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Immunology and Infection

बैक्टीरिया में अकार्बनिक Polyphosphate के लिए परख

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58818
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Summary

हम विविध जीवाणुओं में अकार्बनिक polyphosphate के तीव्र ठहराव के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें ग्राम-ऋणात्मक, चना-धनात्मक, और माइक्रोबैक्टीरियल प्रजातियाँ शामिल हैं.

Abstract

अकार्बनिक polyphosphate (जंतु) एक जैविक बहुलक जीवन के सभी डोमेन से कोशिकाओं में पाया जाता है, और कई बैक्टीरिया में डाह और तनाव प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है । जैविक सामग्री में जंतु को बढ़ाता है, जिनमें से कई या तो श्रम-गहन या असंवेदनशील हैं, उनकी उपयोगिता सीमित करने के लिए तरीकों की एक किस्म है । हम यहां बैक्टीरिया में जंतु ठहराव के लिए एक सुव्यवस्थित विधि, कई नमूनों की तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित एक सिलिका झिल्ली स्तंभ निष्कर्षण का उपयोग कर, जंतु के पाचन के साथ जंतु विशिष्ट exopolyphosphatase ScPPX, और का पता लगाने के लिए प्रस्तुत एक संवेदनशील ascorbic एसिड आधारित वर्णमिति परख के साथ मुक्त फॉस्फेट परिणामस्वरूप । यह प्रक्रिया सीधी, सस्ती है, और विविध जीवाणु प्रजातियों में विश्वसनीय जंतु ठहराव की अनुमति देता है । हम ग्राम-नकारात्मक जीवाणु (ई कोलाई), ग्राम पॉजिटिव लैक्टिक एसिड जीवाणु (लैक्टोबैसिलसreuteri), और माइक्रोबैक्टीरियल प्रजातियों (माइकोबैक्टीरियम smegmatis) से प्रतिनिधि जंतु ठहराव वर्तमान । हम भी ScPPX, जो वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है की मिलीग्राम की मात्रा के निकल अपनत्व शुद्धिकरण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल शामिल हैं ।

Introduction

अकार्बनिक polyphosphate (जंतु)1,2,3जीवन के सभी डोमेन में पाया जाता है कि phosphoanhydride-लिंक्ड फॉस्फेट इकाइयों की एक रैखिक जैव बहुलक है । विविध जीवाणुओं में, जंतु तनाव प्रतिक्रिया, गतिशीलता, फिल्म गठन, सेल चक्र नियंत्रण, एंटीबायोटिक प्रतिरोध, और डाह4,5,6,7,8 के लिए आवश्यक है ,9,10,11. जीवाणुओं में जंतु चयापचय का अध्ययन इसलिए बैक्टीरिया की क्षमता में बुनियादी अंतर्दृष्टि उपज की क्षमता के लिए रोग का कारण है और विविध वातावरण में पनपे । कई मामलों में, तथापि, बैक्टीरियल कोशिकाओं में जंतु को बढ़ाता है के लिए उपलब्ध तरीकों इन अध्ययनों में एक सीमित कारक हैं ।

वहां कई वर्तमान में जैविक सामग्री में जंतु के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया तरीके हैं । इन पद्धतियों आम तौर पर दो अलग कदम शामिल: जंतु निकालने और उन निष्कर्षों में जंतु मौजूद बढ़ाता है । वर्तमान सोने के मानक विधि, द्वारा खमीर Saccharomyces cerevisiae के लिए विकसित बरू और सहयोगियों12, अर्क जंतु डीएनए और आरएनए के साथ साथ phenol और क्लोरोफॉर्म का उपयोग, इथेनॉल वर्षण के बाद, उपचार के साथ deoxyribonuclease (DNase) और ribonuclease (RNase), और एस cerevisiae जंतु अपमानजनक एंजाइम exopolyphosphatase (ScPPX)13 उपज के लिए नि: शुल्क फॉस्फेट, जो फिर एक का उपयोग कर quantified है के साथ परिणामी शुद्ध जंतु के पाचन मैलाकाइट ग्रीन आधारित वर्णमिति परख । इस प्रक्रिया को अत्यधिक मात्रात्मक लेकिन श्रम गहन है, नमूनों की संख्या है कि एक ही प्रयोग में संसाधित किया जा सकता है सीमित है, और जीवाणु नमूनों के लिए अनुकूलित नहीं है । दूसरों कोशिकाओं और सिलिका मोतियों का उपयोग ऊतकों की एक किस्म से निकालने जंतु की सूचना दी है ("glassmilk") या सिलिका झिल्ली कॉलम6,14,15,16,17, 18. इन तरीकों कुशलतापूर्वक लघु श्रृंखला जंतु (कम से ६० फॉस्फेट इकाइयों)12,14,15, हालांकि इस बैक्टीरिया है, जो आम तौर पर मुख्य रूप से संश्लेषित करने के लिए सोचा है के लिए कम चिंता का विषय है निकालने नहीं है लंबी श्रृंखला के जंतु3. जंतु निष्कर्षण मजबूत एसिड19,20 का उपयोग कर के पुराने तरीकों अब व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं, के बाद से जंतु अंलीय12शर्तों के तहत अस्थिर है ।

वहां भी जंतु को बढ़ाता है के लिए रिपोर्ट तरीकों की एक किस्म है । सबसे आम में 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), एक फ्लोरोसेंट डाई अधिक आम तौर पर डीएनए दाग के लिए इस्तेमाल किया है । DAPI-जंतु परिसरों में DAPI-डीएनए कॉम्प्लेक्स की तुलना में विभिन्न प्रतिदीप्ति उत्तेजना और उत्सर्जन maxima है21,22, लेकिन आरएनए, न्यूक्लियोटाइड, और inositol सहित अन्य सेलुलर घटकों से काफी हस्तक्षेप है 12,15,16,23फॉस्फेट, विशिष्टता और इस पद्धति का उपयोग कर बनाया जंतु माप की संवेदनशीलता को कम करने. वैकल्पिक रूप से, जंतु और adenosine diphosphate (ADP) adenosine ट्राइफॉस्फेट में परिवर्तित किया जा सकता है (एटीपी) का उपयोग कर शुद्ध ई कोलाई जंतु कळेनासे (PPK) और जिसके परिणामस्वरूप एटीपी quantified का उपयोग कर luciferase14,17 ,18. यह जंतु की बहुत छोटी मात्रा का पता लगाने की अनुमति देता है, लेकिन दो एंजाइमी प्रतिक्रिया कदम की आवश्यकता है और दोनों luciferin और बहुत शुद्ध ADP, जो महंगे रिएजेंट हैं । ScPPX विशेष रूप से मुक्त फॉस्फेट6,12,13,24में जंतु पचा, जो सरल तरीकों का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है, लेकिन ScPPX डीएनए और आरएनए12से हिचकती है, necessitating DNase और जंतु-युक्त अर्क के RNase उपचार. न तो PPK और न ही ScPPX व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और PPK शुद्धि अपेक्षाकृत25,26जटिल है ।

सेल lysates या अर्क में जंतु भी DAPI नकारात्मकदाग27,28,29,30, एक विधि है कि श्रृंखला की लंबाई के आकलन की अनुमति करता है द्वारा polyacrylamide जैल पर visualized किया जा सकता है, लेकिन है कम प्रवाह और खराब मात्रात्मक ।

अब हम एक तेजी से, सस्ती, मध्यम प्रवाह जंतु परख कि विविध जीवाणु प्रजातियों में जंतु स्तर के तेजी से ठहराव की अनुमति देता है की रिपोर्ट । इस विधि से शुरू होता है lysing बैक्टीरियल सेल ९५ ° c में 4 M guanidine isothiocyanate (GITC)14 सेलुलर phosphatases को निष्क्रिय करने के लिए, एक सिलिका झिल्ली स्तंभ निष्कर्षण द्वारा कई नमूनों की तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित. परिणामस्वरूप जंतु युक्त निकालने तो ScPPX के एक बड़े अतिरिक्त के साथ पच जाता है, DNase और RNase उपचार की जरूरत को नष्ट करने. हम ScPPX की मिलीग्राम की मात्रा का सीधा निकल अपनत्व शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल हैं । अंत में, जंतु व्युत्पंन मुक्त फॉस्फेट एक सरल, संवेदनशील, ascorbic एसिड आधारित वर्णमिति परख24 और कुल सेलुलर प्रोटीन को सामान्यीकृत के साथ quantified है । यह विधि बैक्टीरियल कोशिकाओं में जंतु के माप को सुव्यवस्थित करती है, और हम ग्राम-नकारात्मक जीवाणुओं, चने-पॉजिटिव बैक्टीरिया, और आइसोलेटों की प्रतिनिधि प्रजातियों के साथ इसके प्रयोग का प्रदर्शन करते हैं.

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Protocol

1. शुद्ध खमीर Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. electroporation३२ या रासायनिक परिवर्तन३३द्वारा प्लाज्मिड pScPPX26 के साथ ई. कोलाई प्रोटीन व्यक्त तनाव BL21 (DE3)31 रूपांतरण ।
  2. lysogeny शोरबा के 1 एल Inoculate (पौंड) युक्त १०० µ जी एमएल-1 एम्पीसिलीन एक 2 एल चकित कुप्पी में BL21 (DE3) युक्त pScPPX2 की एक कॉलोनी के साथ और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात गर्मी मिलाते बिना, एक अवशोषक के लिए ६०० एनएम (एक६००) में लगभग ०.३, के रूप में एक spectrophotometer में मापा ।
  3. संस्कृति मिलाते शुरू (१८० rpm) और ३७ डिग्री सेल्सियस, जो समय के दौरान कोशिकाओं ०.४-०.५ के एक६०० के लिए विकसित होगा पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  4. 1 मिमी और एक अतिरिक्त १०० µ जी एमएल-1 एम्पीसिलीन के अंतिम एकाग्रता के लिए isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) जोड़ें, तो १८० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए मशीन ।
    नोट: यह एक्सप्रेस प्रोटोकॉल घुलनशील ScPPX की एक बड़ी राशि उत्पन्न करता है । हालांकि, ScPPX बहुत ही क्षमा है, और अंय आम प्रोटीन की एक किस्म है एक्सप्रेस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक ScPPX शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
  5. एक 1 L केंद्रापसारक बोतल करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर ५००० x g पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा उंहें फसल । supernatant निकालें और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए सेल गोली हस्तांतरण ।
    नोट: सेल छर्रों-८० डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  6. बर्फ पर गल गोली, तो यह ५० mm HEPES, ०.५ एम NaCl के 9 मिलीलीटर में resuspend, और 5 मिमी imidazole (पीएच 8) के बारे में 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए ।
  7. जोड़ें (अंतिम सांद्रता) 1 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 lysozyme, 2 मिमी MgCl2, और ५० इकाइयों एमएल-1 एक आरएनए के-और डीएनए-अपमानजनक endonuclease ( सामग्री की तालिकादेखें) और बर्फ पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: ScPPX बांधता न्यूक्लिक एसिड (डेटा नहीं दिखाया गया है), तो nuclease उपचार शुद्धि के दौरान आवश्यक है ।
  8. एक microtip के साथ एक sonicator का प्रयोग ( सामग्री की तालिकादेखें), ५०% बिजली पर बर्फ पर sonication के 2 चक्र द्वारा कोशिकाओं को लाइसे, 5 एस पर और 5 एस स्पंदन, चक्र के बीच एक 2 मिनट के आराम के साथ ।
    नोट: sonication के दौरान उचित श्रवण सुरक्षा का उपयोग करें । इसी प्रकार से इस मामले को व्यक्त करने के लिए, सेल lysis तरीकों की एक किस्म ScPPX शुद्धि के लिए स्वीकार्य हैं ।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर २०,००० x g पर 20 मिनट के लिए lysate केंद्रापसारक द्वारा अघुलनशील मलबे को हटा दें । एक ०.८ µm ताकना आकार फाइबर एसीटेट सिरिंज फिल्टर के माध्यम से परिणामी supernatant (लगभग 10 मिलीलीटर) फ़िल्टर ।
  10. एक निकल-चार्ज 5 मिलीलीटर chelating कॉलम पर lysate लोड ( सामग्री की तालिकादेखें) या तो एक सिकुड़नेवाला पंप या एक बड़ी सिरिंज का उपयोग कर ।
  11. ५० एमएल के साथ कॉलम कुल्ला ५० मिमी HEPES, ०.५ मीटर NaCl, 5 मिमी imidazole (पीएच 8) ।
  12. ५० एमएल के साथ कॉलम कुल्ला ५० मिमी HEPES, ०.५ मीटर NaCl, 20 मिमी imidazole (पीएच 8) ।
  13. Elute ScPPX के साथ ५० मिमी HEPES, ०.५ मीटर NaCl, और ०.५ मीटर imidazole (पीएच 8), १५ १-एमएल अंशों का संग्रह । टेस्ट ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख३४ के साथ प्रोटीन सामग्री के लिए इन रेफरेंस अंशों ( सामग्री की तालिकादेखें) और एक एसडीएस-पृष्ठ जेल३५ चलाने की पुष्टि करें जो अंश शुद्ध ScPPX (आणविक वजन = ४५ केडीए) होते हैं ।
  14. पूल शुद्ध ScPPX युक्त अंशों और के बारे में 2 मिलीग्राम एमएल-1 ५० mM HEPES और ०.५ M NaCl के साथ करने के लिए परित प्रोटीन की एकाग्रता समायोजित करें । उच्च प्रोटीन सांद्रता अगले चरण में तेज़ हो सकती है ।
  15. शुद्ध ScPPX भंडारण बफर में विनिमय (20 mm Tris-HCl [pH ७.५], ५० mm KCl, 10% [v/v] ग्लिसरॉल) डायलिसिस द्वारा । १२,०००-१४,००० डीए आणविक वजन कटऑफ डायलिसिस झिल्ली टयूबिंग ( सामग्री की तालिकादेखें) और 1 एल में 4 डिग्री सेल्सियस पर सतत सरगर्मी के साथ भंडारण बफर के १ L में निलंबित की एक सील लंबाई में जगह ScPPX के लिए कम से 4 h. दोहराएं इस कदम के साथ ताजा 3 बफ़र परिवर्तन की कुल के लिए संग्रहण बफ़र ।
  16. एक केंद्रापसारक ट्यूब या ट्यूबों के लिए शुद्ध, dialyzed प्रोटीन हस्तांतरण और २०,००० x g पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर के लिए किसी भी अघुलनशील समुच्चय को दूर करने के लिए केंद्रापसारक । सावधानी से supernatant एक साफ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  17. शुद्ध ScPPX की एकाग्रता को समायोजित करने के लिए 1 मिलीग्राम एमएल- भंडारण बफर के साथ 1, जोड़ें ०.१% (डब्ल्यू/वी) को छेड़ो-मुक्त गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA; अंतिम एकाग्रता), और 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    नोट: ScPPX अपनी गतिविधि के ९०% से अधिक खो देता है जब यह13जमे हुए है ।

2. Polyphosphate निष्कर्षण के लिए कटाई के नमूने

  1. जंतु सामग्री के निर्धारण के लिए ब्याज की शर्तों के तहत बैक्टीरिया बढ़ें । इस प्रोटोकॉल के लिए, cysteine (मेई-सी) बिना मैलिक एंजाइम प्रेरण (मेई) मध्यम३७ में मिलाते हुए बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात लैक्टोबैसिलस reuteri३६ बढ़ने ।
  2. फसल एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में केंद्रापसारक द्वारा पर्याप्त कोशिकाओं को कुल ५०-१०० सेलुलर प्रोटीन के µ जी (नीचे चरण 3 देखें) । ई. कोलाईके लिए, यह एक लॉग चरण संस्कृति की 1 मिलीलीटर ०.२-०.४ की एक६०० में है । एल reuteriके लिए, यह एक रात संस्कृति के 1 मिलीलीटर है । के रूप में ब्याज की अंय प्रजातियों के लिए आवश्यक समायोजित करें ।
  3. सेल छर्रों से supernatant को पूरी तरह से हटा दें ।
  4. GITC lysis बफर के २५० µ एल में सेल छर्रों resuspend (4 एम guanidine isothiocyanate, ५० मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 7) और लाइसे 10 मिनट के लिए ९५ ° c पर मशीन द्वारा-८० ° c. Store lysates.
    नोट: lysis समय के साथ संगत हो, उच्च तापमान पर बढ़ाया गर्मी के बाद से hydrolysis३८द्वारा जंतु के क्षरण में परिणाम हो सकता है । Lysates-८० डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
    चेतावनी: Guanidine isothiocyanate एक chaotropic नमक है और दस्ताने के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए और के रूप में खतरनाक कचरे का निपटारा ।

3. कोशिका Lysates के प्रोटीन सामग्री को मापने

  1. BSA मानकों को तैयार करें जिसमें 0, ०.१, ०.२ और ०.४ मिलीग्राम एमएल-1 के BSA GITC lysis बफर हैं ।
    नोट: यह GITC में BSA मानकों बनाने के लिए महत्वपूर्ण है, के बाद से GITC ब्रैडफोर्ड परख के रंग विकास को प्रभावित करता है । BSA मानक-20 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. Aliquot 5 µ एल के गल, अच्छी तरह से मिश्रित कोशिका lysates और BSA मानकों के एक स्पष्ट ९६-अच्छी तरह से थाली में अलग कुओं के लिए ।
  3. एक प्लेट रीडर में १९५ µ एल ब्रैडफोर्ड रिएजेंट३४ के एक अच्छी तरह से और उपाय अवशोषक ५९५ एनएम (एक५९५) में जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  4. BSA मानक वक्र की तुलना में एक अच्छी तरह से प्रोटीन की मात्रा की गणना, फार्मूला y = एमएक्स + बी, का उपयोग कर जहां y एक५९५है, x BSA के µ g है, m मानक वक्र की ढलान है, और बी मानक वक्र के y-अवरोधन है । प्रत्येक नमूने में प्रोटीन की कुल मिलीग्राम का निर्धारण करने के लिए ०.०५ के परिणामस्वरूप मूल्य गुणा ।

4. Polyphosphate निकालना

  1. मिश्रण करने के लिए प्रत्येक GITC-लीजड ड नमूना और भंवर के लिए ९५% इथेनॉल के २५० µ एल जोड़ें ।
  2. एक सिलिका झिल्ली स्पिन कॉलम के लिए कि मिश्रण लागू करें और १६,१०० x g पर 30 एस के लिए केंद्रापसारक
  3. प्रवाह के माध्यम से त्यागें, तो 5 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ७.५), ५० मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, ५०% इथेनॉल के ७५० µ एल जोड़ने और 30 एस के लिए केंद्रापसारक पर १६,१०० एक्स जी ।
  4. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और १६,१०० x g पर 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक
  5. कॉलम को साफ १.५ एमएल microfuge ट्यूब में रखें और ५० mM Tris-HCl (pH 8) के १५० µ l को जोड़ें ।
  6. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन, तो elute जंतु ८,००० x जी पर 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा
    नोट: यदि वांछित, eluates पर संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c कम 1 सप्ताह के लिए ।

5. पच Polyphosphate

  1. ५० mM Tris-HCl (pH 8) में 0, 5, ५०, या २०० µ m पोटेशियम फास्फेट वाले मानक तैयार करें ।
    नोट: पोटेशियम फॉस्फेट मानकों कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है.
  2. Aliquot १०० प्रत्येक फॉस्फेट मानक और एक स्पष्ट ९६ अच्छी तरह से थाली के अलग कुओं में निकाले जंतु नमूनों की µ एल ।
  3. (प्रति नमूना) युक्त एक मास्टर मिश्रण तैयार: 5x ScPPX प्रतिक्रिया बफर के 30 µ एल (१०० मिमी Tris-एचसीएल, 25 मिमी MgCl2, २५० मिमी अमोनियम एसीटेट, पीएच ७.५)13, 19 µ एल के एच2ओ, और 1 µ एल के शुद्ध ScPPX (1 मिलीग्राम एमएल-1) ।
  4. जोड़ें ५० µ मास्टर मिश्रण के एल ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं के लिए । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: यदि वांछित, पचा जंतु नमूनों में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c अनिश्चित काल तक ।

6. फ्री फॉस्फेट का पता लगाने24

  1. भंग करके खोज समाधान आधार तैयार करें सुरमा पोटेशियम tartrate के ०.१८५ ग्राम में २०० मिलीलीटर पानी में, 4 एन एच2के १५० मिलीलीटर जोड़ रहा है, तो4, तो अमोनियम heptamolybdate के १.४९ ग्राम जोड़ने । हलचल को भंग करने और फिर ४५६ मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में लाने के लिए । कण को हटाने और 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित स्टोर करने के लिए समाधान फ़िल्टर ।
  2. 1 M ascorbic एसिड की एक शेयर समाधान तैयार करें । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित स्टोर ।
  3. 1 एम ascorbic एसिड की ०.८८ मिलीलीटर के साथ पता लगाने के समाधान आधार के ९.१२ मिलीलीटर मिश्रण द्वारा प्रत्येक दिन का पता लगाने के समाधान का एक ताजा काम शेयर तैयार करें । उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर आने के लिए पता लगाने समाधान की अनुमति दें ।
  4. प्रत्येक नमूना और ९६ में मानक के लिए पता लगाने के समाधान के ५० µ एल जोड़ें-अच्छी तरह से प्लेट और के बारे में 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी रंग विकास की अनुमति दें ।
  5. एक प्लेट रीडर के साथ ८८२ एनएम पर उपाय अवशोषक और पोटेशियम फॉस्फेट मानक वक्र की तुलना द्वारा प्रत्येक नमूने के फॉस्फेट एकाग्रता की गणना.
    चेतावनी: पता लगाने के समाधान विषाक्त लवण और मजबूत एसिड होता है । दस्ताने पहनें और विषाक्त अपशिष्ट के रूप में अतिरिक्त समाधान का इलाज ।

7. सेलुलर Polyphosphate सामग्री की गणना

  1. प्रत्येक पूरे सेल lysate में जंतु व्युत्पंन फॉस्फेट के nanomoles करने के लिए ६.५ चरण में निर्धारित फॉस्फेट सांद्रता निम्नलिखित सूत्र के अनुसार कन्वर्ट:
    nmol जंतु = १.५ x (µ मी फॉस्फेट १०/
    नोट: चरण 6 में मानक वक्र-आधारित विधि फॉस्फेट (µ m में) में प्रत्येक १०० µ l जंतु नमूना aliquoted में ५.२ चरण में एकाग्रता निर्धारित करता है । nmol के एक नंबर करने के लिए इस एकाग्रता को परिवर्तित करने के लिए, १०० µ l 106 से विभाजित है एल में एक मात्रा देने के लिए, एकाग्रता से गुणा (µmol एल-1), तो १,००० से गुणा (एक µmol में nmol की संख्या). इस एकाग्रता को विभाजित करने के लिए कम कर देता है 10. कुल निकालने के चरण 4 में तैयार की मात्रा १५० µ एल है, तो यह १.५ से परिणामी मूल्य गुणा करने के लिए पूरे निकालने में फॉस्फेट वर्तमान के nmol की गणना करने के लिए आवश्यक है ।
  2. ३.४ चरण में निर्धारित प्रत्येक नमूने में मिलीग्राम कुल प्रोटीन द्वारा nmol जंतु विभाजित करके कुल सेलुलर प्रोटीन के लिए सेलुलर जंतु सामग्री को सामान्य. जंतु स्तर व्यक्तिगत जंतु की एकाग्रता के संदर्भ में व्यक्त कर रहे है मुक्त फॉस्फेट व्युत्पंन ।
    नोट: कुछ मामलों में, एक नमूने में जंतु व्युत्पंन फॉस्फेट की मात्रा फॉस्फेट मानक वक्र (चरण ६.५) के रैखिक सीमा के बाहर गिर सकता है । यदि जंतु के स्तर बहुत अधिक हैं, अतिरिक्त जंतु-४.६ कदम से युक्त eluate 1:10 या 1:100 पतला किया जा सकता है, के रूप में आवश्यक है, और फिर 7 के माध्यम से 5 चरणों में वर्णित के रूप में फिर से मापा ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों में चित्र 1में सरलीकृत रूप में diagrammed हैं ।

के लिए ग्राम नकारात्मक जीवाणुओं के साथ इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, जंगली प्रकार ई. कोलाई MG1655३९ मध्य में हो गया था पौंड रिच मीडियम में लॉग चरण ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए (२०० rpm) के साथ, तो कुल्ला और एक अतिरिक्त 2 के लिए मशीन में ज morpholinopropanesulfonate-बफर (MOPS) न्यूनतम मध्यम४० 4 जी एल-1 ग्लूकोज और ०.१ मिमी K2HPO4, एक जंतु14,29के उत्पादन के लिए प्रेरित करने के लिए जाना जाता शर्त । के रूप में चित्रा 2aमें दिखाया गया है, हम जंगली में कोई जंतु-प्रकार ई. कोलाई और १९२ ± 14 में वृद्धि हुई (± मानक विचलन मतलब [एसडी]) nmol जंतु एमजी-1 MOPS में कुल प्रोटीन, पिछली रिपोर्ट के अनुरूप14,29 . जैसा कि उंमीद है, एक ∆ppk उत्परिवर्ती6, जो जंतु कळेनासे४१की कमी है, या तो मध्यम, एक ∆ppx उत्परिवर्ती6, जो४२exopolyphosphatase का अभाव में कोई जंतु का उत्पादन किया, लगभग एक ही राशि का उत्पादन जंगली प्रकार के जंतु के रूप में, और एक ∆phoB उत्परिवर्ती29, जो फॉस्फेट परिवहन में दोषपूर्ण है, जंगली-प्रकार14,29,४३की तुलना में काफी कम जंतु का उत्पादन किया ।

ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के साथ इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, जंगली प्रकार एल reuteri ATCC पीटीए ६४७५३६ और एक isogenic ppk1 नल उत्परिवर्ती कमी जंतु कळेनासे, oligo-निर्देशित recombineering४४के उपयोग का निर्माण, थे मिलाते हुए बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर मेई-सी में रातोंरात हो गया । के रूप में चित्रा 2 बीमें दिखाया गया है, जंगली प्रकार संचित ५१ ± 6 nmol जंतु मिलीग्राम-1 इन शर्तों के तहत कुल प्रोटीन, जबकि ppk1 उत्परिवर्ती इस राशि से कम आधा निहित है । एल reuteri एक दूसरे जंतु कळेनासे, ppk2 जीन४५है, जो संभवतः ppk1 null उत्परिवर्ती में जंतु वर्तमान के लिए खातों द्वारा इनकोडिंग शामिल हैं ।

आइसोलेटों के साथ इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, माइकोबैक्टीरियम smegmatis तनाव SMR5४६ मध्य के लिए हो गया था-Hartmans में प्रवेश चरण-de Bont (HdB) मध्यम४७, तो कुल्ला और पांच पतला hdb या hdb में 2% इथेनॉल के साथ गुना । इन संस्कृतियों तो मिलाते हुए (१८० rpm) के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर की मशीन थे । के रूप में चित्र 2cमें दिखाया गया है, इथेनॉल के अभाव में, M. smegmatis संचित १४१ ± ५२ nmol जंतु मिलीग्राम-1 कुल प्रोटीन, जबकि इथेनॉल के उपचार के परिणामस्वरूप तीन गुना वृद्धि ४३७ ± १०२ nmol जंतु मिलीग्राम-1 कुल प्रोटीन । इस परिणाम की उंमीद थी, के बाद से इथेनॉल पहले एम smegmatis४८में जंतु स्तर में तरक्की की सूचना दी गई है ।

Figure 1
चित्र 1: polyphosphate निष्कर्षण और माप प्रक्रिया का आरेख । जंतु ठहराव प्रोटोकॉल के आवश्यक कदम सचित्र हैं । बैक्टीरियल सेल छर्रों GITC (guanidine isothiocyanate) में ९५ डिग्री सेल्सियस पर लीजड ड रहे हैं । lysates के छोटे aliquots ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग प्रोटीन सामग्री के लिए परख रहे हैं । जंतु सिलिका झिल्ली कॉलम का उपयोग कर निकाला जाता है और फिर ScPPX के साथ पचा । परिणामस्वरूप मुक्त फॉस्फेट ascorbic एसिड की परख का उपयोग कर quantified है । कुल जंतु व्युत्पंन फॉस्फेट प्रत्येक नमूने के लिए कुल प्रोटीन के लिए सामान्यीकृत है । A५९५ = अवशोषक पर ५९५ एनएम; एक८८२ = ८८२ एनएम पर अवशोषक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: विविध बैक्टीरिया के साथ प्रतिनिधि परिणाम । (क) ई. कोलाई MG1655 वंय-प्रकार और isogenic ∆ppk, ∆ppx, और ∆phoB म्यूटेंट (२०० rpm) को मिलाते हुए एक६०० = ०.२-०.४ अमीर पौंड मध्यम (काले हलकों) के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो गए थे और फिर न्यूनतम मध्यम करने के लिए स्थानांतरित (MOPS 2 ज (सफेद हलकों; एन = 3, ± एसडी) के लिए 4 g L-1 ग्लूकोज और ०.१ mM K2HPO4) युक्त । (ख) एल reuteri ATCC पीटीए ६४७५ (हलकों) और एक isogenic ppk1 नल उत्परिवर्ती (त्रिकोण) में रातोंरात बड़े हो गए ३७ ° c मध्यम मिलाते हुए बिना (n = 3, ± एसडी) । (C) M. smegmatis SMR5 ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए (१८० rpm) के साथ एक६०० = 1 के लिए HdB माध्यम में (बंद चौकों) या बिना (खुला चौकों) 2% इथेनॉल (n = 3, ± एसडी) हो गया था । जंतु स्तर व्यक्तिगत जंतु की एकाग्रता के संदर्भ में व्यक्त कर रहे है मुक्त फॉस्फेट व्युत्पंन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां वर्णित सरल और विभिंन बैक्टीरिया में जंतु स्तर के ठहराव में बढ़ौतरी, 24 नमूनों की एक विशिष्ट सेट के बारे में १.५ के बारे में लेने के लिए पूरी तरह से प्रक्रिया एच । यह नमूनों की तेजी से स्क्रीनिंग और उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के विश्लेषण परमिट, और काइनेटिक समय के साथ जंतु के संचय को मापने के प्रयोगों को सरल । हम प्रदर्शन किया है कि प्रोटोकॉल तीन अलग संघ के प्रतिनिधियों पर प्रभावी ढंग से काम करता है: proteobacteria, firmicutes, और actinobacteria, जो अपने लचीला के लिए कुख्यात हैं, लाइसे सेल की दीवारों को मुश्किल४९।

ScPPX के साथ पाचन द्वारा जंतु का पता लगाना अधिक विशिष्ट है और DAPI के साथ प्रतिदीप्ति का पता लगाने से अधिक संवेदनशील है, और सस्ता है और अधिक तकनीकी रूप से सरल PPK का उपयोग एटीपी को जंतु के रूपांतरण से । हालांकि ScPPX डीएनए और आरएनए12से हिचकते है, हम एंजाइम की एक बहुत बड़ी अतिरिक्त का उपयोग करके इस पर काबू पाने के (प्रति नमूना 1 µ g) से भी अधिक युक्त बैक्टीरिया में पूरा पाचन प्राप्त करने के लिए ६,००० nmol जंतु मिलीग्राम-1 प्रोटीन29. अंय प्रकाशित तरीकों12,24प्रतिक्रिया प्रति ScPPX के 10 से 15 एनजी का उपयोग करें । ScPPX शुद्धि के लिए हमारे प्रोटोकॉल आमतौर पर अधिक से अधिक अधिक से अधिक ५,००० परख के लिए पर्याप्त है, जो व्यक्त संस्कृति के प्रति लीटर शुद्ध ScPPX के 5 मिलीग्राम की पैदावार । हमने पाया है कि उनके-टैग प्रोटीन के निकल के लिए कई विभिंन प्रोटोकॉल को अच्छी तरह से काम करने के लिए शुद्ध ScPPX pScPPX2 से व्यक्त (डेटा नहीं दिखाया गया है), और वहां ऐसे प्रोटोकॉल की एक विस्तृत विविधता के साथ प्रयोगशालाओं सूट के लिए उपलब्ध है अलग तकनीकी क्षमता ।

पिछले ScPPX जंतु का पता लगाने के लिए पाचन का उपयोग प्रोटोकॉल अक्सर मैलाकाइट ग्रीन पर भरोसा किया है वर्णमिति परख आधारित मुक्त फॉस्फेट6,12। इन परख संवेदनशील हैं, लेकिन आम तौर पर ध्यान से समय पर दो या तीन अलग एजेंट के क्रमिक इसके अलावा की आवश्यकता के लिए सटीक माप24,५०,५१बनाने के लिए । ascorbic एसिड आधारित जांच प्रणाली24 यहां इस्तेमाल किया संवेदनशीलता का कोई नुकसान के साथ मैलाकाइट हरी से पता लगाने की एक व्यापक रैखिक श्रृंखला है, केवल एक ही एजेंट के अलावा शामिल है, और सटीक समय की आवश्यकता नहीं है ।

वहां कई कदम है कि इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, बैक्टीरियल नमूनों GITC में तुरंत कटाई के बाद लीजड ड होना चाहिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि जंतु स्तर नमूने के समय के बाद बदल नहीं है और तेजी से सेलुलर phosphatases को निष्क्रिय करने के लिए । दूसरा, अधिक से अधिक 10 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर GITC lysates मशीन नहीं है, और उन्हें तुरंत बाद में-८० डिग्री सेल्सियस संभव जंतु hydrolysis को कम करने के लिए दुकान. तीसरे, सावधान रहना जब ९६ में pipetting नमूने या तो प्रोटीन या फॉस्फेट माप के लिए नहीं छप या एक नमूना से दूसरे में कुछ ड्रिप के लिए अच्छी तरह से प्लेटें । वर्णमिति परख, विशेष रूप से फॉस्फेट के लिए, बहुत संवेदनशील हैं, और दूषण की छोटी मात्रा दृढ़ता से परिणाम विषम कर सकते हैं । अंत में, कुछ इस प्रोटोकॉल (यानी ScPPX, डिटेक्शन समाधान) में इस्तेमाल किया एजेंट सीमित शेल्फ रहता है । ताजा ScPPX हर 6 महीने और नए सिरे से पता लगाने के समाधान हर महीने तैयार ।

हमारी विधि की एक सीमा है कि सिलिका कॉलम से कम जंतु बांध नहीं है ६० फॉस्फेट इकाइयों लंबे समय बहुत अच्छी तरह से12,14,15. बैक्टीरिया आमतौर पर ज्यादातर लंबी श्रृंखला के जंतु3संश्लेषित, हम प्रारंभिक polyacrylamide जेल ट्रो27,30 का उपयोग करने से पहले एक दिया जीवाणु प्रजातियों में श्रृंखला की लंबाई का आकलन करने के लिए प्रयोगों की सिफारिश हमारी कार्यविधि । प्रजातियों के लिए जहां लघु श्रृंखला जंतु को जंतु पूल का एक बड़ा अंश बना देता है, हमारे प्रोटोकॉल उचित नहीं है और हम एक अलग विधि (जैसे, phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण12) द्वारा जंतु निकालने की सिफारिश, और भी सिफारिश करेंगे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एस cereviseae pyrophosphatase (PPA1)24के साथ ScPPX पाचन का सप्लीमेंट, के बाद से ScPPX13 pyrophosphate पचा नहीं है और यह कम श्रृंखला की माप पर एक आनुपातिक उच्च प्रभाव पड़ता है नाकड़ा. ScPPX के लिए एक विकल्प के रूप में, एसिड hydrolysis३८ मुक्त फॉस्फेट के लिए hydrolyze जंतु के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह अतिरिक्त DNase, RNase, और शुद्धि के लिए यह सुनिश्चित करें कि केवल जंतु व्युत्पंन फॉस्फेट मापा जा रहा था कदम की आवश्यकता होगी । कुछ मामलों में, यह परीक्षण करने के लिए एक वैकल्पिक निष्कर्षण विधि का उपयोग करने के लिए उपयोगी हो सकता है कि GITC के साथ जंतु निष्कर्षण की दक्षता उपभेदों या शर्तों के बीच बदलती रहती है, विशेष रूप से इस तरह के आइसोलेटों के रूप में मोटी कोशिका की दीवारों, ज्ञात बैक्टीरिया के साथ. यदि इस परख का पता लगाने की सीमा से नीचे जंतु के स्तर पर एक विशेष प्रजाति के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं, यह एक अलग पता लगाने की योजना का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है, ऐसे PPK का उपयोग करने के लिए एटीपी, जो अत्यंत संवेदनशील का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है के लिए परिवर्तित जंतु व्यावसायिक रूप से उपलब्ध luciferase आधारित परख14,17,18।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना के बर्मिंघम विभाग के माइक्रोबायोलॉजी स्टार्टअप फंड और NIH ग्रांट R35GM124590 (MJG को), और NIH अनुदान R01AI121364 (परिवार कल्याण के लिए) में अलबामा के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू १४३ Polyphosphate तनाव रिस्पॉन्स exopolyphosphatase चना-नेगेटिव बैक्टीरिया चना पॉजिटिव बैक्टीरिया आइसोलेटों
बैक्टीरिया में अकार्बनिक Polyphosphate के लिए परख
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Pokhrel, A., Lingo, J. C.,… More

Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).

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