Profilage et identification de Nitropeptide illustrépar Angiotensin II

Shan Feng; Xiaofei Wen; Xin Lu

doi:10.3791/59391

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Profilage et identification de Nitropeptide illustrépar Angiotensin II

5.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/59391

⸱

16 juin 2019

Shan Feng¹^,² , Xiaofei Wen³ , Xin Lu²^,⁴^,⁵^,⁶

¹Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, ²Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, ³Department of Urology, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, ⁴Boler-Parseghian Center for Rare and Neglected Diseases, University of Notre Dame, ⁵Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame, ⁶Tumor Microenvironment and Metastasis Program, Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center

Dans cet article

Résumé

Le profilage protéomique des protéines tyrosine-nitrated a été une technique provocante due à la basse abondance de la modification de 3-nitrotyrosine. Ici nous décrivons une approche nouvelle pour l'enrichissement et le profilage de nitropeptide en utilisant Angiotensin II comme modèle. Cette méthode peut être étendue à d'autres systèmes in vitro ou in vivo.

Résumé

La nitration protéique est l'une des modifications post-traductionnelles les plus importantes (PTM) sur les résidus de tyrosine et elle peut être induite par des actions chimiques d'espèces réactives d'oxygène (ROS) et d'espèces d'azote réactif (RNS) dans les cellules eucaryotes. L'identification précise des sites de nitration sur des protéines est cruciale pour comprendre les processus physiologiques et pathologiques liés à la nitration de protéine, tels que l'inflammation, le vieillissement, et le cancer. Étant donné que les protéines nitrates sont de faible abondance dans les cellules, même dans des conditions induites, aucune méthode universelle et efficace n'a été mise au point pour le profilage et l'identification des sites de nitration des protéines. Ici nous décrivons un protocole pour l'enrichissement de nitropeptide en utilisant une réaction chimique de réduction et l'étiquetage de biotine, suivi de la spectrométrie de masse de haute résolution. Dans notre méthode, les dérivés du nitropéeptide peuvent être identifiés avec une grande précision. Notre méthode présente deux avantages par rapport aux méthodes précédemment rapportées. Tout d'abord, l'étiquetage du diméthyle est utilisé pour bloquer l'amine primaire sur les nitropéeptides, qui peut être utilisé pour générer des résultats quantitatifs. Deuxièmement, une liaison de disulfure contenant nhs-biotine réactif est utilisé pour l'enrichissement, qui peut être encore réduit et alkylé pour améliorer le signal de détection sur un spectromètre de masse. Ce protocole a été appliqué avec succès au modèle peptide Angiotensin II dans le document actuel.

Introduction

La nitration des résidus de tyrosine dans les protéines pour former 3-nitrotyrosine régule de nombreux processus biologiques. En raison des différentes propriétés chimiques entre la tyrosine et la 3-nitrotyrosine, une protéine nitrated peut avoir perturbé l'activité de signalisation¹^,². Par conséquent, il est important de développer des méthodes qui peuvent enrichir et identifier efficacement les sites de nitration sur les protéines. Comme la 3-nitrotyrosine est une modification de faible abondance sur les protéines par rapport à d'autres formes de PTM, comme la phosphorylation et l'acétylation, il est diffici....