Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול אקספרס, solubilize של לטהר מספר שנאים בוראט האיקריוטים עם הומולוגיה למשפחה טרנספורטר SLC4 בעזרת שמרים. אנו מתארים גם assay cross-linking כימי כדי להעריך את החלבונים homomeric מטוהרים להרכבה multimeric. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים חלבונים ממברנה מאתגרים אחרים.
Abstract
משפחת ממס מנשא 4 (SLC4) של חלבונים נקרא למעליות ביקרבונט והוא כולל החלבון ארכיטיפי אניון מחליף 1 (AE1, הידוע גם בשם הלהקה 3), החלבון ממברנה הנפוץ ביותר של כדוריות דם אדומות. משפחת SLC4 היא הומולוגי עם בוראט מובילים, אשר אפיינו ב צמחים ופטריות. זה נשאר אתגר טכני משמעותי כדי לבטא ולטהר קרום חלבונים תחבורה כדי הומוגניות בכמויות מתאימים ללימודי מבנית או פונקציונלי. כאן נתאר הליכים מפורטים עבור ביטוי של בוראט מובילי האפייה, בידוד של שמרים ממברנות, solubilization של חלבונים על ידי חומרי ניקוי, טיהור של בוראט טרנספורטר homologs מ- ס cerevisiae, תודרנית לבנה, אורז סאטיבה. אנחנו גם פירוט של גלוטראלדהיד cross-linking ניסוי כדי assay multimerization של מובילי homomeric. הנהלים שלנו כללית שניתן להחיל על כל שלושת החלבונים, מוטבו על יעילות. רבים מן האסטרטגיות פותח כאן יכול להיות מנוצל עבור המחקר של חלבוני ממברנה מאתגר אחרים.
Introduction
הקושי בהשגת בכמות מספקת חלבון ממברנלי מטוהרים נשאר צוואר בקבוק קריטי במרדף אחר מחקרים מבניים ופונקציונליים של רצפטורים, תעלות יונים מובילים. קיימים פרוטוקולים רבים לצינורות תפוקה גבוהה למדי חלבונים ממברנה המועמד מסך ולמצוא המבטאים מספיק טוב כדי לאפשר עוקבות במבחנה מחקרים1,2,3,4 . בדרך כלל, חלבונים מתויגות עם חלבון פלואורסצנטי N - או C-מסוף ירוק (GFP), רמות הביטוי מנוטרים על-ידי קרינה פלואורסצנטית בבית-ג'ל או זריחה-זיהוי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (FSEC)5. גישות כאלה מאפשרים את triaging של מועמדים חלבון קרום חלבונים לביטוי גבוה, בינוני או נמוך המבטאים חלבונים, או חלבונים המבטאים לקוי או בכלל לא. גישה זו פועלת היטב כאשר הנבחנים היא לחקור מספרים גדולים של המועמד גנים מתוך כוונה בחירת איזה חלבון מבטא את הכי טוב. עם זאת, במקרים מסוימים, גישה נסיונית המרקסיסטי מבוסס על לימוד חלבון ממברנה מסוים, אשר עשויה להיות מאתגרת כאשר רמות הביטוי של החלבון הזה הן בטווח בינוני או נמוך. בנוסף, לפעמים במקרים אלה, רמות הביטוי יכול להיות רק באופן מינימלי מוגברת על ידי שינוי הבונה באמצעות truncations, מוטציות thermostabilizing או codon אופטימיזציה. זה, לכן, לפעמים זה נדרש למטב את קרום חלבונים פרוטוקולים ביטוי וטיהור חלבונים ממברנה לבטא רק בצורה מתונה גם.
משפחת SLC4 של מובילי כולל המשגר ביקרבונט אניון מחליף 1 (ידוע גם בשם הלהקה 3), החלבון ממברנה הנפוץ ביותר של כדוריות דם אדומות6נהג מפתח של נשימה תאית. משפחת SLC4 היא הומולוגי עם בוראט מובילים, אשר הם קריטיים בצמחים, הוכחו להפגין מבנה דומה אניון מחליף 1 וכן מצמידים נתרן SLC4 מובילי7,8,9 ,10. כאן אנחנו מדווחים על חלבון ממוטבת ביטוי וטיהור פרוטוקולים באמצעות cerevisiae ס לטהר שלושה מובילי בוראט שונים נמצאו שמרים וצמחים. אנחנו מדגישים בשלבים מפתח פרט שלקחנו כדי למטב את התשואה והיעילות של purifications עד הומוגניות. בנוסף, מדווחים על assay cross-linking כימי באמצעות גלוטראלדהיד לפקח multimeric הרכבה של שנאים אלה בהקשר של קומפלקס חלבונים-חומרי ניקוי-השומנים מטוהרים. הניסוי cross-linking יכול לעזור להעריך את התאמתו homolog, חומרי ניקוי על-ידי הערכת מצב multimeric שנאים oligomeric לאחר טיהור.
פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי המשגר הרצוי נשלטה לתוך פלסמיד ממוצע 2 נגזר תחת שליטה inducible של האמרגן GAL1 להבעה cerevisiae ס. על נהלים אלה, דנ א שימש קידוד בוראט פראי-סוג באורך מלא מובילי האפייה Bor1 (ScBor1)11, תודרנית לבנה Bor1 (AtBor1)12, ו סאטיבה אורז Bor3 (OsBor3)13 . קצה קרבוקסילי ב לבנות כל מצורף עם 10 שלו-תג, אתר המחשוף תרומבין מוכנס בין המשגר והתג 10-שלו-כדי לאפשר הסרת שלו, אם רצונך בכך. הפרוטוקול יניחו גם כי פלסמיד כבר הפך DSY-5 ביטוי המתח של cerevisiae במדיה מלאה משלימה סלקטיבית (CSM) חסר היסטידין.
Protocol
1. הכנת מאגרי חשוב ומדיה
- להכין 500 מ"ל של גלקטוז 40% על-ידי הוספת 200 גרם גלקטוז ו מים מיוננים הנפח הכולל של 500 מ"ל. השתמש פלטה או מיקרוגל כדי להגביר את הקצב של גלקטוז נכנס פתרון. מסנן סטרילי עם מנגנון סינון ואקום המורכב מלמעלה מסנן 0.2 µm המצורפת לבקבוק זכוכית סטריליים.
הערה: כל פתרונות מדיה מוכנות באמצעות מים מיוננים. - להכין 500 מ של 40% גלוקוז על-ידי הוספת 200 גר' גלוקוז ומים הנפח הכולל של 500 מ"ל. אוטוקלב לחטא.
- בכל אחת מארבע המבחנות 2 ל', להוסיף 0.4 גר' תערובת תוספת מלאה ללא היסטידין (CSM-שלו), 3.35 g שמרים חנקן הבסיס עם אמוניום סולפט (YNB + חנקן), 475 מ ל מים. אוטוקלב. להוסיף 25 מ של 40% גלוקוז להשיג ריכוז הגלוקוז הסופי של 2%.
- להוסיף, בקבוק זכוכית, 50 גרם peptone של 25 גרם תמצית שמרים ומים עד 375 מ"ל. אוטוקלב. הוסף 125 מ של 40% גלקטוז לתת 5 x שמרים peptone (YP) פתרון המכיל 10% גלקטוז.
- להוסיף, אל בקבוק 250 מ ל, 0.04 g CSM-שלו, 0.335 גרם YNB + חנקן ומים 47.5 מ ל. אוטוקלב. להוסיף 2.5 מ של 40% גלוקוז כדי לקבל 50 מ של שלו-CSM + YNB + 2% גלוקוז.
- הכן 1 ליטר של 1 מ' טריס pH 7.0 באמצעות ערבוב 121.14 גר' טריס הבסיס עם 800 מ ל מים. להוסיף חומצה הידרוכלורית מרוכזת עד ה-pH מגיע 7.0. להוסיף נפח סופי של 1 ליטר מים, עוברים דרך מסנן 0.2 µm.
- הכן 500 מ"ל של 0.5 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) pH 8.0 על ידי ערבוב 73.06 גר' EDTA עם 400 מ ל מים. הוסף נתרן הידרוקסידי כדורי עד EDTA פיזר ומגיע ה-pH 8.0. להוסיף נפח סופי של 500 מ"ל מים, עוברים דרך מסנן 0.2 µm.
- הכן 100 מ של 100 מ מ phenylmethanesulfonyl פלואוריד (PMSF) על ידי ערבוב 1.74 גר' PMSF עם אתנול הוכחה 200. חנות ב-20 ° C.
- להכין 225 מ של 2 x חרוז שטיפת מאגר של 50 מ מ טריס pH 7.0, 1.4 מ' NaCl, 20% גליצרול, 1 מ מ EDTA pH 8.0.
- הכן 100 מל המאגר כרומטוגרפיה אי-הכללה של גודל (מאגר S200) בהיקף של 20 מ מ 4-Morpholinoethanesulfonic מימה חומצה (MES) pH 6.5, 100 מ מ NaCl, גליצרול 2% ו- 0.03% n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM).
- הכן 100 מ של הממברנה resuspension מאגר המורכב 50 מ מ טריס pH 7.0, 500 מ מ NaCl, ו-10% גליצרול.
- הכינו 10 מ"ל של 3 x מרחביות-דף הטעינה לצבוע על ידי ערבוב 3 מ ל 20% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות), 3 מ ל גליצרול, 2.4 mL 1 מ' טריס pH 6.8, כחול bromophenol g 0.03 נקודות ו- 1.6 mL מרקפטואתנול.
2. ביטוי של בוראט טרנספורטר ב cerevisiae ס
- לחסן שלוש מושבות שמרים טרנספורמציה ב 50 מ של שלו-CSM + YNB + 2% גלוקוז מדיה ו- shake לילה ב rpm 190-30 ° C.
- למחרת היום להשתמש ספקטרופוטומטרים לקביעת הצפיפות האופטית באורך-גל של 600 nm (OD600) ואת לחסן יתר600 של 0.01 של ארבע המבחנות 2 ל' כי אחד מכיל 500 מ"ל של שלו-CSM + YNB + 2% גלוקוז מדיה.
- לנער-190 סל ד ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 h לאפשר לתאים לצרוך גלוקוז כל ולגדול צפיפות גבוהה.
הערה: זמן צמיחה ארוך יותר תוצאות בתא גדול יותר מניב, התשואות שנקטפו ממברנה גדולות יותר, ותשואות בסופו של דבר גדול יותר חלבון מטוהרים. - זירוז הביטוי על-ידי הוספת 125 מ של מדיה x YP 5 בתוספת 10% גלקטוז עבור ריכוז אינדוקציה הסופי של 2% גלקטוז. לנער-190 סל ד ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
- קציר תאים על-ידי ספינינג ב x 4,000 גרם במשך 15 דקות Resuspend התאים 100 מ ל מים קרים.
הערה: בשלב זה התאים יתכן מוקפאות ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן, או ההכנות רשאי להמשיך לתוך התא פירוק קצירת ממברנה. בדרך כלל נקצור 40-45 גרם של תאים.
3. קציר של שמרים ממברנות
- הוסף התא resuspension 11.25 מ של 1 מ' טריס pH 7.0, mL 0.45 של 0.5 M EDTA, 2.25 מ של 100 מ"מ PMSF, האחרון ששתיים מהן להתנהג כמו מעכבי פרוטאז. להוסיף מים נפח סופי של 225 מ ל, דבר המתבטא תא resuspension מאגר של 50 מ מ טריס pH 7.0, 1 מ"מ EDTA, ו- 1 מ מ PMSF.
הערה: אם באמצעות קפוא תאים לאפשר תאים להפשיר ביסודיות, בערך 1 h בטמפרטורת החדר, כי אם הם נשארים קפוא חלקית, הם יתנגדו פירוק ממכות חרוז. - הוסף את resuspension תא לתוך מיכל מתכת 450 מ עבור חרוז פועם. בנוסף האחסון הנותרת עם חרוזי זכוכית קר 0.5 מ מ.
- להרכיב תא חרוז-מכות עם הרוטור, לטבול באמבט קרח. לבצע שישה פולסים 1 דקות, המופרדים באמצעות נקודות מנוחה 2 דקות כדי למנוע התחממות יתר של lysate.
- להרכיב מנגנון סינון ואקום באמצעות פלסטיק המסנן העליון בקבוק חד פעמי נדפק לתוך בקבוק זכוכית. הסר סינון ממברנה, כי המכשיר מפלסטיק הנותרים יכולים ללכוד את החרוזים ובמקביל לאפשר lysate לעבור. להפריד את החרוזים lysate מאת לשפוך את התוכן של תא מכות חרוז על מכלול בשעת החלת את הואקום.
- רחץ תא מכות חרוז 225 מ של 2 x שטיפת מאגר המכיל 50 מ מ טריס pH 7.0, 1 מ"מ EDTA, 1 מ PMSF, 1.4 M NaCl, 20% גליצרול. לרוקן את התוכן של התא אל החרוזים לרחוץ אותם.
הערה: לשטוף את מעניקה נפח סופי של תאים ~ 450 מ ל lysed, באופן משמעותי התשואות מגביר שנקטפו ממברנה. ריכוז סופי 50 מ מ טריס pH 7.0, 1 מ"מ EDTA, 1 מ PMSF, גליצרול 10% ו- 700 מ"מ NaCl, המטרה העיקרית של העלאת ריכוזי המלח נועדה לסייע מביצועם חלבוני ממברנה פריפריאלי. - ספין למטה התא lysate למשך 15 דקות ב 15,000 x g. שופכים את תגובת שיקוע לתוך בקבוקים פוליקרבונט ו ספין עבור h 1 x 135,000 g ב- ultracentrifuge כדי לאסוף ממברנות.
הערה: אם ultracentrifuge אינה זמינה, ממברנות שייאסף על ידי ספינינג עבור h 3 53,000 x g, כוח זה בהגעה צנטריפוגות דגם קומה. - למחוק את תגובת שיקוע ולשקול הבקבוקים עם כדורי ממברנה. Resuspend כדורי ממברנה כ 35 מ ל ממברנה resuspension מאגר המכיל 50 מ מ טריס pH 7.0, 500 מ מ NaCl, ו-10% גליצרול ולהוסיף douncer זכוכית. שוקלים הצינורות צנטריפוגה ריק כדי לקבוע את המסה של ממברנות שנקטפו.
הערה: הקציר קרום יעיל, המשקל של ממברנות יהיה שווה לכ-20% המשקל של תאים המשמשים את הקציר ממברנה. פרוטוקול זה נותן תא אופייני תשואות של 40-45 g, ובכך אנחנו גם מצפים תשואה של 8-9 גרם ממברנות. - דאונס homogenize על פקיעת קרומים, וכן aliquot לתוך צינורות חרוט 50 מ ל כי כעת ניתן לאחסן באופן בלתי מוגבל ב- 80 ° c
הערה: עבור ניסוי זה, בדרך כלל שני aliquots נעשים, כדי לאפשר purifications שני חלבונים נפרדים ניתן לבצע הכנה אחד התא המקורי.
4. solubilization וטיהור חלבונים
- כדי גביע להוסיף בר stir, 150 מ"ג של n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) לכל ממברנה g בשימוש. לשמור חלבון על הקרח או ב 4 ° C בכל עת.
הערה: DDM היגרוסקופי ויש לאחסן בצנצנת זכוכית עם סופג לחות ב-20 ° C כאשר אינו בשימוש. כמו כן, זה אופייני לשימוש בין 4-5 גר' ממברנות טיהור להשיג סכום ניכר של פרוטאין טהור. - הפשרת ממברנות ולהביא נפח סופי של 15 מ"ל לכל ממברנה g במאגר resuspension ממברנה בתוספת 1 מ PMSF ו- 20 מ מ imidazole pH 8.0. להוסיף. הספל עם DDM ממברנות ומערבבים עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
הערה: ריכוז DDM תהיה 1% w/v, אבל solubilization של הממברנה חלבונים זה יותר קריטי להיות מודעים המסה של דטרגנט הוסיף לכל ממברנה g. - ספין במשך 25 דקות ב x 135,000 g ב- 4 ° C עד הצניפה חומר שאינו solubilized. לסנן את תגובת שיקוע דרך מסנן מזרק 5 מיקרומטר.
- עומס המדגם משאבת סחרור להגדיר קצב זרימה של 1 מ"ל/דקה על גבי עמודת זיקה ניקל קיבוע 1 מ"ל equilibrated ב- 20 מ מ טריס pH 7.0, 500 מ מ NaCl, גליצרול 10%, 20 מ מ imidazole pH 8.0 ו 0.05% DDM.
הערה: חלבונים לביטוי התחתון, טוהר משופרת, התשואות נצפו באמצעות 1 מ"ל במקום העמודה מ ל ו ניקל במקום קובלט יונים עבור כרומטוגרפיית זיקה. - לשטוף את העמודה עם 10 כרכים עמודה של מאגר שטיפת המכיל 20 מ מ טריס pH 7.0, 500 מ מ NaCl, גליצרול 10%, 80 מ מ imidazole pH 8.0 ו 0.05% DDM.
הערה: ריכוז imidazole יכול לשמש במהלך שוטף על חלבון 10-שלו-מתויג היא גבוהה יותר מאשר בדרך כלל מוערכת ותוצאות טוהר משופרת. - Elute החלבון של מאגר המכיל 20 מ מ טריס pH 7.0, 200 מ"מ NaCl, גליצרול 10%, 300 מ"מ imidazole pH 8.0 ו 0.05% DDM. לאסוף את eluate בחלקים 1 מ"ל עשר ולהפעיל על טריס-גליצין מרחביות-דף 4-20% ג'ל יחד עם שברים lysate ואת כביסה solubilized.
- בריכת פסגת שברים, בדר כ 5-6 מ"ל, ולהתרכז 500 µL או פחות נפח 50 kDa רכז הקיצוץ ומפרידה benchtop בקירור ב 4 º C.
הערה: 500 µL הוא אמצעי המרבי טיפוסי מוזרק גודל אי-הכללה של עמודות כרומטוגרפיה (שניות). בשלב זה החלבון ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן ב-80 מעלות צלזיוס או להמשיך אל סעיף - לסנן את החלבון דרך מסנן עמודה ספין 0.2 µm ולהזריק לתוך גודל אי-הכללה של עמודה (למשל, Superdex-200) equilibrated במאגר S200: 20 מ מ Mes pH 6.5, 100 מ מ NaCl, גליצרול 2% ו- 0.03% DDM.
הערה: עבור הבאים גלוטראלדהיד cross-linking assay, סוכן חציצה אינו יכול להכיל אמין העיקרי. שניה הוא הזדמנות להחליף מאגרי במידת הצורך, כפי שנעשה כאן בעת החלפת טריס עבור Mes. - הפעל שיא שברים בעמוד 4-20% טריס-גליצין מרחביות-ג'ל. כתם הג'ל לאסוף את שיא טהור שברים, להתרכז רכז kDa-הפסקת 50 ב 4 º C.
- לקבוע ריכוז החלבון על ידי מדידת את ספיגת באורך-גל של 280 ננומטר, החנות ללא הגבלת זמן-80 מעלות צלזיוס.
5. גלוטראלדהיד cross-linking Assay
- להכין תגובה µL 10 על ידי ערבוב 3 µL של 0.5 מ"ג/מ"ל חלבון במאגר S200, 5 µL S200 מאגר, 1 µL של מים או 20% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות), ואחריו 1 µL של 1.5% גלוטראלדהיד.
הערה: זה ייתן תגובה 1 x של גלוטראלדהיד חלבון ו- 0.15% 0.15 מ"ג/מ"ל. דוגמאות המכיל טיפול טרום למען חברה דמוקרטית הם פקדים שלילית חשוב צריך להיות מעורב, מודגרות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות לפני הוספת גלוטראלדהיד. - דגירה התגובה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לסיים את התגובה על-ידי הוספת 5µL של 3 x ג'ל מרחביות-דף בטעינת צבע, אשר מכיל עודף של מאגר טריס המרווה את גלוטראלדהיד.
- לטעון כל 15 µL על גבי ג'ל טריס-גליצין מרחביות-דף 4-20%, אשר יטען 1.5 µg חלבון ליום ליין. להפעיל את הג'ל ב- 200 וולט במשך 30 דקות הכתם, לקבוע את היקף דיימר cross-linking על ידי עדות להקה הפועלת ב כפול מהגודל מונומר denatured.
הערה: גלוטראלדהיד טיטור בעלת מסלול הזמן ניתן לבצע תחילה למצוא את התנאים הטובים ביותר עבור נהג homomeric.
Representative Results
ג'לים אופייני לשברים eluted מלבצע ניקל כרומטוגרפיית זיקה להראות כל שלושה חלבונים מטוהרים חלקית (איור 1א'). בצד ימין של הסולם הוא lysate, אשר בכל מקרה ומקרה אינה מראה להקה משמעותי המתאים המשגר בוראט האופייני עבור חלבונים לא overexpress טוב. במסלול רחיצת 80 מ מ מציגה הפסד מינימלי של 10-שלו-מתויג חלבון למרות הריכוז גבוה יחסית imidazole. להקות המתאים למעליות בוראט ניכרים בקלות בחלקים eluted, שברים ייחשב להכיל את עיקר החלבון eluted מרוכזים לפני הזרקת אל העמודה סינון S200 ג'ל. בשלב זה, החלבונים כבר מספיק טהור עבור יישומים רבים במורד הזרם, כמצוין על-ידי להקות נוספות במדגם מרוכזים לפני הזרקת אל העמודה S200 (איור 1B). עם זאת, מזריק את הדגימה אל העמודה אי-הכללה של גודל מגלה eluted שברים של טוהר גבוהה (איור 1בג). Chromatograms וג'ל המקביל שלהם עבור כל אחד למעליות בוראט מוצגים. למרות הטוהר מתונה של הדגימות על • תנאי מן כרומטוגרפיית זיקה, החלבון הוא הטהור מאד על eluting מן העמודה סינון ג'ל. אנושות, chromatograms לחשוף כל חלבון כדי להעביר בעיקר בתור לשיא monodisperse יחיד עם קצת חלבונים בתוך חלל האחסון. חלבון מקופל ויציבה בדרך כלל נותן monodisperse עם שיא סימטרית, בעוד חלבון לא יציב, misfolded או צבורים בדרך כלל ייתן מספר פסגות אסימטרי או לשיא גדול באמצעי האחסון void. . זה אופייני כדי להשיג תשואה הסופי של 2 מ ג מטוהרים חלבון ליום L של שמרים התרבות ScBor1, כ 1 מ ג כל מטוהרים AtBor1, OsBor3 לכל תרבות L המספרים האלה כמות החלבונים מכל אחד aliquot של 4-5 גר' ממברנות, שמקורה אחד חצי של הכנה התא המקורי שלנו.
הניסוי cross-linking מראה כי מובילי מטוהרים homomeric יכולות להיות ההרכבה שלהם בפתרון ברצון העריך (איור 2). המטרה של הדגימות המכיל טיפול טרום למען חברה דמוקרטית היא להראות כי cross-linking היא תלויה במצב מקופל פתרון, כי cross-linking ולכן אינו מתרחש multimerization מופרת על ידי חומר ניקוי קשים. התוצאות הראו להבחין כי אחד למעליות בוראט שלוש, ScBor1, הוא לא dimerized כאשר מטוהרים ב- DDM בתנאים אלה, ואילו השניים האחרים, AtBor1, OsBor3, קשר צולב ולהראות dimerization. . זה ניתן לראות כי לא כל החלבון ייתכן קשר צולב. בדוגמה זו, כמות מזערית של מונומר OsBor3 גלויים, בעוד AtBor1 cross-links עד לסיומו. היקף cross-linking יהיה תלוי המספר של ליזין שאריות בסמיכות אחד לשני, זה אפשרי כי ריאגנטים cross-linking אחרים ייתכן ביעילות קשר צולב חלבוני ממברנה שונים.
איור 1 . ניקל זיקה וגודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה טיהור עבור שלושה מובילי בוראט. כל אנכי לוח (א), (B), ו (C) מכיל נתונים עבור ScBor1, AtBor1 OsBor3. (א) ניקל זיקה עמודה. מ' הוא סולם של סמני משקל מולקולרי עם משקולות בחדר kDa שצוין משמאל. L הוא גולמי lysate, W בכביסה imidazole 80 מ מ. כל הנתיבים ממוספרות אחרים מקבילים שברים 1 מ"ל eluted עם 300 מ"מ imidazole. ברים מעל שברים מצביעים על אשר נבחרו להיות משולב, מרוכז לזריקות אל העמודה. P (B) מציין ופרוטאין מרוכז לפני הזרקת אל העמודה S200. Eluted שניה שברים הם מימין, עם סוגריים משמש להתאמה של ג'ל מסלולים עם שברים chromatogram שלהם (C). חלל האחסון הוא רק אחרי 8 מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . Cross-linking assay מעריך מובילי מטוהרים להרכבה multimeric- סולם עם משקולות מולקולרית מצוינת מצד השמאל. ומעל הכל נתיבים אחרים מוצג שבו חלבון קיים, המדגם היה גלוטראלדהיד הוסיף או טיפול טרום למען חברה דמוקרטית לפני חיבור גלוטראלדהיד. חיצים מציינים את העמדות של מונומר, דימר עבור AtBor1 ו- OsBor3. ScBor1 הוא חלבון קטן יותר מאשר AtBor1, OsBor3, פועלת כצפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
כאן יש לנו משותפים פרוטוקולים מפורט כי התוצאה הטיהור כדי ההומוגניות של שלושה ייחודי בוראט האיקריוטים מובילי. הפרוטוקולים המובאת כאן נגזרים מתוך פרוטוקולים אחרים עבור הביטוי של חלבוני ממברנלי אינטגרלי cerevisiae ס1,14, והתוצאה אופטימיזציות שלנו טוהר משופרים והן התשואות משופרת. הפרמטרים אופטימיזציה כאן כוללים תא התרבות הצמיחה כרכים, פעמים, חרוז-מכות הליכי פירוק, מאגר הרכב במהלך פירוק התא ולזהות חלבון טיהור, כמות דטרגנט המשמש לכל גרם קרום, יון מתכת זיקה טיהור. נפח של עמודת זיקה, ועל ביצוע וזמינותו cross-linking כדי להעריך את התאמתו homolog, חומרי ניקוי על-ידי הערכת מצב multimeric שנאים oligomeric. הפרוטוקולים הם מוצלח עבור מספר homologs SLC4 מן הצמח מינים פטרייתי. מגבלה של אסטרטגיות כל ולטיהור חלבוני ממברנלי אינטגרלי הוא שקיים אין שיטת טיהור חלבון ממברנה אוניברסלי מובטח לעבוד. זה אפשרי כי הפרוטוקולים שלנו הם ככל הנראה יהיה מוצלח עבור חלבונים קרוב רצף הזהות ואת מבנה שנאים SLC4, ובכך מבני משפחותיהם SLC4, SLC23 ו- SLC26 יכול להיות מבטיח מטרות15. באופן דומה, נהג ממברנה ייתכן הרחוק יותר אבולוציונית של בוראט למעליות, כך גדל הסיכוי הפרוטוקול יהיה חייב להיות שונה, כגון על ידי שינוי במערכת הביטוי, חומרי ניקוי או פרמטרים מרכזיים אחרים4.
הפרוטוקול מנצל התג זיקה הנפוץ חלבון טיהור, התג שלו. למרות נוכחותם של זיהומים שברים eluted הראשונית, השילובים של זיקה ניקל, מקיף וטוהרה עוקבות שניה תוצאות החלבון נקיים במיוחד. 10 שלו-תג מאפשר imidazole מחמירים יותר שוטף ובכך יוכל להסיר רקע נוסף מחייב חלבונים מאשר ניתן להסיר ב שוטף מותרת על ידי 8-שלו - או 6-שלו-תגיות. הבחירות שלנו עבור שברים טהור לטעות מהצד השמרני של שברים ג'ל טהור מאוד רוב, אשר תואמות את השברים שניה שיא. התשואות החלבון הסופי יכול להיות מוגברת על ידי איגוד וריכוז שברים יותר, אמנם עם החלופה של פרוטאין טהור קצת פחות. השיטות המובאות כאן זמין הטיהור של AtBor1 בכמויות שהובילו הקביעה של שלה מבנה הגביש7, עם הבדלים טיהור המורכב כורתים את התג שלו והחלפת המשגר לתוך שונה מה שהוא עושה כדי לשפר את קריסטל עקיפה7.
פרוטוקול שלנו מעלה שיקולים חשובים עבור הבחירה של homologs ושל הנוזל נהגו solubilize לטהר אותם. DDM הוא הבחירה הראשונה נפוצות עבור דטרגנט בגלל שזה מתון יחסית ומצליח לעיתים קרובות ב solubilizing, נעשה שימוש במחקרים מבניים ופונקציונליים של מגוון רחב של חלבוני ממברנה. בקביעת אם חומר ניקוי היא בחירה גרועה עבור קרום, שיטה נפוצה ההערכה הוא אם החלבון נותן לשיא monodisperse בודד על chromatogram שניה, במקום לשיא גדול חלל האחסון או מגוון של פסגות polydisperse, אשר מצביעים על חלבונים misfolded או לא יציב. שיקול יותר עדין מופעל על ידי טיהור שלנו של ScBor1. זה מטהר בכמויות גדולות, נראה חיובית ואת monodisperse על chromatogram שניה, שמצביע על שזה יכול להיות ליעד אטרקטיבי ללימודי מבנית. עם זאת, שלנו assay cross-linking מגלה כי זה מונומר כאשר מטוהרים. אמנם זה אפשרי כי ScBor1 יכול להתקיים באופן מקורי כמו מונומר בתא, מחקרים מראים כי מובילי SLC4 ו- homologs שלהם צפויים להיות הדימרים7,8,9,10. שלנו התפתחות וזמינותו cross-linking אירעה לאחר התגבשות ופתרון המבנה של AtBor1. עם זאת, היינו יכולים להעריך ScBor1 בהשוואה AtBor1 עם cross-linking וזמינותו, מאמצי מחקר וזמן יקר יכול נותבו לרדיפת AtBor1 במקום ScBor1, אשר בסופו של דבר הוא לא היה לא מוצלח ניסויים התגבשות ואת עקיפה. כך assay הזה יכול לסייע החוקרים להבדיל בין homologs או חומרי ניקוי להשתמש בעת מימושה מבניים מחקרים כדי לתעדף התנאים שבה החלבון שומרת קונפורמציה יליד חשד שלה. בנוסף, וזמינותו יכול לשמש כדי לחקור איזה חומצות אמינו הם קריטיים עבור multimerization, על מנת למצוא תחליפים חומצת אמינו זה לערער את ממשק multimerization ולהוביל המחייבות מונומרים. גישה כזו שימש כדי לחקור את משמעות תפקודית homomeric הרכבה ממברנה מובילי16,17,18.
יתרון הכללית של השיטה שלנו היא כי שמרים הוכח כדי לאפשר הביטוי של חלבונים רבים ממברנה מאתגר של הפונקציה מגוונות1. בנוסף, עלות נמוכה וזמני הצמיחה שלה לקדם שלה נגישות עבור מאמצי מחקר רבים שעשויים להיות פחות ופחות מסוגל להשתמש באסטרטגיות ביטוי הדורשים תרביות רקמה או מדיה צמיחה יקר. ההליכים המובאים כאן הם זולים יחסית, יכול להתבצע תוך שבוע, אשר מדגישה את הכדאיות של הגישה. יישום של פרוטוקולים אלה יכולים לעזור להפעיל מחקרים מבניים ופונקציונליים של חלבוני ממברנה מאתגר אחרים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי אתחול קרנות ב מכללת דוידסון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Andréll, J., Tate, C. G. Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).
- Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).
- Coudray, N., et al. Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation. Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).
- Arakawa, T., et al. Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3. Science. 350 (6261), 680-684 (2015).
- Huynh, K. W., et al. CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Zhao, R., Reithmeier, R. A. Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).
- Takano, J., et al. Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature. 420, 337-340 (2002).
- Nakagawa, Y., et al. Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading. Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).
- Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast. Methods in Enzymology. 470, Issue C (2010).
- Chang, Y. -N., Geertsma, E. R. The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers. Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).
- Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Design, function and structure of a monomeric ClC transporter. Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).
- Last, N. B., Miller, C. Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter. Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).
- Yu, X., et al. Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters. Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).
