Summary
Beschrijven we een eenvoudige methode voor snelle kwantificering van anorganische polyfosfaat in verschillende bacteriën, waaronder mycobacteriële, gram-negatieve en gram-positieve soorten.
Abstract
Anorganische polyfosfaat (poliep) is een biologische polymeer gevonden in de cellen in alle domeinen van het leven, en is vereist voor de virulentie en stressrespons bij vele bacteriën. Er zijn een aantal manieren om quantifying poliep in biologische materialen, waarvan vele zijn arbeidsintensief of ongevoelig, beperken hun nut. Wij presenteren hier een gestroomlijnde methode voor de kwantificering van de poliep in bacteriën, met behulp van een silica membraan kolom extractie geoptimaliseerd voor snelle verwerking van meerdere monsters, vertering van poliep met de poliep-specifieke exopolyphosphatase ScPPX, en detectie van de resulterende gratis fosfaat met een gevoelige ascorbinezuur gebaseerde colorimetrische test. Deze procedure is eenvoudig, goedkoop en betrouwbaar poliep kwantificering kan in verschillende bacteriesoorten. Wij presenteren representatieve poliep kwantificering van de gram-negatieve bacterie (Escherichia coli), de gram-positieve melkzuur-bacterie (Lactobacillus reuteri), en mycobacteriële soorten (Mycobacterium smegmatis). We voegen ook een eenvoudig protocol voor nikkel affiniteit zuivering van mg hoeveelheden van ScPPX, die nog niet commercieel beschikbaar.
Introduction
Anorganische polyfosfaat (poliep) is een lineaire biopolymeer van phosphoanhydride-linked fosfaat eenheden die wordt gevonden in alle domeinen van het leven1,2,3. In diverse bacteriën is poliep essentieel voor de stressrespons, beweeglijkheid, vorming van biofilms, celcyclus controle, antibioticaresistentie en virulentie4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studies van de poliep metabolisme in bacteriën dus het potentieel hebben om opbrengst fundamentele inzichten in het vermogen van bacteriën om te leiden tot ziekte en gedijen in uiteenlopende omgevingen. In veel gevallen zijn de methoden die beschikbaar zijn voor de kwantificering van de poliep in bacteriële cellen echter een beperkende factor in deze studies.
Er zijn verschillende methoden die momenteel gebruikt voor het meten van de poliep in biologische materialen. Deze methoden zijn gewoonlijk twee afzonderlijke stappen: uitpakken van de poliep en kwantificeren van de poliep presenteren in deze extracten. De huidige methode van de goudstandaard, ontwikkeld voor de gist Saccharomyces cerevisiae door Bru en collega's12, extracten poliep samen met DNA en RNA met behulp van fenol en chloroform, gevolgd door ethanol neerslag, behandeling met deoxyribonuclease (DNase) en ribonuclease (RNase), en de spijsvertering van de resulterende gezuiverde poliep met de S. cerevisiae poliep-vernederende enzym exopolyphosphatase (ScPPX)13 opbrengst gratis fosfaat, dat vervolgens wordt gekwantificeerd met behulp van een Malachiet groen-gebaseerd colorimetrische bepaling. Deze procedure is zeer kwantitatieve maar arbeidsintensief, beperking van het aantal monsters dat kan worden verwerkt in een één experiment, en is niet geoptimaliseerd voor bacteriële monsters. Anderen hebben gemeld poliep extraheren uit een verscheidenheid van cellen en weefsels met behulp van silica kralen ("glassmilk") of silica membraan kolommen6,14,15,16,17, 18. Deze methoden doen niet efficiënt uitgepakt korte keten poliep (minder dan 60 fosfaat eenheden)12,14,15, hoewel dit van minder belang voor bacteriën, die over het algemeen gedacht zijn te synthetiseren voornamelijk lange-keten poliep3. Oudere methoden van poliep extractie met behulp van sterke zuren19,20 zijn niet langer gebruikte, omdat de poliep is onstabiel onder zure omstandigheden12.
Er zijn ook een aantal gerapporteerde manieren om quantifying poliep. Onder de meest voorkomende is 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), een fluorescente kleurstof meer meestal gebruikt om de vlekken van DNA. DAPI-polyP complexen hebben verschillende fluorescentie excitatie en emissie-maxima dan DAPI-DNA complexen21,22, maar er is aanzienlijke inmenging van andere cellulaire componenten, met inbegrip van RNA, nucleotiden en inositol fosfaten12,15,16,23, vermindering van de specificiteit en de gevoeligheid van de poliep metingen die worden uitgevoerd met behulp van deze methode. U kunt ook poliep en adenosinedifosfaat (ADP) kunnen worden omgezet in adenosine trifosfaat (ATP) met behulp van gezuiverde Escherichia coli poliep kinase (PPK) en de resulterende ATP gekwantificeerd aan de hand van luciferase14,17 ,18. Dit maakt de de ontdekking van zeer kleine hoeveelheden van de poliep, maar vereist twee stappen van de enzymatische reactie en zowel luciferine en zeer zuiver ADP, die dure reagentia. ScPPX specifiek verteert poliep in gratis fosfaat6,12,13,24, die kan worden opgespoord met behulp van de eenvoudiger methoden, maar ScPPX wordt geremd door DNA en RNA12, noodzakelijk DNase en RNase behandelingvan poliep-bevattende extracten. Noch PPK en ScPPX niet commercieel beschikbaar, en PPK zuivering is relatief complexe25,26.
Poliep in cel lysates of uittreksels kan ook worden gevisualiseerd op polyacrylamide gels door DAPI negatieve kleuring27,28,29,30, een methode die beoordeling van ketenlengte wel toegestaan, maar is lage-doorvoer en slecht kwantitatieve.
Nu melden we een snelle, goedkope en middellange-doorvoer poliep assay waarmee snelle kwantificering van de poliep niveaus in verschillende bacteriesoorten. Deze methode begint met het lysing van bacteriële cellen bij 95 ° C in 4 M guanidine isothiocyanaat (GITC)14 om de inactivering van cellulaire fosfatasen genaamd, gevolgd door een silica membraan kolom extractie geoptimaliseerd voor snelle verwerking van meerdere monsters. Het resulterende poliep-bevattende extract wordt dan met een grote overmaat van ScPPX, eliminerend de behoefte aan DNase en RNase behandeling verteerd. We nemen een protocol voor eenvoudige nikkel affiniteit zuivering van mg hoeveelheden ScPPX. Ten slotte is de poliep afkomstige gratis fosfaat gekwantificeerd met een eenvoudige, gevoelige, ascorbinezuur-based colorimetrische bepaling24 en genormaliseerd naar totale cellulaire eiwit. Deze methode stroomlijnt de meting van de poliep in bacteriële cellen, en wij tonen het gebruik ervan met de representatieve soorten van gram-negatieve bacteriën, gram-positieve bacteriën en mycobacteriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het zuiveren van gist Exopolyphosphatase (ScPPX)
- Transformeer de E. coli eiwit overexpressie stam BL21(DE3)31 met plasmide pScPPX26 door electroporation32 of33van de chemisch te worden verwerkt.
- Inoculeer 1 L lysogenie Bouillon (LB) met 100 µg mL-1 ampicilline in een unbaffled kolf van 2 L met een één kolonie van BL21(DE3) met pScPPX2 en incubeer 's nachts bij 37 ° C zonder schudden, aan een absorptie bij 600 nm (een600) van ongeveer 0,3, uitgedrukt in een spectrofotometer.
- Start van de cultuur (180 rpm) schudden en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, gedurende welke tijd de cellen tot een A600 van 0,4 toenemen zal - 0,5.
- Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toevoegen om een eindconcentratie van 1 mM en een extra 100 µg mL-1 ampicilline en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C met schudden bij 180 t/min.
Opmerking: Dit protocol overexpressie genereert een grote hoeveelheid oplosbare ScPPX. Echter ScPPX overexpressie is zeer vergevingsgezind, en een verscheidenheid van andere gemeenschappelijke overexpressie EiwitProtocollen zijn gebruikt om met succes het zuiveren van ScPPX. - De cellen overbrengen in een fles 1 L centrifuge en oogst ze door centrifugeren gedurende 20 minuten bij 5000 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en de cel pellet overbrengen in een conische tube van 50 mL.
Opmerking: Cel pellets kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij-80 ° C. - De pellet op ijs ontdooien, dan het resuspendeer in 9 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl en 5 mM imidazool (pH 8) voor een totaal volume van ongeveer 10 mL.
- (Eindconcentraties) 1 mg lysozyme-1 mL, 2 mM MgCl2en 50 eenheden mL-1 voor een RNA - en DNA-vernederende endonuclease toevoegen (Zie Tabel van materialen) en incubeer gedurende 30 min op ijs.
Opmerking: ScPPX bindt nucleic zuren (gegevens niet worden weergegeven), zodat de nuclease behandeling is van essentieel belang tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. - Met behulp van een ultrasoonapparaat met een microtip (Zie Tabel of Materials), lyse de cellen door 2 cycli van ultrasoonapparaat op ijs op 50% kracht, pulserende 5 s op en 5 s af, met een 2 min rust tussen de cycli.
Opmerking: Gebruik juiste gehoorbescherming tijdens ultrasoonapparaat. Ook het geval met overexpressie, een scala aan cellysis methodes zijn aanvaardbaar voor de zuivering van de ScPPX. - Verwijderen van de onoplosbare puin door centrifugeren de lysate gedurende 20 minuten bij 20.000 x g bij 4 ° C. Filtreer het resulterende supernatant (ongeveer 10 mL) door een 0.8 µm porie-grootte celluloseacetaat spuit-filter.
- Laden de lysate op een chelaat kolom nikkel-betalen 5 mL (Zie Tabel van materialen) gebruik een peristaltische pomp of een grote injectiespuit.
- Spoel de kolom met 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazool (pH 8).
- Spoel de kolom met 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazool (pH 8).
- Elueer ScPPX met 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl en 0.5 M imidazool (pH 8), verzamelen 15 1 mL breuken. Test deze elutie breuken voor eiwit genoegen nemen met de Bradford eiwit assay34 (Zie Tabel van materialen) en uitvoeren van een SDS-pagina gel35 om te bevestigen welke breuken bevatten gezuiverde ScPPX (moleculair gewicht = 45 kDa).
- Zwembad de breuken met pure ScPPX en aanpassen van de concentratie van de gebundelde proteïne tot ongeveer 2 mg mL-1 met 50 mM HEPES en 0.5 M NaCl. Hogere eiwit concentraties kunnen neerslaan in de volgende stap.
- Wisselen de gezuiverde ScPPX in opslag buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, 10% [v/v] glycerol) door dialyse. Plaats van gebundelde ScPPX breuken in een verzegelde lengte van 12.000-14.000 Da molecuulgewicht cutoff dialyse membraan buizen (Zie Tabel van materialen) en schorten in 1 L voor opslag buffer met continu roeren bij 4 ° C voor ten minste 4 h. Herhaal deze stap met verse de buffer van de opslag voor een totaal van 3 buffer veranderingen.
- De gezuiverde, dialyzed eiwit overbrengen in een centrifugebuis of buizen en Centrifugeer gedurende 20 min bij 20.000 x g bij 4 ° C tot het verwijderen van eventuele onoplosbare aggregaten. Zorgvuldig overbrengen in het supernatant een schone 15 mL conische buis.
- Aanpassen van de concentratie van het gezuiverde ScPPX naar 1 mg mL-1 met opslag buffer, toevoegen van 0,1% (g/v) protease-vrije bovien serumalbumine (BSA; eindconcentratie), en de opslag voor maximaal 6 maanden bij 4 ° C.
Opmerking: ScPPX verliest meer dan 90% van haar activiteit wanneer het bevroren13.
2. oogsten monsters voor polyfosfaat extractie
- Groeien bacteriën onder de voorwaarden van belang voor het bepalen van de inhoud van de poliep. Voor dit protocol, Lactobacillus reuteri36 's nachts bij 37 ° C te groeien zonder schudden in malic enzym inductie (MEI) middellange37 zonder cysteïne (MEI-C).
- Oogst voldoende cellen door centrifugeren in een tube microcentrifuge 1,5 mL 50 – 100 µg cellulaire eiwit optellen (zie stap 3 hieronder). Voor E. coli, is dit 1 mL van een logboek fase cultuur op een A-600 van 0,2 - 0,4. Voor L. reuteriis dit 1 mL van een overnachting cultuur. Pas zo nodig voor andere soorten van belang.
- Verwijder het supernatant volledig uit de cel pellets.
- Resuspendeer de cel pellets in 250 µL van GITC lysis buffer (4 M guanidine isothiocyanaat, 50 mM Tris-HCl, pH 7) en lyse door incubatie bij 95 ° C gedurende 10 min. winkel lysates bij-80 ° C.
Opmerking: Verenigbaar met de lysis van de tijd, omdat uitgebreide broedtijd bij hoge temperatuur leiden aantasting van de poliep door hydrolyse38 tot kan. Lysates kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij-80 ° C.
Let op: Guanidine isothiocyanaat is een chaotropic-zout en moet worden behandeld met handschoenen en afgevoerd als gevaarlijk afval.
3. meten van het eiwitgehalte van cel Lysates
- Bereiden BSA normen met 0, 0.1, 0.2 en 0.4 mg mL-1 van BSA in GITC lysis-buffermengsel.
Opmerking: Het is belangrijk om de BSA-normen in GITC, want GITC de ontwikkeling van de kleur van de analyse van Bradford beïnvloedt. BSA normen kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij-20 ° C. - Aliquot 5 µL van ontdooide, goed gemengde cel lysates en BSA normen te scheiden van putten in een duidelijk 96-wells-plaat.
- 195 µL van Bradford reagens34 toevoegen aan elk putje en meten van de absorptie bij 595 nm (een595) in een afleesapparaat (Zie Tabel van materialen).
- Berekenen van de hoeveelheid eiwit in elk putje door vergelijking met de standaard curve van de BSA, met behulp van de formule y = mx + b, waarbij y is een595, x µg BSA, m is de helling van de standaard curve, en b is het y-snijpunt van de standaard curve. De resulterende waarde met 0.05 om te bepalen van de totale mg van eiwitten in elk monster vermenigvuldigen.
4. wordt uitgepakt polyfosfaat
- Voeg toe 250 µL ethanol 95% aan elke steekproef lysed van GITC en vortex te mengen.
- Dat mengsel toepassen in een silica membraan spin kolom en centrifuge voor 30 s bij 16.100 x g.
- Gooi de doorstroming, dan Voeg 750 µL van 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% ethanol en centrifuge voor 30 s bij 16.100 x g.
- De doorstroming en Centrifugeer gedurende 2 min bij 16.100 x g negeren.
- Plaats van de kolom in een schone 1,5 mL microfuge buis en voeg 150 µL van 50 mM Tris-HCl (pH 8).
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, dan poliep Elueer door gedurende 2 minuten bij 8.000 x g centrifugeren.
Opmerking: Indien gewenst, de eluaten kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende ten minste 1 week.
5. verteren polyfosfaat
- Met 0, 5, 50 of 200 µM kalium fosfaat in 50 mM Tris-HCl (pH 8) normen voor te bereiden.
Opmerking: Kalium fosfaat normen kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur. - Aliquot 100 µL van elke standaard fosfaat en uitgepakt poliep monsters in aparte putjes van een duidelijk 96-wells-plaat.
- Voorbereiding van een master mix met (per monster): 30 µL van 5 x ScPPX reactie-buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2250 mM ammoniumacetaat, pH 7.5)13, 19 µL van H2O en 1 µL van gezuiverde ScPPX (1 mg mL-1).
- Voeg 50 µL van de master mix aan elk putje van de 96-wells-plaat. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
Opmerking: Indien gewenst, het verteerd poliep monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor onbepaalde tijd.
6. opsporen van gratis fosfaat24
- Bereid detectie oplossing basis door ontbinding 0,185 g van antimoon kaliumtartraat in 200 mL water, dus het toevoegen van 150 mL 4 N H24, vervolgens toe te voegen 1,49 g van ammoniumnitraat heptamolybdate. Roer om los en breng tot een eindvolume van 456 mL. Filtreer de oplossing voor het verwijderen van deeltjes en opslaan beschermd tegen licht bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
- Voorbereiden van een stamoplossing van 1 M ascorbinezuur. Winkel beschermd tegen licht bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
- Bereid een verse voorraad van de werken van detectie oplossing elke dag door het mengen van detectie basis 9.12 mL met 0.88 mL 1 M ascorbinezuur. Toestaan dat de detectie-oplossing om te komen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
- 50 µL van detectie oplossing toevoegen aan elk monster en de standaard in de 96-wells-plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 2 minuten om ontwikkeling van de kleur.
- Meten van de absorptie bij 882 nm met een afleesapparaat en bereken de concentratie van de fosfaat van elk monster in vergelijking tot de kalium fosfaat standaard curve.
Let op: De detectie-oplossing bevat giftige zouten en sterke zuren. Draag handschoenen en behandelen van overtollige oplossing als giftig afval.
7. berekening van de cellulaire polyfosfaat inhoud
- Converteren van de concentraties van de fosfaat bepaald in stap 6.5 aan nanomoles van de poliep afkomstige fosfaat in elke hele cel lysate volgens de volgende formule:
nmol poliep = 1.5 x (µM fosfaat / 10)
Opmerking: De standaard curve gebaseerde methode in stap 6, bepaalt de concentratie van fosfaat (in µM) in elk 100 µL poliep monster aliquoted in stap 5.2. Deze concentratie om om te zetten een aantal nmol, 100 µL wordt gedeeld door 106 te geven van een volume in L, vermenigvuldigd met de concentratie (µmol L-1) en vervolgens vermenigvuldigd met 1.000 (het aantal nmol in een µmol). Dit reduceert tot de concentratie te delen door 10. Het volume van de totale extract bereid in stap 4 is 150 µL, dus het is noodzakelijk om te vermenigvuldigen de resulterende waarde met 1,5 voor de berekening van de nmol van fosfaat aanwezig in het hele extract. - Normaliseren cellulaire poliep inhoud aan totale cellulaire eiwit door nmol poliep te delen door de totale proteïne van mg in elk monster bepaald in stap 3.4. Poliep niveaus zijn uitgedrukt in termen van de concentratie van individuele poliep afkomstige gratis fosfaat.
Opmerking: In sommige gevallen kan het bedrag van de poliep afkomstige fosfaat aanwezig in een monster vallen buiten het lineaire bereik van de standaard curve van fosfaat (stap 6.5). Als de niveaus van de poliep erg hoog zijn, kan het overtollige poliep-bevattende eluaat uit stap 4.6 verdunde 1:10 of 1:100, als dit nodig is, en vervolgens gemeten opnieuw zoals beschreven in stappen 5 t/m 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De belangrijkste stappen van het protocol zijn routerplan in vereenvoudigde vorm in Figuur 1.
Om aan te tonen het gebruik van dit protocol met gram-negatieve bacteriën, wild-type E. coli was MG165539 uitgegroeid tot halverwege log fase in de rijke medium LB bij 37 ° C met schudden (200 rpm), vervolgens gespoeld en een extra 2 h in ge¨ uncubeerd morpholinopropanesulfonate-gebufferd (MOPS) minimaal middellange40 met 4 g L-1 glucose en 0.1 mM K2HPO4, een aandoening die bekend staat voor het opwekken van de productie van de poliep14,29. Zoals blijkt uit figuur 2A, ontdekt wij geen poliep in wild-type E. coli geteeld in LB en 192 ± 14 (gemiddelde ± standaardafwijking [SD]) nmol poliep mg-1 totaal eiwit in MOPS, overeenstemming met vorige verslagen14,29 . Zoals verwacht, een ∆ppk mutant6, welke gebreken poliep kinase41, geproduceerd geen poliep in ofwel medium, een ∆ppx mutant6, dat exopolyphosphatase42 mist, ongeveer dezelfde hoeveelheid geproduceerd Poliep als de wild-type, en een ∆phoB mutant29, die defect in fosfaat vervoer is, geproduceerd aanzienlijk minder poliep dan de wild-type14,29,43.
Het gebruik van dit protocol met gram-positieve bacteriën, wild-type L. reuteri te demonstreren ATCC PTA 647536 en een isogene ppk1 null mutant ontbreekt poliep kinase, gebouwd met behulp van oligo-geleide recombineering44, waren 's nachts in MEI-C bij 37 ° C zonder gekweekt schudden. Zoals aangetoond in figuur 2B, het wild-type geaccumuleerde 51 ± 6 nmol poliep mg-1 totaal eiwit onder deze omstandigheden, terwijl de mutant ppk1 minder dan de helft van dit bedrag bevat. L. reuteri bevat een tweede poliep kinase, gecodeerd door de ppk2 gen45, die vermoedelijk de rekeningen voor de poliep in het ppk1 null mutant presenteren.
Om aan te tonen het gebruik van dit protocol met mycobacteriën, was Mycobacterium smegmatis stam SMR546 gegroeid tot halverwege log fase in Hartmans-de Bont (HdB) middellange47, dan gespoeld en verdunde vijfvoudige in HdB of HdB met 2% ethanol. Deze culturen waren dan 's nachts geïncubeerd bij 37 ° C met schudden (180 rpm). Zoals aangegeven in figuur 2C, in de afwezigheid van ethanol, geaccumuleerde M. smegmatis 141 ± 52 nmol poliep mg-1 totaal eiwit, terwijl ethanol behandeling in een drievoudige verhoging tot 437 ± 102 nmol poliep mg-1 totaal eiwit resulteerde. Dit resultaat werd verwacht, omdat ethanol is eerder gemeld te verheffen poliep niveaus in M. smegmatis48.
Figuur 1: Diagram van polyfosfaat extractie en meting procedure. De essentiële stappen van de poliep kwantificering protocol worden geïllustreerd. Pellets van de bacteriële cel zijn lysed bij 95 ° C in GITC (guanidine isothiocyanaat). Kleine porties van de lysates zijn vehiculumcontrolegroep eiwitgehalte met behulp van de analyse van Bradford. Poliep is geëxtraheerd met behulp van silica membraan kolommen en vervolgens verteerd met ScPPX. De resulterende gratis fosfaat is gekwantificeerd aan de hand van de bepaling van ascorbine zuur. Totale poliep afkomstige fosfaat is genormaliseerd naar totale proteïne voor elk monster. Een595 = absorptie bij 595 nm; Een882 = absorptie bij 882 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger resultaten met verschillende bacteriën. (A) E. coli MG1655 wild-type en isogene ∆ppken ∆ppx∆phoB mutanten werden gekweekt bij 37 ° C met schudden (200 rpm) op een600 = 0,2 - 0,4 in rijke LB medium (zwarte cirkels) en klik vervolgens verschoven naar minimaal medium (MOPS met 4 g L-1 glucose en 0.1 mM K2HPO4) voor 2 h (witte cirkels; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC PTA 6475 (cirkels) en een isogene ppk1 null mutant (driehoeken) werden 's nachts gekweekt bij 37 ° C in de MEI-C medium zonder schudden (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 werd gekweekt bij 37 ° C met schudden (180 rpm) op een600 = 1 in HdB medium met (gesloten vierkanten) of zonder (open velden) 2% ethanol (n = 3, ± SD). Poliep niveaus zijn uitgedrukt in termen van de concentratie van individuele poliep afkomstige gratis fosfaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven vereenvoudigt en versnelt de kwantificering van de poliep niveaus in diverse bacteriën, met een typische set 24 monsters nemen ongeveer 1,5 h volledig verwerken. Dit maakt snelle screening van monsters en analyse van de mutant Bibliotheken, en vereenvoudigt de kinetische experimenten voor het meten van de accumulatie van poliep na verloop van tijd. We hebben aangetoond dat het protocol effectief op vertegenwoordigers van drie verschillende stammen werkt: proteobacteria, firmicutes, en Straalzwammen, die zijn berucht voor hun veerkrachtig, moeilijk lyse van de celwand49.
Detectie van de poliep door spijsvertering met ScPPX is specifieker en gevoeliger dan fluorescentie detectie met DAPI, en is goedkoper en meer technisch eenvoudig dan conversie van poliep naar ATP met behulp van PPK. Hoewel ScPPX wordt geremd door DNA en RNA12, hebben we dit met behulp van een zeer grote overmaat van enzym (1 µg per monster) om de volledige spijsvertering zelfs in bacteriën met meer dan 6000 nmol poliep mg-1 eiwit29overwonnen. Andere gepubliceerde methoden gebruik 10 tot 15 ng van ScPPX per reactie12,24. Ons protocol voor ScPPX zuivering levert doorgaans meer dan 5 mg pure ScPPX per liter overexpressie cultuur, die voldoende is voor meer dan 5.000 testen. Wij hebben geconstateerd dat verscheidene verschillende protocollen voor nikkel-affiniteit zuivering van eiwitten zijn-gelabeld werken goed te zuiveren van ScPPX overexpressie van pScPPX2 (gegevens niet worden weergegeven), en er is een grote verscheidenheid van dergelijke drukmeter om bij labs met variërende protocollen technische capaciteiten.
Eerdere protocollen met behulp van ScPPX spijsvertering voor detectie van de poliep hebben vaak vertrouwd op Malachiet groen gebaseerde colorimetrische testen te kwantificeren gratis fosfaat6,12. Deze testen zijn gevoelige, maar meestal vereisen zorgvuldig getimede sequentiële toevoeging van twee of drie afzonderlijke reagentia om nauwkeurige metingen24,50,51. De ascorbinezuur gebaseerde detectiesysteem gebruikte hier24 heeft een grotere lineaire reeks detectie dan Malachiet groen zonder verlies van gevoeligheid, gaat alleen om toevoeging van een enkele reagens, en vereist geen precieze timing.
Er zijn verschillende stappen die essentieel voor het succes van dit protocol zijn. Eerste, bacteriële monsters moeten worden lysed in GITC onmiddellijk na de oogst, om ervoor te zorgen dat poliep niveaus niet na de tijd van bemonstering wijzigen en snel inactivering van cellulaire fosfatasen genaamd. Ten tweede, niet broeden GITC lysates bij 95 ° C gedurende meer dan 10 min, en bewaar ze onmiddellijk daarna bij-80 ° C te minimaliseren mogelijk poliep hydrolyse. Derde, wees voorzichtig met het pipetteren monsters in 96-wells-platen voor eiwit of fosfaat metingen niet te spatten of druppelen iets uit een monster in een andere. De colorimetrische bepalingen, met name voor fosfaat, zijn zeer gevoelig en kleine hoeveelheid verontreiniging kunnen sterk vertekenen de resultaten. Ten slotte hebben sommige in dit protocol (dat wil zeggen ScPPX, detectie oplossing) gebruikte reagentia plank leven beperkt. Bereiden van verse ScPPX elke 6 maanden en vers detectie oplossing elke maand.
Een beperking van onze werkwijze is dat kiezelzuur kolommen niet poliep minder dan 60 fosfaat eenheden lang heel goed12,14,15 binden. Hoewel bacteriën meestal meestal lange-keten poliep3 synthetiseren, raden we voorbereidende experimenten met behulp van polyacrylamide-gel elektroforese27,30 te beoordelen ketenlengte in een bepaalde bacteriesoorten voordat u onze procedure. Voor de soorten waar korte keten poliep een aanzienlijk deel van de poliep zwembad maakt, ons protocol is niet geschikt en wij adviseren poliep uitpakken met een verschillende methode (bijvoorbeeld, fenol-chloroform extractie12), en zou ook adviseren ter aanvulling van de ScPPX spijsvertering met verkrijgbare S. cereviseae heeft pyrophosphatase (PPA1)24, aangezien ScPPX niet pyrofosfaat13 en dit verteren doet een verhoudingsgewijs invloed op de metingen van kortere-keten Poliep. Als alternatief voor ScPPX, zure hydrolyse38 kan worden gebruikt om het hydrolyseren poliep om fosfaat vrij, maar dit vereist extra DNase, RNase en zuivering stappen om ervoor te zorgen dat alleen op de poliep afkomstige fosfaat werd wordt gemeten. In sommige gevallen is het wellicht nuttig om een alternatieve extractiemethode gebruiken om te testen of de efficiëntie van de poliep extractie met GITC tussen stammen of voorwaarden, met name met bacteriën bekend varieert dat dikke celwand, zoals mycobacteriën. Als de niveaus van de poliep onder de limiet van detectie van deze bepaling zijn belangrijk voor de studies van een bepaalde soort, wellicht gebruik van een verschillende detectie-schema, zoals het gebruik van PPK poliep omzetten in ATP, die kan worden opgespoord met behulp van uiterst gevoelig verkrijgbare luciferase gebaseerde testen14,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door de Universiteit van Alabama in Birmingham departement microbiologie opstarten middelen en NIH grant R35GM124590 (naar MJG) en NIH subsidie R01AI121364 (FW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
| lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
| 5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
| nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
| 0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
| hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
| potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
| glucose | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
| manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
| Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
| ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
References
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
- Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
- Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
- Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
- Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
- Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
- Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
- Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
- Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
- Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
- Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
- Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
- Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
- Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
- Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
- Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
- Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
- Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
- Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
- Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
- Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
- Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
- Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
- Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
- Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
- Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F.
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
- Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
- van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
- Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
- Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
- Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
- Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
- Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S.
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).
