Summary
多様な細菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌種を含むポリリン酸の迅速定量のための簡単な方法について述べる。
Abstract
無機ポリリン酸 (ポリープ) は、生活のすべてのドメインからの細胞は、生体高分子を病原性および多くの細菌のストレス反応に必要です。さまざまな労働集約的なまたは小文字を区別しない、その有用性を制限することは、多くの生体物質の定量化のポリープの方法があります。我々 提示ここで細菌、ポリープの定量化のための合理化された方法複数サンプルがあり、ポリープ固有 exopolyphosphatase ScPPX とポリープの消化および検出の迅速な処理のために最適化されたシリカ膜列抽出を使用して、敏感なアスコルビン酸ベースの比色試金とフリーのりん酸塩を生じる。このプロシージャは簡単、安価で、し多様な菌種で、信頼性の高いポリープ定量化。グラム陰性細菌 (大腸菌)、乳酸グラム陽性細菌 (乳酸菌ロイテリ) 抗酸菌種 (アラビノースイソメラーゼ) から代表的なポリープ定量化を提案します。私たちもこれは現在市販されていない ScPPX、mg 量のニッケル親和性の浄化のための単純なプロトコルを含まれます。
Introduction
無機ポリリン酸 (ポリープ) はライフ1,2,3のすべてのドメインである phosphoanhydride リンク リン酸単位の線形生体高分子です。多様な細菌でポリープは欠かせないストレス反応、運動、バイオ フィルム形成、細胞周期制御、抗生物質耐性、病原性4,5,6,7,8 ,9,10,11。ポリープ細菌で代謝の研究したがって病気を引き起こす、さまざまな環境で繁栄する細菌の能力に根本的な洞察力をもたらす可能性があります。多くの場合、細菌細胞における定量化のポリープとして使用する方法が、これらの研究を制限する要素です。
現在ポリープ生体試料中濃度を測定するために使用するいくつかの方法があります。これらのメソッドは通常 2 つの明瞭なステップを含む: それらの抽出物でポリープを抽出し、ポリープを定量化を提示します。Bru と同僚で12フェノールを使用する RNA と DNA 抽出ポリープ酵母酵母として開発した現在の金本位法、クロロホルム、エタノールの沈殿物、治療が続く出芽酵母ポリープ分解酵素 exopolyphosphatase (ScPPX)13を使用して定量化は、フリーのりん酸塩を生成するために結果として得られる精製ポリープの消化およびリボヌクレアーゼ (RNase)、デオキシリボヌクレアーゼ (DNase)、マラカイト グリーンを用いた比色定量法。この手順は、非常に数量が、労働集約的な単一の実験で処理することができ、細菌性のサンプルのために最適化されていませんするサンプルの数を制限することです。他の人はさまざまな細胞や組織をシリカビーズ ("glassmilk") またはシリカ膜列6,14,15,16,17を使用してからポリープを抽出を報告しています。 18。これは主に合成と一般的に考えられている細菌をそれほど考慮これらのメソッドは効率的に短鎖ポリープ (未満 60 リン酸単位)12,14,15, を抽出できません。長鎖ポリープ3。強い酸19,20を使用してポリープ抽出のより古い方法はもはや広く利用されてポリープは酸性条件12の下で安定しているので。
また、さまざまな定量化ポリープの報告方法があります。最も一般的なの間では 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 蛍光色素の詳細は通常、DNA を染色に使用です。DAPI ポリープ錯体 DAPI DNA 複合体21,22より異なる蛍光励起と放射マキシマが RNA、ヌクレオチド、イノシトールなど他の細胞部品からかなりの干渉があります。リン酸塩12,15,16,23, 特異性とこのメソッドを使用してポリープ測定の感受性を減らします。ポリープとアデノシン二リン酸 (ADP) をアデノシン三リン酸 (ATP) を精製した大腸菌を使用してに変換する代わりに、ポリープのキナーゼ (PPK) およびルシフェラーゼ14,17 を用いて定量化結果 ATP ,18。これはポリープの非常に少量の検出が可能、2 つの酵素反応ステップ ルシフェリンと非常に純粋な ADP は、高価な試薬であるが必要です。ScPPX フリーのりん酸塩6,12,13,24、簡単な方法、しかし ScPPX を使用して検出することができますに特にダイジェスト ポリープは DNA および RNA の12によって阻害されます。ポリープを含む必要と DNase、RNase 処理を抽出します。PPK も ScPPX も市販と PPK の浄化は比較的複雑な25,26。
DAPI 染色27,28,29,30、チェーン長さの評価を許可して、メソッドは負で、セル lysates または抽出物でポリープのポリアクリルアミドゲルで視覚化できるも低スループットと低い定量。
我々 は今多様な細菌種のレベル ポリープの急速な定量化を可能にする安価な高速、中速のポリープ アッセイを報告します。このメソッドは、複数のサンプルの迅速な処理のために最適化されたシリカ膜列抽出に続いて携帯電話のホスファターゼを不活化する 95 ° c 4 M グアニジン イソチオ シアン酸 (GITC)14で細菌細胞の分離によって開始します。得られたポリープを含む抽出液は、DNase、RNase の治療の必要性を排除する ScPPX の大過剰と消化されます。ScPPX の mg 量の簡単なニッケル親和性の浄化のためのプロトコルが含まれます。最後に、ポリープ由来フリーのりん酸塩は、単純な敏感なアスコルビン酸ベースの比色定量法24の定量化し、総細胞蛋白質に正規化します。このメソッドは、細菌細胞、ポリープの測定を合理化し、グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌の代表種でその使用を示します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 浄化酵母 Exopolyphosphatase (ScPPX)
- エレクトロポレーション32または33化学変換によって大腸菌蛋白質過剰発現株プラスミド pScPPX26 BL21(DE3)31を変換します。
- BL21(DE3) pScPPX2 を含む単一コロニーを 2 L ないフラスコ 100 μ g mL-1アンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) の 1 L を接種して 600 で吸光度を振ることがなく 37 ° C で一晩インキュベート nm (600) の約0.3、分光光度計で測定しました。
- 文化 (180 rpm) を揺れを起動し、セルが 0.4 - の A600に成長する時間の間に、37 ° C で 30 分間インキュベート 0.5。
- 最終濃度 1 mM と、追加 100 μ g mL-1アンピシリン、イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) を追加し、180 rpm で振とうしながら 37 ° C で 4 時間孵化させなさい。
注: この過剰発現プロトコルは可溶性 ScPPX の大規模な量を生成します。ただし、ScPPX の過剰発現は非常に寛容とさまざまなその他の一般的な蛋白質過剰発現のプロトコルは正常に ScPPX を浄化するために使用されています。 - 1 L 遠心ボトルにセルを転送し、4 ° C で 5000 × g で 20 分間遠心分離することでそれらを収穫上澄みを除去し、細胞ペレットを 50 mL の円錐管に転送します。
注: 細胞ペレット格納できます無期限に-80 ° C で - 氷上では、ペレットを解凍し、50 mm HEPES 9 mL、0.5 M の NaCl および 5 mM のイミダゾール (pH 8) 約 10 mL の容量のためにそれを再懸濁します。
- (最終濃度) 1 mg mL-1リゾチーム、2 mM MgCl2、および RNA と DNA 分解酵素の 50 単位 mL-1を追加 (材料の表を参照) し、氷上で 30 分間インキュベートします。
注: ScPPX バインド (データは示されていない)、核酸精製ヌクレアーゼ治療が必要であるので。 - 超音波発生装置を用いた、陰極 (材料の表を参照)、50% の電力、パルス 5 氷に対する超音波照射の 2 サイクルで細胞を溶解 s サイクル間 2 分休憩と 5 s。
注: は、超音波処理中に適切な公聴会保護を使用します。同様に過剰発現ケースに、さまざまなセル換散方法は ScPPX 浄化のため許容されます。 - ライセートの 4 ° C で 20,000 × g で 20 分間遠心分離によって不溶性の残骸を削除します。0.8 μ m 孔サイズ酢酸セルロース シリンジ フィルターを通して結果上清 (約 10 mL) をフィルターします。
- 読み込む列をキレート ニッケル充電の 5 mL に溶解液 (材料表参照) 蠕動性ポンプまたは大規模な注射器を使用して。
- 50 ml 50 mM HEPES、0.5 M の NaCl 5 mM のイミダゾール (pH 8) の列をすすいでください。
- 50 ml 50 mM HEPES、0.5 M の NaCl、20 mM のイミダゾール (pH 8) の列をすすいでください。
- 50 mm HEPES ScPPX、0.5 M の NaCl と 0.5 M イミダゾール (pH 8) 収集 15 1 mL の一部分を溶出します。ブラッドフォード蛋白質の試金34コンテンツ蛋白質のためのこれらの溶出画分をテスト (材料の表を参照) を分数に浄化された ScPPX が含まれている確認する SDS ページのゲル35を実行し、(分子量 = 45 kDa)。
- 純粋な ScPPX を含む画分をプールし、約 2 mg mL-1 50 mM HEPES と 0.5 M の NaCl をプールされたタンパク質の濃度を調整します。高蛋白質濃度は、次の手順で沈殿させるかもしれない。
- 透析によるストレージ バッファー (20 mM トリス-HCl [pH 7.5] 50 mM KCl、10% [v] のグリセロール) に精製した ScPPX を交換します。シール長さ 12,000-14,000 Da 分子量カットオフ透析膜チューブ (材料の表を参照してください) のプール ScPPX 分数を置き、1 l 連続攪拌 4 ° C で少なくとも 4 h、新鮮なこの手順でストレージ バッファーの中断ストレージ バッファー バッファーの 3 つの変更の合計のため。
- 遠心分離機管または管不溶性集計を削除する 4 ° C で 20,000 × g で 20 分間遠心分離して精製、透析の蛋白質を転送します。慎重にきれいな 15 mL コニカル チューブに上清を転送します。
- 1 mg mL-1ストレージ バッファーに精製した ScPPX の濃度の調整、追加 0.1% (w/v) プロテアーゼ無料ウシ血清アルブミン (BSA; 最終濃度) と 4 ° C で最大 6 ヶ月のための店
注: ScPPX は、冷凍13だとその活動の 90% 以上を失います。
2. ポリリン酸抽出のサンプルを収穫
- ポリープのコンテンツを決定する金利の条件下で細菌を成長します。このプロトコルのリンゴ酸酵素誘導 (MEI) 中37システイン (メイ C) なしで振動なし乳酸菌ロイテリ36 37 ° C で一晩で育ちます。
- 細胞蛋白質の 50-100 μ g の合計 1.5 mL 遠心チューブに遠心分離によって十分なセルを収穫 (下記の手順 3 を参照)。これは 0.2 - A600でログ相文化の 1 mL、エシェリヒア属大腸菌、0.4。これは、 l. ロイテリ、一晩文化の 1 mL です。興味の他の種のために必要に応じて調整します。
- 細胞ペレットから上清を完全に削除します。
- GITC 換散バッファー (4 M グアニジン イソチオ シアン酸、50 ミリメートル トリス-HCl、pH 7) の 250 μ L で細胞ペレットを再懸濁し、10 分-80 ° C でストア lysates 95 ° C で培養による溶解させます。
注: は、高温で長期の潜伏が加水分解38ポリープの劣化になるので溶解時間と一致します。Lysates は-80 ° C で不明確に保存されることができます。
注意: イソチオ シアン酸グアニジン カオトロ ピック塩ですと手袋をはめて処理、有害廃棄物としています。
3. セル Lysates のタンパク質含有量の測定
- 0、0.1、0.2、0.4 mg mL GITC 換散バッファー内-1 BSA の含まれている BSA 基準を準備します。
注: GITC ブラッドフォードの試金の発色に影響を与えるので、GITC で BSA の基準にすることが重要です。BSA の標準は、-20 ° C で不明確に保存されることができます。 - 分注 5 μ 解凍、十分に混合されたセル lysates と BSA 基準クリア 96 ウェル プレートで井戸を分離します。
- 各ウェルにブラッドフォード試薬34 195 μ L を追加し、595 で吸光度を測定プレート リーダーで nm (595) (材料の表を参照してください)。
- 数式 y を使用して BSA の標準曲線と比較して各ウェル中の蛋白量を計算 = mx+b と、y は595x は BSA の μ g、m は標準曲線の傾き、b は標準曲線の y 切片です。各サンプルの蛋白質の総 mg は、0.05 を結果の値を掛けます。
4. ポリリン酸の抽出
- 各サンプルの GITC 分離とミックスする渦に 95% のエタノールの 250 μ L を追加します。
- シリカ膜のスピン列と 30 の遠心分離機に混合物を適用 16,100 x g で s。
- 流れを破棄し、50 mM NaCl、5 ミリメートルの EDTA、50% エタノールと 30 の遠心分離機 (pH 7.5)、5 mM トリス-HCl の 750 μ L を追加 16,100 x g で s。
- フロー ・ スルーと 16,100 x g で 2 分間遠心を破棄します。
- きれいな 1.5 mL および microfuge の管に列を配置し、50 mm トリス-HCl (pH 8) 150 μ L を追加します。
- 5 分間室温でインキュベートし、8,000 の x g で 2 分間遠心分離によってポリープを溶出します。
注: 必要な場合、溶出格納できます-20 ° C で少なくとも 1 週間。
5. ポリリン酸の消化
- 0、5、50、または 50 mm トリス-HCl (pH 8) リン酸カリウム 200 μ M を含む基準を準備します。
注: カリウム リン酸基準は、室温で不明確に保存することができます。 - 分注 100 μ L 標準リン酸塩とは、クリア 96 ウェル プレートの別の井戸にポリープのサンプルを抽出しました。
- (サンプルごと) を含んでいるマスターの組合せを準備: 5 x ScPPX 反応バッファー (100 mM トリス-HCl、MgCl225 mM、250 mM 酢酸アンモニウム、pH 7.5)13の 30 μ L、19 μ L H2O の 1 μ L の精製 ScPPX (1 mg mL-1)。
- 96 ウェル プレートの各ウェルにマスター ミックスの 50 μ L を追加します。37 ° C で 15 分間インキュベートします。
注: 必要な場合消化ポリープ サンプルが-20 ° C で不明確に保存されます。
6. 検出フリーのりん酸塩24
- だから 4 N H2の 150 mL を追加、水の 200 mL の酒石酸アンチモン カリウム 0.185 g を溶解することにより検出ソリューション ベースの準備4、アンモニウム heptamolybdate の 1.49 グラムを追加します。溶解し 456 mL の最終巻にかき混ぜます。1 ヶ月の 4 ° C で光から保護された微粒子を取り出して保管するのにソリューションをフィルターします。
- 1 M アスコルビン酸の原液を準備します。1 ヶ月の 4 ° C で光から保護されたストア。
- 1 M アスコルビン酸 0.88 ml 検出ソリューション ベースの 9.12 mL を混合することによって、新鮮な在庫検出ソリューションの毎日を準備します。使用する前に室温に来る検出ソリューションを許可します。
- 各サンプルと 96 ウェル プレートで標準に検出ソリューションの 50 μ L を追加し、色の開発を許可するように約 2 分間室温でインキュベートします。
- 882 で吸光度を測定プレート リーダー nm カリウム リン酸標準曲線に比較して各サンプルのリン酸濃度を計算します。
注意: 検出ソリューションには、有毒な塩と強い酸が含まれています。手袋を着用する、有毒廃棄物として余分なソリューションを扱います。
7. 細胞ポリリン酸の内容を計算します。
- 次の式に従ってライセート各セルの全体のポリープ由来リン酸イオンの nanomoles の手順 6.5 で、リン酸濃度を変換します。
nmol ポリープ 1.5 x = (μ M リン酸/10)
注: 手順 6 で標準曲線に基づいたメソッドは、サンプルではそれぞれ 100 μ L ポリープ 5.2 の手順で検体 (μ M) におけるリン酸の濃度を決定します。この濃度を nmol 数に変換する 100 μ L を 10 で割るは6 l、ボリュームを与える濃度 (µmol L-1) で乗算し、1,000 (、µmol の nmol 数) を掛けた。これは濃度を 10 で除算する減少します。手順 4 で準備総エキス量が全体のエキスにリン酸の nmol を計算するために 1.5 結果の値を乗算する必要があるので 150 μ L であります。 - 手順 3.4 で確認した各サンプルの mg 総蛋白 nmol ポリープを除して総細胞蛋白質を細胞ポリープ コンテンツを正規化します。ポリープ レベルは個別無料ポリープ由来のリン酸の濃度の観点から表されます。
注: 場合によっては、ポリープ由来リン酸サンプルで現在の量がリン酸標準曲線 (ステップ 6.5) の線形範囲外落ちることがあります。ポリープのレベルが非常に高い場合、ステップ 4.6 から余分なポリープを含む溶出液は希釈 1:10 または 1: 100、必要に応じてすることができ、5 7 からの手順の説明に従って再度測定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
プロトコルの主な手順は、図 1の単純な形で立てます。
グラム陰性菌、野生型大腸菌にこのプロトコルの使用を示すため MG165539だった LB (200 rpm) の揺れで 37 ° C で豊富な培地の中間ログ段階に成長して、洗浄し、でさらに 2 時間インキュベートmorpholinopropanesulfonate バッファー (モップ) 最小限中40 g L-1のグルコースと 0.1 ミリメートル K2HPO4、ポリープ14,29の生産を誘導するために知られている状態を含みます。図 2 aのように、検出したないポリープ野生型大腸菌LB と 192 ± 14 (平均 ± 標準偏差 [SD]) nmol ポリープ mg-1総蛋白モップ、以前レポート14,29 と一貫性の栽培.∆ppx変異6exopolyphosphatase42を欠いている、生産のほぼ同じ量どおり、∆ppk変異6が欠けているポリープ キナーゼ41、出ないいずれかの媒体でポリープ、野生型のポリープと ∆phoB変異29、リン酸輸送の欠陥は、野生型14,29,43よりも大幅に少ないポリープを生産しました。
グラム陽性菌、野生型l. ロイテリでこのプロトコルの使用を実証するには、ATCC PTA 647536とポリープのキナーゼ、oligo 監督ジーン44を使用して構築に欠けている同質遺伝子ppk1 null 変異体だった37 ° C でメイ C で一晩に成長して、揺れなし。示すように図 2 b野生型蓄積された 51 ± 6 nmol ポリープ mg-1全蛋白質のこれらの条件の下でppk1変異にこの半分以下の金額が含まれている間。L. ロイテリには ppk1 null 変異でおそらくポリープのアカウントを提示、 ppk2遺伝子45によって符号化される 2 番目のポリープ キナーゼが含まれています。
抗酸菌にこのプロトコルの使用を示すためには、アラビノースイソメラーゼひずみ SMR546育った中間ログ フェーズにハートマン - ヤンデボント (HdB) 中47、し、すすぎで 5 倍希釈の HdB の HdB の 2% エタノール。揺れ (180 rpm) で 37 ° C で一晩培養し、これらの文化。エタノールがない場合図 2で示すように、 M. smegmatisは 141 ± 52 nmol ポリープ mg-1総蛋白、出来上ってエタノール治療結果倍 437 ± 102 nmol ポリープ mg-1総蛋白。エタノールは、以前ポリープM. smegmatis48のレベルを高めると報告されているので、この結果は予想されました。
図 1: ポリリン酸抽出・測定手順の図。ポリープの定量化のプロトコルの基本的な手順を示しています。細菌の細胞ペレットは、95 ° c GITC (イソチオ シアン酸グアニジン) で分離します。Lysates の小さい因数は、ブラッドフォードの試金を使用して蛋白質含量の試金されます。シリカ膜の列を使用して、ScPPX を消化し、ポリープが抽出されます。結果として得られるフリーのりん酸塩は、アスコルビン酸アッセイを用いた定量化されます。合計ポリープ由来リン酸は、各サンプルの総蛋白に正規化されます。595 595 で吸光度を = nm;882 882 吸光度を = nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表結果多様な細菌と。(A)エシェリヒア属大腸菌MG1655 野生型および同質 ∆ppk、∆ppxと ∆phoB変異体は、37 ° C (200 rpm) を600に揺れで栽培した = 0.2 - 豊富な LB 培地 (黒い円) で 0.4 最小媒体 (モップにシフトし、4 g L-1グルコースと 0.1 ミリメートル K2HPO4含む) 2 時間 (白い円; n = 3、± SD)。(B) l. ロイテリATCC PTA 6475 (円) と同質遺伝子ppk1 null 変異 (三角形) は、振ることがなくメイ C 培地で 37 ° C で一晩栽培した (n = 3、± SD)。(C) M. smegmatis SMR5 が 37 ° C (180 rpm) を600に揺れで成長した (閉じた正方形) の HdB 中 1 を = (広場) 2% エタノールの有無 (n = 3、± SD)。ポリープ レベルは個別無料ポリープ由来のリン酸の濃度の観点から表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで説明されているプロトコルは、簡素化、24 サンプル処理に約 1.5 時間を取っての典型的なセットを持つ多様な細菌のポリープ レベルの定量化を加速します。これはサンプルの迅速なスクリーニングと変異ライブラリ解析が可能、簡単に時間をかけてポリープの蓄積を測定の実験。プロトコルが 3 つ門の代表者で効果的に動作することを実現した: フィルミクテス門、プロテオ バクテリアとアクチノ バクテリアは、その弾力性のあるために悪名高いが、細胞壁49を分離することは困難。
ScPPX と消化によるポリープの検出はより具体的と、DAPI の蛍光検出より敏感より安くより技術的にポリープの PPK を使用して ATP への変換よりも簡単です。ScPPX は、DNA および RNA の12によって阻害される、我々 は以上 6,000 nmol ポリープ mg-1蛋白質29を含んでいる細菌でさえ完全な消化力を達成するために非常に大過剰の酵素 (サンプルあたり 1 μ g) を使用して、これを克服しています。その他公開メソッド使用 10 に 15 ng ScPPX の反応12,24あたり。ScPPX 浄化のためのプロトコルは、通常、1 リットルあたり 5,000 以上の試金のために十分である過剰発現文化の純粋な ScPPX の 5 mg 以上を生みます。ニッケル親和性彼の付けられた蛋白質の浄化のためのいくつかの異なるプロトコルが過剰に発現して pScPPX2 から ScPPX を浄化するためによく働くことがわかった (データは示されていない) に、さまざまな所に合わせて利用可能なこのようなプロトコルのさまざまな技術的能力。
ポリープの検出のための ScPPX 消化を使用して以前のプロトコルしばしば、フリーのりん酸塩6,12を定量化するマラカイト グリーン ベース比色試金に頼ってきました。これらの試金が敏感、通常正確な測定24,50,51にする 2 つまたは 3 つの独立した試薬の注意深く時限連続添加が必要です。アスコルビン酸ベースの検出システムに使用されるここで24広い線形の範囲を持って検出マラカイト グリーンよりも感度の損失なしにのみ単一の試薬の付加を含む、正確な必要としないタイミング。
このプロトコルの成功に不可欠ないくつかの手順があります。まず、細菌のサンプルは GITC でポリープ レベルは、サンプリングの時間後に変更しないことを確保し、急速に細胞の脱燐酸化酵素を不活性化する、収穫後すぐに分離する必要があります。第二に、10 分以上 95 ° C で GITC lysates をインキュベートしていないすぐに保存可能なポリープの加水分解を最小限に抑える-80 ° C でその後。第三に、スプラッシュまたは別のものに 1 つのサンプルから何かを点滴タンパク質やリン酸の測定のための 96 ウェル プレートにサンプルをピペッティングに注意します。比色法、特にリン酸は非常に敏感であり、汚染量が少ないことができます結果を歪曲して強く。最後に、このプロトコル (すなわちScPPX、検出ソリューション) で使われるいくつかの試薬棚生命を限定します。すべての 6 ヶ月間、新鮮な新鮮な ScPPX を準備、毎月検出ソリューション。
本手法の 1 つの制限は、シリカ列では未満 60 リン酸単位の長い非常によく12,14,15のポリープがバインドしないでください。ポリアクリルアミドゲル電気泳動27,30を使用して使用する前に特定の細菌種でチェーンの長さを評価する実験をお勧めしますが、細菌は通常、主鎖状ポリープ3を合成、私たちの手順。種短鎖ポリープがポリープのプールのかなりの割合を占めて、私たちのプロトコルは適切ではないと我々 は (例えばフェノール-クロロホルム抽出12)、別の方法によってポリープを抽出をお勧めしもお勧め市販s. cereviseaeと ScPPX 消化を補うピロホスファターゼ (PPA1)24ScPPX はピロリン酸13これを消化しないので、比例してより高い影響を与える短い鎖の測定ポリープです。ScPPX する代わりに、酸加水分解38無料のリン酸、ポリープを加水分解される可能性がありますが、これはのみポリープ由来のリン酸が測定されていたことを確認する追加の DNase、RNase、浄化手順を必要でしょう。場合によっては、抗酸菌などの厚い細胞壁を持っている知られている細菌、特に系統または条件、間 GITC とポリープ抽出の効率が異なるかどうかをテストするのには代替抽出メソッドを使用すると便利場合があります。PPK を使用してポリープを極めて敏感を使用して検出することができます ATP に変換するなどの異なる検出スキームを使用する必要がある場合はポリープの本法の検出限界以下のレベルは特定の種の研究のために重要、市販のルシフェラーゼ アッセイ14,17,18。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、バーミンガム講座スタートアップ資金および NIH グラント R35GM124590 (MJG) に NIH グラント R01AI121364 (FW) にアラバマ大学によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
| lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
| 5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
| nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
| 0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
| hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
| potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
| glucose | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
| manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
| Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
| ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
References
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
- Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
- Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
- Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
- Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
- Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
- Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
- Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
- Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
- Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
- Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
- Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
- Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
- Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
- Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
- Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
- Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
- Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
- Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
- Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
- Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
- Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
- Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
- Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
- Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
- Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F.
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
- Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
- van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
- Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
- Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
- Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
- Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
- Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S.
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).
