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Les modèles de xénogreffe (PDX) dérivés du patient récapitulent plus solidement les caractéristiques moléculaires et biologiques du mélanome et sont plus prédictifs de la réponse thérapeutique par rapport aux essais traditionnels fondés sur la culture des tissus plastiques. Nous décrivons ici notre protocole d'exploitation standard pour l'établissement de nouveaux modèles PDX et la caractérisation/expérimentation des modèles PDX existants.
L'accumulation des preuves suggère que les propriétés moléculaires et biologiques diffèrent dans les cellules de mélanome cultivées dans les vaisseaux traditionnels de culture de tissu bidimensionnels contre in vivo dans les patients humains. Ceci est dû à la sélection de goulot d'étranglement des populations clonales des cellules de mélanome qui peuvent fortement se développer in vitro en l'absence de conditions physiologiques. De plus, les réponses à la thérapie dans les cultures tissulaires bidimensionnelles dans l'ensemble ne reflètent pas fidèlement les réponses à la thérapie chez les patients atteints de mélanome, la majorité des essais cliniques ne démontportant pas l'efficacité des combinaisons thérapeutiques qui se sont avérées efficaces dans Vitro. Bien que le xénogreffedes de cellules de mélanome chez la souris fournit le contexte physiologique in vivo absent des essais bidimensionnels de culture de tissu, les cellules de mélanome employées pour l'engraftment ont déjà subi la sélection de goulot d'étranglement pour des cellules qui pourraient se développer sous conditions bidimensionnelles lorsque la lignée cellulaire a été établie. Les modifications irréversibles qui se produisent à la suite du goulot d'étranglement comprennent des changements dans les propriétés de croissance et d'invasion, ainsi que la perte de sous-populations spécifiques. Par conséquent, les modèles qui récapitulent mieux la condition humaine in vivo peuvent mieux prévoir des stratégies thérapeutiques qui augmentent effectivement la survie globale des patients présentant le mélanome métastatique. La technique de xénogreffe (PDX) dérivée du patient implique l'implantation directe des cellules de tumeur du patient humain à un destinataire de souris. De cette manière, les cellules de tumeur sont uniformément cultivées sous des contraintes physiologiques in vivo et ne subissent jamais le goulot d'étranglement bidimensionnel, qui préserve les propriétés moléculaires et biologiques présentes quand la tumeur était dans le patient humain. Notable, les modèles PDX dérivés de sites d'organes de métastases (c.-à-d. le cerveau) présentent une capacité métastatique similaire, tandis que les modèles PDX dérivés de patients naïfs et de patients ayant une résistance acquise à la thérapie (c.-à-d. la thérapie inhibitrice BRAF/MEK) présentent un affichage sensibilité similaire à la thérapie.
Les modèles précliniques sont essentiels pour tous les aspects de la recherche translationnelle sur le cancer, y compris la caractérisation des maladies, la découverte de vulnérabilités exploitables propres au cancer par rapport aux cellules normales, et le développement de thérapies efficaces qui exploitent ces vulnérabilités pour augmenter la survie globale des patients. Dans le domaine du mélanome, des dizaines de milliers de modèles de lignées cellulaires ont été fortement utilisés pour le dépistage des médicaments, avec 4 000 euros de contribution de notre seul groupe (série WMXXX). Ces modèles de lignée cellulaire ont été dérivés de patients atteints de mélanome présentant diverses formes de mélanome cutané (c.-à-d. la propagation acraleuse, uveale et superficielle) et de divers génotypes (c.-à-d., BRAFV600-mutant et neuroblastome RAS viral oncogene homolog [ NRAS (En) Q61R-mutant]), qui couvrent le spectre de la maladie présente dans la clinique1,2.
Sans équivoque, la stratégie thérapeutique la plus réussie et ciblée dans le domaine du mélanome est née de 1) la caractérisation génomique des tumeurs des patients identifiant les mutations BRAF dans 50% des mélanomes3 et de 2) l'enquête préclinique tirant parti des modèles de lignée cellulaire du mélanome4. La combinaison d'inhibiteurs BRAF/MEK a été approuvée en 2014 par la Food and Drug Administration (FDA) pour le traitement des patients dont les mélanomes abritent l'activation des mutations BRAFV600E/K et bénéficie d'un taux de réponsede 5. Malgré cette efficacité initiale, la résistance surgit rapidement dans presque tous les cas en raison des mécanismes intrinsèques et acquis multiples de résistance et de l'hétérogénéité intratumorale. Malheureusement, les modèles de lignées cellulaires ne récapitulent pas l'hétérogénéité biologique représentative lorsqu'ils sont cultivés dans une culture bidimensionnelle dans des récipients en plastique, ce qui masque leur potentiel cliniquement prédictif lorsque les chercheurs tentent de déterminer expérimentalement thérapies qui pourraient être efficaces chez les patients présentant une forme spécifique ou un génotype du mélanome6. Comprendre comment modéliser au mieux l'hétérogénéité intratumorale du patient permettra aux chercheurs de mieux développer des modalités thérapeutiques qui peuvent tuer les sous-populations résistantes à la thérapie qui entraînent l'échec aux thérapies actuelles de norme de soins.
La valeur prédictive limitée des modèles de lignées cellulaires est la façon dont ils sont initialement établis. Des altérations irréversibles se produisent dans le paysage clonal de tumeur quand une suspension unicellulaire d'une tumeur de patients est cultivée sur les navires bidimensionnels et de culture de tissu plastique, y compris des changements dans le potentiel proliférant et invasif, l'élimination de spécifique sous-populations, et l'altération de l'information génétique7. Les xénogreffes chez les souris de ces modèles de lignée cellulaire de mélanome représentent la plate-forme in vivo la plus fréquemment utilisée pour les études précliniques ; cependant, cette stratégie souffre également de la récapitulation pauvre de l'hétérogénéité complexe de tumeur observée médicalement. Pour surmonter cette lacune, il y a eu un intérêt croissant dans l'incorporation des modèles précliniques plus sophistiqués du mélanome, y compris le modèle de PDX. Les modèles de PDX ont été utilisés pendant 30 ans, avec des études séminales dans les patients de cancer du poumon démontrant la concordance entre la réponse des patients aux agents cytotoxiques et la réponse du modèle de PDX dérivé du même patient8. Récemment, il ya eu une volonté d'utiliser des modèles PDX comme l'outil de choix pour les enquêtes précliniques à la fois dans l'industrie et dans les centres universitaires. Les modèles de PDX, en raison de leur récapitulation supérieure de l'hétérogénéité de tumeur dans les patients humains, sont plus médicalement pertinents à employer dans des efforts d'optimisation de thérapie que les xénogreffesdeligne cellulaire 9. Dans le mélanome, il y a d'immenses obstacles qui émoussent la gestion thérapeutique de la maladie avancée10. Des modèles De PDX cliniquement pertinents ont été utilisés pour modéliser la résistance clinique et identifier des stratégies thérapeutiques avec des agents cliniquement disponibles pour traiter les tumeurs résistantes à la thérapie11,12. En bref, le protocole présenté ici pour générer des modèles de PDX exige l'implantation sous-cutanée de tissu frais des mélanomes primaires ou métastatiques (recueillis par biopsie ou chirurgie) dans les souris nulles de NOD/scid/IL2-récepteur (NSG). Différentes variations de l'approche méthodologique sont utilisées par différents groupes; cependant, un noyau fondamental existe13.
Les protocoles animaux suivants suivent les lignes directrices du comité d'éthique des animaux de l'Institut Wistar et les lignes directrices sur les soins aux animaux.
1. Collection de tissu de tumeur de mélanome
2. Traitement de tissu de tumeur pour l'implantation de souris
3. Implantation et injection de tumeurs chez la souris
4. Surveiller la croissance tumorale
5. Moissonnez la tumeur pour le tissu bancaire, la réimplantation, et l'expérience/caractérisation
6. Essais de thérapie PDX
REMARQUE : Il faudra deux phases d'expansion pour faire pousser assez de tissu tumoral pour générer le nombre nécessaire de souris portant pDX pour l'essai de thérapie.
Le tissu tumoral pour les modèles de mélanome PDX peut provenir d'une variété de différentes sources et peut également être traité par la dynamique de croissance des modèles individuels et l'utilisation désirée du tissu DeX. La priorité lors de l'établissement d'un modèle PDX est d'avoir suffisamment de matériel pour la banque pour une utilisation future et l'ADN pour la caractérisation (figure 1).
Une fois que le matériel suffisant est mis en banque, le tissu de tumeur peut être étendu dans l'une des trois méthodes principales pour se développer assez de tumeur pour effectuer une étude formelle de thérapie (figure 2A). Chacune des méthodes décrites ci-dessous permettra l'expansion de la tumeur de PDXs (Figure 2B). C'est notre expérience que la création d'une suspension unicellulaire des cellules tumorales avec l'utilisation de la digestion enzymatique (collagenase IV) peut permettre une croissance plus rapide de tumeur, et peut permettre une tumeur initiale d'être étendue dans 10 - 20 souris, tandis que le morceau de tumeur et la boue la méthode ne peut être étendue qu'à 5 à 10 souris (figure2C). Comme cela a été précédemment démontré dans d'autres types de tumeur, les modèles de PDX de mélanome reflètent souvent la sensibilité de drogue le patient a montré quand sur la thérapie. Montré ici est une courbe représentative de thérapie d'un patient de mélanome avec le mélanome mutant de BRAFV600E qui a au commencement répondu à un inhibiteur de BRAF mais a finalement rechuté. Le PDX dérivé de ce patient a également montré la sensibilité initiale à l'inhibition de BRAF (Rx1) plus un inhibiteur additionnel (Rx2); cependant, les tumeurs ont finalement rechuté (Figure 3).
Figure 1 : Flux de travail de génération de modèle de PDX pour le tissu de tumeur bancaire et exécutant des études de thérapie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Méthodes d'implantation alternatives. (A) Les tumeurs peuvent être traitées en morceaux, une suspension de boue, ou comme une suspension à une cellule. (B) Les trois méthodes permettront la croissance des tumeurs in vivo. On voit ici des souris sous-cutanées implantées avec une tumeur et représentées 12 jours après l'implantation. (C) Sont montrés sont des courbes de croissance tumorale pour les souris injectées avec l'une des trois méthodes d'implantation. N 5 par bras; les barres d'erreur sont des erreurs standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Données représentatives pour un essai de thérapie PDX. Des souris ont été implantées avec des tumeurs de PDX et traitées avec un contrôle de véhicule ou une combinaison de deux inhibiteurs d'un inhibiteur de BRAF et d'un inhibiteur de MEK. N-6 par bras. La randomisation a été utilisée pour placer des souris dans des groupes d'étude. Il convient de noter, bien que 500 mm3 a été utilisé dans cet exemple comme le volume de tumeur de départ pour l'initiation de la thérapie, le volume de routine pour commencer les études PDX est de 100 à 200 mm3 que les tumeurs PDX sont agressifs et leur croissance est difficile à inhiber une fois qu'ils trop grand un taille (300 mm3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Les modèles de xénogreffe (PDX) dérivés du patient récapitulent plus solidement les caractéristiques moléculaires et biologiques du mélanome et sont plus prédictifs de la réponse thérapeutique par rapport aux essais traditionnels fondés sur la culture des tissus plastiques. Nous décrivons ici notre protocole d'exploitation standard pour l'établissement de nouveaux modèles PDX et la caractérisation/expérimentation des modèles PDX existants.
Les auteurs remercient le Wistar Institute Animal Facility, Microscopy Facility, Histotechnology Facility et Research Supply Center. Cette étude a été financée en partie par des subventions de la U54 (CA224070-01), du SPORE (CA174523), du P01 (CA114046-07), de la Dr Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation et de la Melanoma Research Foundation.
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep ; | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (sans Ca++ ou Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2,5 % Trypsine ; | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquotes stockées à &ndash ; 20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagénase IV (2 000 u/mL) | Worthington ; | Cat #4189 | maquillage en HBSS-/- à partir de stock de poudre de collagénase IV (Worthington #4189, u/mg indiqué sur la bouteille et varie avec chaque lot) ; congeler 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (éthylène glycol bis(2-aminoéthyl éther)-N,N,N' Acide N'-tétraacétique) | Merck | Chat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Chat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Chat # 15290-018 | |
| Gentamicine | FISHER SCIENTIFIC | Chat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN SANTÉ ANIMALE | Chat # 050031 | |
| Le média L15 de Leibovitz ; | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Matrice extracellulaire artificielle |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, en tant qu’analgésique |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Souris | The Wistar Institute, élevage d’animaleries | ||
| PVA (alcool polyvinylique) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X avec L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather Cat | # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Pinces à plaie | MikRon | Cat #427631 |
