 - 2.77E-14 | ||
| Réponse inflammatoire | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Maladies de l’appareil reproducteur | 2.15E-02 - 2.77E-14 | ||
| Anomalies et des blessures | 4.17E-02 - 4.17E-05 | Cancer | 4.96E-02 - 1.27E-10 | ||
| C. le top fonctions moléculaires et cellulaires | |||||
| Fonctions moléculaires et cellulaires | P Valeur | Fonctions moléculaires et cellulaires | P Valeur | ||
| Développement cellulaire | 2.05E-02 - 5.26E-07 | Mouvement cellulaire | 3.77E-02 - 4.47E-07 | ||
| Compromis cellulaire | 3.75E-04 - 3.75E-04 | Survie et mort cellulaire | 4.91E-02 - 5.61E-06 | ||
| Cycle cellulaire | 2.62E-03 - 2.62E-03 | Développement cellulaire | 4.97E-02 - 1.38E-06 | ||
| D. haut développement de systèmes physiologiques et fonction | |||||
| Développement et la fonction | P Valeur | Développement et la fonction | P Valeur | ||
| Développement organismal | 4.17E-02 - 1.31E-03 | Développement embryonnaire | 3.30E-02 - 2.12E-05 | ||
| Développement embryonnaire | 1.29E-02 - 1.29E-02 | Fonction et le développement du tissu conjonctif | 1.79E-02 - 6.10E-05 | ||
| Fonction et le développement du tissu conjonctif | 1.93E-02 - 1.93E-02 | Morphologie tissulaire | 7.88E-05 - 7.88E-05 | ||
| E. Top liées fonctions réseau | |||||
| Fonctions réseau connexes | Score | Fonctions réseau connexes | Score | ||
| Développement cellulaire, maladie inflammatoire, réaction inflammatoire | Organismique blessures et malformations, maladies de l’appareil reproducteur, le cancer | ||||
| 6 | 19 | ||||
Tableau 4 : logiciel d’analyse fonctionnelle sommaire des femelles exposées à l’ozone dans le non-proestrus vs stade pro-oestrus. Le logiciel d’analyse fonctionnelle permet l’analyse des meilleurs voies canoniques, régulateurs en amont, maladies & fonctions, fonctions haut, réseaux effet régulateur et plus. Cette table a été modifiée de Fuentes et al.,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Profilage de microARN est une technique avantageuse pour diagnostic des maladies et recherches mécanistes. Dans ce manuscrit, nous avons défini un protocole visant à évaluer l’expression des miARN qui est prévus pour réguler les gènes inflammatoires dans les poumons des souris femelles exposées à l’ozone dans le cycle oestral différents stades. Méthodes pour la détermination du cycle oestral, telles que la méthode de détection visuelle, ont été décrits16. Cependant, ceux-ci s’appuient sur des mesures ponctuelles et ne sont donc pas fiables. Pour identifier avec précision toutes les étapes du cycle oestral chez les femelles qui régulièrement du cycle, la méthode décrite ici est recommandée. En outre, ce protocole simple peut aussi servir pour estimer indirectement les variations hormonales quotidiennes chez les souris. Pour éviter l’activation des réponses inflammatoires indésirables en raison de l’irritation vaginale, l’échantillonnage doit être effectué qu’une seule fois par jour. En raison de la variabilité dans la durée et des influences du logement, il est important d’effectuer le protocole durant deux ou trois cycles complets avant d’utiliser des animaux dans une expérience de l’étape de cycle.
Pour l’extraction réussie de l’ARN du tissu pulmonaire, une procédure précise est essentielle. Ce protocole décrit une méthode d’une journée pour isoler l’ARN du tissu pulmonaire qui donne qualité RNA. Modifications au protocole du fabricant devaient extraire efficacement des RNA de poumons. Nous avons ajouté une étape de centrifugation supplémentaires après l’addition de la mémoire tampon de lavage pour enlever autant de tampon que possible. Nous également élués RNA avec 35 µL d’eau exempte de DNase/RNase, centrifugation de la colonne pour 1,5 min garantir des niveaux de concentration élevée. Spectrofluorimètre résultats ont confirmé l’efficacité de notre protocole d’extraction d’ARN. Le rapport de l’absorbance à 260 et 280 nm (ratio A260/280) est fréquemment utilisé pour évaluer la pureté des préparations d’ARN. L’absorbance maximale pour les acides nucléiques est 260 et 280 nm, respectivement. Il est accepté comme « pure » de RNA si le ratio est d’environ 2,017. De même, pour le ratio A260/A230 d’absorbance à la contamination, les valeurs de pureté sont de l’ordre de 2,0 et 2,218. Dans cette étude, les ratios moyens de A260/A280 et A260/A230 observés étaient 2.016 ± 0,002 et 2,179 ± 0.018, respectivement (tableau 1). Par conséquent, notre protocole d’extraction d’ARN a été réussie. Un autre avantage du protocole utilisé est l’ajout du traitement DNAse. C’est important d’éviter la contamination de l’ADN génomique19. Une limitation de ce protocole d’isolement ARN est l’utilisation des colonnes de purification afin de jeter des déchets par précipitation à l’alcool parce que quelques débris de poumon peut gêner la membrane partiellement ou complètement, ce qui entraîne des rendements faibles. Aussi, si l’étape d’homogénéisation n’est pas effectuée avec soin, de grandes quantités de poumon RNA peuvent être facilement perdues ou dégradées. Si on obtient des rendements faibles de RNA, RNA peut être re-purifiée et élué dans un plus petit volume. RNA peut également être précipité de protocoles publiés durant la nuit suivante20.
Microarray technologies appliquées au profilage de miRNA sont des outils prometteurs dans de nombreux domaines de recherche. Dans notre étude, nous avons utilisé les tableaux PCR, qui offrent l’avantage de seuil de détection plus élevé et les stratégies de normalisation pour la détection des miARN différentiellement exprimés vs autres technologies telles que miRNA basée sur les tableaux21. Une limitation de ce protocole est qu’il exige un minimum de démarrage matériel RNA et disponibilité des ensembles spécifiques des amorces pour les miARN d’intérêt, par opposition à d’autres techniques disponibles telles que RNAseq. Un autre avantage des matrices basées sur la PCR est la possibilité d’utiliser des gènes de référence non-miRNA qPCR normalisation (par exemple les petits ARN nucléolaires ou SNORDs) pour calculer une expression différentielle des miARN. Enfin, l’utilisation de tableaux PCR fournit plusieurs options pour l’analyse des données, allant des outils en ligne fournis par les fabricants, aux méthodes conventionnelles pour détecter l’expression différentielle cependant de PCR en temps réel. D’analyse statistique Leduc est pratique pour les puces et les tableaux basées sur la PCR et utilise l’empirique Bayes animée fstatisitcs -22. Ici, nous montrons que les p-valeurs et q-(ajusté pour les tests multiples) peuvent être obtenu avec la commande toptable Ajustement du seuil de taux de fausse découverte et identification différentiellement exprimés miARN.
Logiciel d’analyse fonctionnelle est une application web pour l’analyse des données dans le contexte de la voie. Le logiciel donne aux chercheurs les capacités de recherche puissant qui peuvent aider aux ensembles de données de trame ou des objectifs spécifiques au contexte, au sein d’une image de plus grande importance biologique. Bien que l’environnement logiciel est flexible pour différents types d’analyse (c.-à-d., métabolomique, SNP, protéomique, microARN, toxicologie, etc.), notre but ici est de mettre en évidence les aspects de l’analyse de miRNA. Après avoir téléchargé une liste de 14 miARN avec une expression significative journal-ratios et les valeurs de p, tous ont été cartographiés par le logiciel. Nous avons réalisé la miRNA cible filtre et core analyse, qui inclut l’analyse de voie d’enrichissement. Toutefois, ces analyses considèrent les gènes pour lesquels le 14 miARN est prévus pour la cible et pas les miARN eux-mêmes. La section des résultats répertorie les sorties telles que : voies canoniques, de maladies et de fonction, de gènes ciblés par les miARN différentiellement exprimés, développement des systèmes physiologiques, régulateurs et réseaux (tableau 4). La visualisation de la voie est indiquée sous l’onglet réseau, où les miARN et molécules apparaissent comme des noeuds cliquables qui sont liés à l’information liée au gène d’intérêt (Figure 3). Un avantage du logiciel d’analyse fonctionnelle est la qualité lié au miRNA observé, y compris les interactions expérimentalement validées tant prédites. Les bases de données analyse fonctionnelle logiciel incluent : micro-ARN-ARNm validés expérimentalement interactions bases de données23,24, base de données de micro-ARN-ARNm prédit interaction avec des interactions de faible confiance exclus (par exemple, Scan de cible)25, homme validé expérimentalement, rat et souris micro-ARN-ARNm interactions bases de données (par exemple, miRecords)26et littérature conclusions (p. ex., axés sur les micro-ARN conclusions manuellement organisées de documents publiés les experts scientifiques). D’autres études comparant l’efficacité et la facilité d’utilisation des outils bioinformatiques pour analyser les voies associés à miRNA expression confirment l’efficacité de ce logiciel27. Méthodes dans l’ensemble, computational sont rentables et moins de temps et peuvent être facilement validées par des méthodes moléculaires. Avec la croissance constante et l’accumulation de données biomédicales, méthodes de bio-informatique devient plus en plus puissants dans la découverte des mécanismes de médiation miRNA des processus biologiques et la maladie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par des subventions de NIH K01HL133520 (PS) et K12HD055882 (PS). Les auteurs remercient Dr Joanna Floros pour l’aide avec les expériences d’exposition de l’ozone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7 mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10x and 20x objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21 G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50 mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μL reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
References
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J.
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
