Summary
在这里，我们提出了一种自动化血浆蛋白消化方法，用于基于质谱的定量蛋白质组分析。在此协议中，蛋白质变性、还原、烷基化和胰蛋白酶消化反应的液体转移和孵育步骤得到简化和自动化。准备一个96孔板需要大约5个小时，其精度要求。
Abstract
蛋白质组学中质谱分析的样品制备需要将蛋白质酶裂解成肽混合物。这个过程涉及许多孵化和液体转移步骤，以实现变性、减少、烷化和裂解。将此工作流调整到自动化工作站可以提高效率并降低方差系数，从而为样本类型之间的统计比较提供更可靠的数据。我们之前描述了一个自动蛋白酶样本制备工作流程1。在这里，我们报告开发一个更高效和更好的控制工作流程，具有以下优点：1） 液体转移步骤的数量从9个减少到6个结合试剂;2） 使用具有多个通道的 96 位置移液头选择性尖端移液，缩短移液时间;3） 潜在吞吐量因最多 45 个甲板位置的可用性而增加;4） 系统的完整外壳可改善温度和环境控制，降低样品或试剂污染的可能性;和 5） 在每个样品中添加稳定的同位素标记肽以及β-加拉托西塞蛋白，使在整个过程中进行监测和质量控制成为可能。这些硬件和工艺改进提供了良好的可重复性，提高了内部测定和间测定精度（CV 小于 20%）用于基于LC-MS的蛋白质和肽定量。在 96 孔板中消化 96 个样品的整个工作流程可在大约 5 小时内完成。
Introduction
基于质谱法（MS）的蛋白质和肽定量正日益被应用为一种生物分析工具，用于等离子体分析，用于基础研究和临床实验室22、3。3必要的仪器和信息学已经迅速发展，因为MS已成为量化蛋白质或修改蛋白质的选择方法，通过瞄准特定的肽序列，因为它有能力量化数百个肽在一个单一的MS运行4。样品制备是任何蛋白酶分析的基础。在MS分析之前，生物样本中的蛋白质通常是变性、减少、烷基化、消化成锥形肽和脱盐5。烷基能阻断半胱氨酸，以防止不受控制的修饰，并确保所有半胱氨酸具有相同的质量。接下来，胰蛋白酶被添加到肽中消化蛋白质。每个步骤都需要优化，整个过程传统上都是手动执行的，允许引入分析错误。
传统的生物标志物开发管道由两个主要过程组成：用于全球蛋白质发现的猎枪蛋白质组学，以创建深入的蛋白质清单6和靶向蛋白质组学，用于验证和验证，旨在高精度和高通量的蛋白质定量7。无论采用何种 MS 方法，样品制备都是相同的，以蛋白质酶裂解为核心的蛋白转化为肽混合物。正如Van Eyk和Sobhani8所建议的那样，采用一种方法，允许对发现和靶向检测进行准确、精确和可重复的分析，以便有效地将发现生物标志物转移到临床实施化的检测中。为此，样品制备的自动化将很有帮助，并能提高高通量分析的效率。手动方法通常引入超出食品和药物管理局（FDA）在修订后的生物分析方法验证指南中指定的可接受限度范围的分析错误，其中包括生物标志物和诊断22，9。9为了促进生物标志物研究，需要准备和分析数千个生物样品，因此有必要开发快速、高精度、免提的MS蛋白样品制备工作流程。MS 样品制备有许多步骤可以引入错误，该过程既繁琐又耗时。
在我们的改进方法中，对自动化工作站进行了编程，以执行所有必要的血浆样品制备程序，共6个步骤（图1），以确保：1）准确的液体转移;2） 反应在一致时间内启动和停止;3） 反应在受控温度下（即培养箱） 进行;和4）反应对所有反应有均匀的混合。我们还实施了添加外源质量控制蛋白和内部标准（稳定的同位素标记肽标准），以确保以 96 孔格式的 LC-MS 基蛋白和肽定量的质量和可重现的吞吐量。包括试剂制备、工作时间和总共1，000，000个移液步骤将需要处理单个管中的96个样品。自动化减少了实际操作时间和涉及的人工交互次数。
Protocol
1. 自动液体处理程序编程
- 从文件菜单创建新方法 （文件 |新方法）
注： 按给定的顺序完成步骤。斜体字体表示要在 Biomek 软件中键入的文本。有关移液技术和模板的信息，请与作者联系。 - 在表 1中列出的开始步骤变量及其值中键入"开始"变量及其值。
- 设置用于选择性尖端移液的列。对于步骤 1.3-1.7，单击"控制步骤"下工具栏中的"设置全局"步骤并将其拖动到方法。
- 使用"设置全局"步骤，将值=FirstColumn设置为变量FirstColumn_Global，值= LastColumn到变量LastColumn_Global，值=LastColumn-FirstColumn=1到变量列，将值[列]8设置为变量井。
- 在"控制步骤"下的工具栏中选择脚本步骤，并将其拖动到方法。键入如图 2所示的 VB 脚本。
- 设置混合集全局和解决方案的卷。
- 使用"设置全局"步骤，将相应的值设置为卷混合变量，如表 2所示。
- 单击"控制步骤"下工具栏中的"If"步骤并将其拖动到方法。在条件下，键入自动采样器。
- 在"然后"下，单击"控制步骤"下的工具栏中的"设置全局"步骤并将其拖动到方法。
- 使用"设置全局"步骤，将值=（移动阶段+列）=10设置为可变移动PhaseWell。
- 在Else下，单击"控制步骤"下的工具栏中的"设置全局"步骤并将其拖动到方法。
- 使用"设置全局"步骤，将值#0设置为可变MobilePhaseWell
- 配置引导式实验室软件设置 （GLS）
- 单击实用程序下的工具栏中的"甲板编辑器"步骤。创建新的甲板与图 3中的甲板布局相对应，并将其标记为甲板 1。
- 单击"设置与设备"下的工具栏中的引导式设置步骤，并将其拖动到方法。如表 3所示，在甲板上拖动和放置实验室软件类型。之后，如表 3和图 4（设置引导式设置）所示，在表中填写选项卡。
- 设置小费计数过程
- 单击"控制步骤"下工具栏中的"定义过程"步骤并将其拖动到方法。将过程命名为TipCount。
- 单击"控制步骤"下工具栏中的脚本步骤并将其拖动到方法。键入如图 5所示的 VB 脚本（提示计数脚本）。
- 单击"控制步骤"下工具栏中的"If"步骤并将其拖动到方法。
- 在条件下，类型TL5 = 0。
- 在"然后"下，单击工具栏中的"设置和设备步骤"下的"移动实验室软件"步骤，并将其拖动到方法。将实验室软件从TL5移动到TR3。单击工具栏中的"移动实验室软件"步骤，在"设置和设备步骤"下将其拖动到方法。将实验室软件从TL2移动到TL5。最后，单击"设置与设备步骤"下的工具栏中的"移动实验室软件"步骤，并将其拖动到方法。将实验室软件从BC90移动到TL2。
- 孵化器的界定程序
- 单击"控制步骤"下工具栏中的"定义过程"步骤并将其拖动到方法。将过程命名为培养箱。
- 将"半时"键入变量名称，将 1800键入默认值。
- 在NextTemp中键入变量名称，将 22键入默认值。
- 将温度键入为变量名称，将 60键入默认值。
- 单击"设置与设备步骤"下的工具栏中的增强移动实验室软件步骤，并将其拖动到方法。将实验室软件从P11移动到INHECO1。
- 单击"控制步骤"下工具栏中的"运行过程"步骤并将其拖动到方法。将过程命名为"提示计数"。
- 单击"集成"下工具栏中的INHECO 孵化步骤并将其拖动到方法。键入INHECO1用于在位处使用设备，为 [孵化的半程，为 °C的温度和3表示目标温度的 °C。选择孵育时摇动选项和轨道（顺时针） 摇动样式。对于设置，键入1.00 mm 并排，6.6次每秒，向前键入 1.00毫米，向后键入6.6次。
注：确保安装了INHECO孵化器软件。 - 单击"集成"下工具栏中的INHECO 孵化步骤并将其拖动到方法。键入INHECO1用于在位处使用设备，为 [孵化的半程，为 °C的温度和3表示目标温度的 °C。选择在孵育时摇动选项和轨道（逆时针） 摇动样式。对于设置，键入1.00 mm 的两侧，每秒 6.6次，向前和向后键入1.00 mm，每秒6.6次。
- 单击"设置与设备步骤"下的工具栏中的"暂停"步骤，并将其拖动到方法。将整个系统暂停1 s。
- 单击"控制步骤"下工具栏中的"定义过程"步骤并将其拖动到方法。将过程命名为培养箱。
- 单击"集成"下工具栏中的INHECO 孵化步骤并将其拖动到方法。键入INHECO1用于在位处使用设备，1用于孵化，#下一个温度为 °C，3 表示目标温度的 °C。 3
- 轨道定义程序。
- 单击"设置与设备步骤"下的工具栏中的增强移动实验室软件步骤，并将其拖动到方法。将实验室软件从P11移动到轨道 1。
- 单击"控制步骤"下工具栏中的"运行过程"步骤并将其拖动到方法。选择过程提示计数。
- 单击"设置与设备步骤"下的工具栏中的"设备操作"步骤，并将其拖动到方法。选择设备 OritalShaker0，命令时移。进入摇动速度1000，时间达到全速2，时间摇动30。
- 单击"设置与设备步骤"下的工具栏中的增强移动实验室软件步骤，并将其拖动到方法。将实验室软件轨道1移到P11。
- 设置第一个组合
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示"步骤并将其拖动到方法。选择重新排列位置 TL4。
- 单击"集成"下工具栏中的INHECO 孵化步骤并将其拖动到方法。键入INHECO1用于在位处使用设备，1用于孵化，60表示 °C，3 表示目标温度的 °C。 3
- 单击"控制步骤"下的工具栏中的"循环"步骤，并将其拖动到"选择提示"步骤中的方法。将col键入为变量=第一列为"开始"，将 [最后一列称为结束]，将 1键入为增量。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示加载提示"步骤，并将其拖动到方法（循环步骤中）。从下拉菜单中选择 BC90 提示、TL5 位置和 TL2 备份提示位置。选择单列，然后键入1。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示吸进"步骤，并将其拖动到循环步骤内的方法。选择 BCDeep96 圆形实验室软件类型和试剂板位置。键入卷_FirstMix，在列1和第1行上吸气。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示点胶"步骤，并将其拖动到循环步骤内的方法。选择 BCDeep96 圆形实验室软件类型和试剂板位置。键入卷#FirstMix，在列_col和行1点点。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示卸载步骤"，并将其拖动到方法（循环步骤中）。选择"卸载提示到 TR1"。
- 设置示例
- 单击"控制步骤"下工具栏中的"If"步骤并将其拖动到方法。键入样板作为条件。
- 在"然后"下，单击"液体处理步骤"下的工具栏中的"选择提示加载提示"步骤，并将其拖动到方法。从下拉菜单中选择 BC90 提示、TL5 位置和 TL2 备份提示位置。选择单列，然后键入_tip 列。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示吸气"步骤，然后将其拖动到方法中。选择 Greiner96RoundPS 实验室软件类型和样品位置。键入卷=示例，在列#第一列和行1上吸气。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示点胶"步骤，然后将其拖动到方法中。选择 BCDeep96 圆形实验室器皿类型和反应板位置。键入卷= 采样，在列+ 第一列和第1行点点分配。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示卸载步骤"，然后将其拖动到方法中。选择"卸载提示到 TR1"。
- 在"如果"步骤结束后，单击"控制步骤"下工具栏中的"运行过程"步骤并将其拖动到方法。选择过程孵化器。将"半时"键入变量名称，将 1800键入默认值。在NextTemp中键入变量名称，将 22键入默认值。将温度键入为变量名称，将 60键入默认值。
- 设置赛斯泰因块
- 单击"控制步骤"下的工具栏中的"循环"步骤，并将其拖动到"选择提示"步骤中的方法。将col键入为变量=第一列为"开始"，将 [最后一列键入结束]，将 1键入为增量。
- 在循环下，单击"液体处理步骤"下的工具栏中的"选择提示加载提示"步骤，并将其拖动到方法。从下拉菜单中选择 BC90 提示、TL5 位置和 TL2 备份提示位置。选择单列，然后键入1。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示吸进"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择 BCDeep96 圆形实验室软件类型和试剂板位置。键入卷_CysteineMix，在第2列和第1行上吸气。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示点胶"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择BCDeep96 圆形实验室器皿类型和反应板位置。键入体积= 赛半胱氨酸Mix，在列+ col和行1上分配。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示卸载步骤"，然后将其拖动到方法中。选择"卸载提示到 TR1"。
- 在"If循环"结束后，单击"控制步骤"下工具栏中的"运行过程"步骤并将其拖动到方法。选择过程孵化器。将"半时"键入变量名称，将 300键入默认值。在NextTemp中键入变量名称，将 43键入默认值。将温度键入为变量名称，将 25键入默认值。
- 设置第二个组合
- 单击"控制步骤"下的工具栏中的"循环"步骤，并将其拖动到"选择提示"步骤中的方法。将col键入为变量=第一列为"开始"，将 [最后一列键入结束]，将 1键入为增量。
- 在循环下，单击"液体处理步骤"下的工具栏中的"选择提示加载提示"步骤，并将其拖动到方法。从下拉菜单中选择 BC90 提示、TL5 位置和 TL2 备份提示位置。选择单列，然后键入1。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示吸进"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择 BCDeep96 圆形实验室软件类型和试剂板位置。键入卷=第二混合，在第3列和第1行上吸气。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示点胶"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择 BCDeep96 圆形实验室器皿类型和反应板位置。键入卷= 第二混合，在列+ col和行1处分配。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示卸载步骤"，然后将其拖动到方法中。选择"卸载提示到 TR1"。
- 在"如果"循环结束后，单击"控制步骤"下工具栏中的"运行过程"步骤并将其拖动到方法。选择轨道程序。
- 单击"设置与设备步骤"下的工具栏中的"暂停"步骤，并将其拖动到方法。将整个系统暂停1 s。
- 设置锥蛋白添加
- 单击"控制步骤"下的工具栏中的"循环"步骤，并将其拖动到"选择提示"步骤中的方法。将col键入为变量=第一列为"开始"，将 [最后一列键入结束]，将 1键入为增量。
- 在循环下，单击"液体处理步骤"下的工具栏中的"选择提示加载提示"步骤，并将其拖动到方法。从下拉菜单中选择 BC90 提示、TL5 位置和 TL2 备份提示位置。选择单列，然后键入1。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示吸进"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择 BCDeep96 圆形实验室软件类型和试剂板位置。键入卷=Trypsin，在第4列和第1行进行吸气。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示点胶"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择 BCDeep96 圆形实验室器皿类型和反应板位置。键入卷=Trypsin，在列+ col和行1处分配。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示卸载步骤"，然后将其拖动到方法中。选择"卸载提示到 TR1"。
- 在"If循环"结束后，单击"控制步骤"下工具栏中的"运行过程"步骤并将其拖动到方法。选择过程孵化器。将"半时"键入变量名称，将 3600键入默认值。在NextTemp中键入变量名称，将 25键入默认值。将温度键入为变量名称，将 43键入默认值。
- 单击"集成"下工具栏中的INHECO 孵化步骤并将其拖动到方法。确保安装了 INHECO 孵化器软件。键入INHECO1用于在位处使用设备，1用于孵化，25表示 °C，5 表示目标温度的 °C。 5
- 设置淬火
- 单击"控制步骤"下的工具栏中的"循环"步骤，并将其拖动到"选择提示"步骤中的方法。将col键入为变量=第一列为"开始"，将 [最后一列键入结束]，将 1键入为增量。
- 在循环下，单击"液体处理步骤"下的工具栏中的"选择提示加载提示"步骤，并将其拖动到方法。从下拉菜单中选择 BC90 提示、TL5 位置和 TL2 备份提示位置。选择单列，然后键入1。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示吸进"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择 BCDeep96 圆形实验室软件类型和试剂板位置。键入卷=Quench，在第5列和第1行处吸气。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示点胶"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择BCDeep96 圆形实验室器皿类型和反应板位置。键入卷=Quench，在列+ col和行1处分配。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示卸载步骤"，并将其拖动到"然后"内的方法。选择"卸载提示到 TR1"。
- 在"如果"循环结束后，单击"控制步骤"下工具栏中的"运行过程"步骤并将其拖动到方法。选择轨道程序。
- 单击"设置与设备步骤"下的工具栏中的"暂停"步骤，并将其拖动到方法。暂停整个系统 1 s。
- 单击"设置与设备步骤"下的工具栏中的"暂停"步骤，并将其拖动到方法。选择"暂停整个系统并显示此消息"。键入消息"离心后继续"。
- 设置自动采样器的板
- 单击"控制步骤"下的工具栏中的"If"步骤，并将其拖动到"选择提示"步骤中的方法。将自动采样器键入为条件。
- 在"然后"下，单击"控制步骤"下工具栏中的循环步骤并将其拖动到方法。将col键入为变量=第一列为"开始"，将 [最后一列键入结束]，将 1键入为增量。
- 在循环下，单击"液体处理步骤"下的工具栏中的"选择提示加载提示"步骤，并将其拖动到方法。从下拉菜单中选择 BC230 提示、TL6 位置和 TL2 备份提示位置。选择单列，然后键入1。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示吸进"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择BCDeep96 圆形实验室软件类型和试剂板位置。键入卷=移动阶段，在第6列和第1行进行吸气。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示点胶"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择Bio_RadPCR96实验室器类型和自动采样板位置。键入卷[移动相， 在列+ col和行1上分配.从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示卸载步骤"，并将其拖动到"然后"内的方法。选择"卸载提示到 TR1"。
- 在"If循环"结束后，单击"控制步骤"下工具栏中的"运行过程"步骤并将其拖动到方法。选择过程提示计数。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示加载提示"步骤，并将其拖动到方法。从下拉菜单中选择 BC90 提示、TL5 位置和 TL2 备份提示位置。选择单列，然后键入_tip 列。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示吸气"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择BCDeep96 圆形实验室器皿类型和反应板位置。键入卷=摘要传输，在列#第一列和行1上吸气。从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示点胶"步骤，并将其拖动到循环中的方法。选择Bio_RadPCR96实验室器类型和自动采样板位置。键入卷=移动阶段，在列[第一列和行1中分配]从技术下拉菜单中选择优化的技术。
- 单击"液体处理步骤"下工具栏中的"选择提示卸载步骤"，并将其拖动到"然后"中的方法。选择"卸载提示到 TR1"。选择提示步骤在此处结束。
- 保存并命名方法。
2. 制备试样、实验室用具和试剂
- 将5 μL的池健康人类血浆转移到聚丙烯，96圆形深井板。
注： 有关该协议中使用的试剂和耗材，请参阅材料表。购买TPCK处理胰蛋白酶，并特别优化胰蛋白酶基基比和孵育时间。如果使用不同等级的胰蛋白酶，如序列级重组胰蛋白酶，应测试和优化酶与基质比和孵育时间。
3. 操作程序
- 双击软件图标。
- 在"方法"选项卡下，选择"所有轴"以定向和准备自动液体处理程序。确保所有工作站注射器均无可见气泡。
- 在"文件"下，选择"打开" |方法。
- 选择方法（图6）。
- 单击绿色三角形形状的"运行"图标启动方法。
- 要在方法末尾准备好自动采样板，请在"输入值"用于"自动采样器"提示的值中输入值"true"，然后单击"确定"。如果未准备自动采样板，请输入值"false"，然后单击"确定"。
- 输入要用于"第一列"提示的值"1"，然后单击"确定"。
- 输入"输入"最后列"提示的值中的值"12"，然后单击"确定"。
注：此步骤和步骤 4.7 告诉工作站对 96 孔板的 12 列进行消化，导致板的所有孔用于消化 - 如果样品板的样品体积至少为 20 μL，请在"输入"值中输入值"true"以用于"样本板"提示，然后单击"确定"。如果未使用样本板，请输入值"false"，然后单击"确定"。
注：如果未使用样品板，则向反应板的每个对应孔中添加 5 μL 的样品。 - 按照引导式实验室软件设置窗口中的说明，然后单击"继续"。
注： 下一个窗口描述要准备的"试剂板"的布局（图7，补充表 1）。以下卷将分出到 1 mL 深圆 96 孔板中单个柱的 8 个孔中的每个孔中：
第 1 列：反应混合物 1 的 540 μL。
第 2 列：西赛氨酸块的 50 μL。
第 3 列：反应混合物 2 的 730 μL。
第 4 列：130 μL 的胰蛋白酶。
第 5 列：130 μL 的淬奇溶液。
第 5 列：移动相解决方案的 1090 μL（如果用户在步骤 6 中输入了"true"）。 - 单击"下一步"，下面的窗口描述要在样品板中输入所需的最小体积 （20 μL）。如果用户输入了涉及样品板的提示值"false"（步骤 9），系统将提示用户向反应板添加 5 μL 样品。
- 单击"下一步"。
注： 下一个窗口显示，必须在自动液体处理台上放置一个空的 90 μL 尖端盒。 - 再次单击"下一步"，按指定和说明布局自动液体处理机的甲板（图 8），包括试剂板、反应板、样品板、自动采样板、6 个完整 90 μL 提示盒、一个空的 90 μL 提示盒和一个完整的 230 μL 提示盒。
- 单击"完成"以开始该方法。
注： 单击"完成"后，用户无法进入自动液体处理程序。这将"打破机器的光幕"，并停止液体处理器作为安全预防措施。 - 在离心提示后继续，取回反应板，并在 3，000 rpm 下将其离心 30 分钟。
- 离心完成后，将反应板返回到自动液体处理程序到离心之前的位置，然后单击"继续"。
注： 自动液体处理程序将在方法完成后再次停止。如果用户为步骤 6 输入"true"，则可以从工作站中取出自动采样板，并放入液体色谱仪器的自动采样器中进行分析。
4. LC-MSMS
- 在由 C18 2.1 mm x 100 mm、3.5 μm 柱组成的高流量 HPLC 上解析肽，流速为 0.25 mL/min，并在三倍极质谱仪上内联分析。
注：肽消化后，在LC-MSMSMS的简要描述后，详细介绍了从机器人制备样品中量化肽的有针对性的LC-MSMS方法。 - 将柱式烤箱温度设置为 40°C。使用缓冲液A（2%ACN，98%水，0.1%的酸）和缓冲B（95%ACN，5%水，0.1%的酸）作为两个移动阶段。
- 加载后 5 分钟，将列与 5% B 进行平衡。将肽在30分钟内与缓冲B的线性5%至35%梯度进行刺激。
- 在加载下一个样品之前回收列，用 98% B 清洗 10 分钟，然后 5% B 清洗 5 分钟。
- 对于在线分流，在柱后阀进入两相开关阀进入气管源之前，将柱后脱泄物转移到废物中。
- 处理 MRM 数据。
Representative Results
自动化工作站上的自动蛋白质组学样品制备工作流程根据我们以前的自动化协议进行了调整，采用用于白蛋白、所选血浆蛋白和β-加拉托西酶（β-gal）的强大的LC-SRM-MS采集方法1，这是一种用于质量控制的外源蛋白。经过处理，样品在三四极极极的LC-MS上运行，在SRM测定中针对血清白蛋白，β-加拉托西拉酶。SRM信号的变异系数（CV）用于监测自动消化协议的可重复性。
我们自动化试剂添加和混合步骤，消化5μL血浆样品，进行2小时的甲板孵化器胰蛋白酶孵育。为了确定可重复性，等离子池的5μL被移入具有多通道头（96 针）的反应板的多个孔中。为了监测一致性，我们在减少和烷基反应之前添加了β-gal蛋白。自动蛋白质组学样品制备工作流程采用可靠的LC-SRM-MS采集方法进行测试，包括白蛋白、最高丰度血浆蛋白和用于质量控制的β-gal蛋白。从加工过的血浆白蛋白和尖刺β-gal蛋白中监测三个β-gal肽和两个白蛋白肽（表4）。
为了节省时间和简化程序，我们减少了液体转移步骤，添加/混合/孵育试剂和反应混合物与工作站从九步工作流程到六步工作流程（图1）。总蛋白酶体工作流程由两个实验部分组成：自动样品制备和LC-MS/MS。首先，通过自动采样板同一消化孔连续八次注射，对LC-MS/MS SRM数据采集精度进行了评价。自动样品制备工作流程的精度是根据总蛋白酶SRM工作流减去LC-MS/MS的%CV的方差系数（%CV）的百分比计算的（图9B）。在自动化工作站上简化血浆消化程序后，外源性尖峰β-gal蛋白的自动样品制备实验精度小于11.4%（平均为10.0%），最丰富的人类血清白蛋白（平均9.9%）的实验性精度低于14.9%（图9）。如预期的那样，人类血清白蛋白和β-gal蛋白均观察到良好的信号强度（图9C）。
对于每个移液和液体转移步骤，技术都进行了特别优化。为了监测液体转移步骤的精度，我们在三个独立的试剂转移步骤中为内源性人类血清白蛋白蛋白和外源β-gal蛋白（反应混合物1、赛氨酸阻滞剂和反应混合2（图10）稳定同位素标记（SIL）肽标准。从这五个SIL肽的MRM信号被获取，以监测自动液体转移步骤的精度。反应混合物 1 步的平均 %CV 为肽、DDNPNLPR®和 GDFQFNISR* （* 表示 N15 标记氨基酸）从反应混合 1 步不等，范围从 1.8% 到 11.2%。Cysteine阻滞剂步进中一个肽（IDPNAWVER®）的平均%CV介于 6.6% 到 8.8% 之间。两种肽（WVGYGQDSR+和LVNEVTEFAK+）的平均%CV在6.2%到11.9%（图10）。
为了验证自动蛋白质组学样品制备工作流程，我们评估了多种蛋白质的可重复性，并评估了人类血清白蛋白、外源β+gal和40个附加血浆蛋白的多天可重复性。我们处理了21个复制样品（集合正常人类血浆），如图11A所示，在三个不同的日期。日内简历是根据当天准备的21口井计算的。40种蛋白质的平均日内%CV在4%-20%（图11B）的内数中。为了评估基于板的自动工作流的边缘效果，%CV 是根据指定列和行中的特定孔计算的（列和行映射的图 12A）。MRM 信号强度在所有列和行配置中相似，%CV 的范围从 3% - 22%（图 12B）。
总之，优化的自动化工作流程在不到5小时内生成96个统一处理样品，具有出色的实验精度。为了与自动化工作流程兼容，我们选择的试剂具有可忽略不计的非特异性副作用、在环境光下稳定、对LC-MS/MS友好且可存储为冷冻等号。
图 1：示例准备工作流的架构。列出了主要的6个液体转移步骤。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2：提示加载脚本。此处显示了 VB 脚本详细信息。脚本指定提示加载条件。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：自动工作站甲板布局。甲板由1x1 ALPs，提示加载ALPs，垃圾，尖端洗涤，Peltier和孵化器。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：试剂板的特性。显示的是使用引导式实验室软件安装程序访问试剂板实验室软件所需的属性。选择相应的列，并在变量中键入如图所示。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 5：提示计数脚本。此脚本有助于跟踪甲板上的提示数。请点击此处查看此图形的较大版本。
图6：消化和等值等离子样品的方法概述。液体处理程序方法中试剂计算、实验室软件设置和液体操作的步骤。请点击此处查看此图形的较大版本。
图7：试剂板的布局。所示是血浆消化和自动取样器制备所需的化学试剂，并分布在试剂板实验室器皿中。这个数字是从技术说明10修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 8：自动工作站甲板上实验室软件的布局。所示为液体处理机的等离子体消化方法的甲板布局。这个数字是从技术说明10修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 9：总蛋白酶组工作流程的精度由工作站 CV 和目标 LC MS/MS CV 组成。
监测了β-gal和白蛋白的5种肽，计算了每个肽的色谱图和肽保留时间（A），从30个井/样品加工代表性实验中测定了精确度，计算了总蛋白细胞工作流程的CV%，LC MS/MS分析和自动样品处理（B）。总体而言，消化的肽显示良好的信号范围从1x105到1x108。请点击此处查看此图形的较大版本。
图10：液体转移步骤的精度测定。合成肽在步进特定试剂中出现，自动液体转移由总%CV确定。从 30 井/样品实验负% CV LC MSMS（由 8 次重复 LC MSMS 注射确定）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图11：通过42种蛋白质MRM分析，自动蛋白酶样品制备工作流程多日可重现性。（A） 三天反应板图显示，21口井中每口加5μL等离子体。收到5口水的3口井被用作负/空控制。（B） 190次过渡的平均强度包括75个肽和42个蛋白质（左）和%CV，每个MRM转换是从每天21口消化的井（右）计算出的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图12：井特定位置的可重复性（列和行的位置）。（A） 列和行位置与板映射显示在此处。（B） 柱和行位置特定的 MRM 信号，来自指定孔的平均强度（左）和 cv%（右）来自单个板消化。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 13：技术编辑器的屏幕截图。对于每个移液模板，定义液位感应、Clot 检测、穿孔、液体类型、一般、吸气、分配、混合和校准的特性。该协议中使用的模板和技术显示在补充表 2中。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 变量 | 变量 | 价值 | 描述 |
| 自动采样器 | 布尔 | 真 | 使用自动采样器 |
| 贝塔加尔 | 整数 | 5 | 贝塔加尔体积 |
| BG1 | 整数 | 0.8 | BG1 卷 |
| BG2 | 整数 | 0.8 | BG2 卷 |
| BG3 | 整数 | 0.8 | BG3 卷 |
| 西斯坦布洛克 | 整数 | 1.25 | 赛赛纳阻滞器体积 |
| 赛赛施泰纳缓冲区 | 整数 | 0.45 | 赛半胱氨酸缓冲体积 |
| 变性 | 整数 | 5 | 变性体积 |
| 摘要转移 | 整数 | 10 | 摘要转移量 |
| 第一个缓冲区 | 整数 | 25.9 | 第一个缓冲区卷 |
| 第一列 | 整数 | 1 | 第一列 |
| HSA1 | 整数 | 0.8 | HSA1 卷 |
| HSA2 | 整数 | 0.8 | HSA2 卷 |
| 最后一列 | 整数 | 12 | 最后一列 |
| 移动阶段 | 整数 | 90 | 移动相卷 |
| 淬火 | 整数 | 10 | 昆奇列 |
| 减少代理 | 整数 | 5 | 减少代理列 |
| 样品 | 整数 | 5 | 示例列 |
| 样品板 | 布尔 | 真 | 使用样品板 |
| 第二个缓冲区 | 整数 | 58.4 | 第二个缓冲区卷 |
| 胰蛋白酶 | 整数 | 10 | 胰蛋白柱 |
表 1：开始步骤变量
| 价值 | 变量 |
| [第一缓冲区]减少代理_Betagal_BG1_HSA1 | 第一混音 |
| [西施泰纳拦截器]西施泰纳缓冲区_BG2 | 赛赛施泰因米克 |
| [第二缓冲区]BG3_HSA2 | 第二混音 |
| [（第一混音+列）*30 | 第一MixWell |
| [ （赛斯泰因Mix+列）*20 | 西施泰因韦尔 |
| [（第二混音+列）=10 | 第二MixWell |
| *（尝试-列）=10 | 特里普辛韦尔 |
| *（昆奇+列）*10 | 昆奇韦尔 |
| *（第一混合井*8）~100 | 第一MixStock |
| [西施泰因韦尔]8×20 | 赛赛斯泰米克斯 |
| *（第二混合井*8）~100 | 第二MixStock |
表 2：体积混合变量
| 类型 | 名字 | 位置 | 深度 | 性能 | 使用？ |
| BCDeep96 圆 | 试剂板 | P5 | 1（顶部） | # | *不是样品板 |
| BCDeep96 圆 | 试剂板 | P5 | 1（顶部） | # | *样品板 |
| BCDeep96 圆 | 反应板 | P11 | 1（顶部） | 真 | |
| Bio_RadPCR96* | 样品 | P9 | 1（顶部） | *样品板 | |
| Bio_RadPCR96* | 自动采样板 | P10 | 1（顶部） | *自动采样器 | |
| BC90 | 空 | 1（顶部） | 真 | ||
| BC90 | 1（顶部） | 真 | |||
| BC90 | 1（顶部） | 真 | |||
| BC230 | 1（顶部） | *自动采样器 | |||
| BC90 | 1（顶部） | *列>1 | |||
| BC90 | 1（顶部） | [列>3 | |||
| BC90 | 1（顶部） | *列>5 | |||
| BC90 | 1（顶部） | *列>7 | |||
| BC90 | 1（顶部） | *列>9 | |||
| 注意： *： 对应于 96 井 Bio-Rad 板。 *： 单击属性，然后输入如图 6 所示的卷变量。 |
|||||
表 3：设置引导式设置
| 蛋白质 ID | 肽序列 | 第 1 季度质量（Da） | Q3 质量（Da） | 时间（分钟） | 碎片 Ion | 去聚类潜力 | 碰撞能量 | 碰撞单元退出电位 |
| sp_P00722*BGAL_ELOCI | GDFQFNISR | 542.3 | 262.1 | 19.7 | +2y2 | 61 | 21 | 8 |
| 542.3 | 636 | 19.7 | +2y5 | 61 | 25 | 12 | ||
| 542.3 | 764.2 | 19.7 | +2y6 | 61 | 25 | 18 | ||
| IDPNAWVER | 550.3 | 436.1 | 18.1 | +2y7+2 | 61 | 23 | 8 | |
| 550.3 | 871.2 | 18.1 | +2y7 | 61 | 25 | 18 | ||
| 550.3 | 774.2 | 18.1 | +2y6 | 61 | 33 | 8 | ||
| WVGYGQDSR | 534.3 | 782.1 | 12.1 | +2y7 | 51 | 25 | 6 | |
| 534.3 | 562.1 | 12.1 | +2y5 | 51 | 27 | 6 | ||
| 534.2 | 505.2 | 12.1 | +2y4 | 90 | 25 | 8 | ||
| sp_P02768*ALBU_HUMAN | DDNPNLPR | 470.8 | 596.2 | 9.2 | +2y5 | 61 | 27 | 16 |
| 470.8 | 499.3 | 9.2 | +2y4 | 61 | 27 | 18 | ||
| 470.8 | 710.4 | 9.2 | +2y6 | 61 | 27 | 18 | ||
| 吕内夫特法克 | 575.3 | 694.4 | 18.2 | +2y6 | 73.1 | 29.6 | 18 | |
| 575.3 | 937.5 | 18.2 | +2y8 | 73.1 | 29.6 | 18 | ||
| 575.3 | 823.4 | 18.2 | +2y7 | 73.1 | 29.6 | 18 |
表 4：MRM 参数
补充表 1：试剂板请点击这里下载此表。
补充表 2：协议模板请点击此处下载此表。
Discussion
质谱的样品处理需要蛋白质变性、减少和烷基化来阻断半胱氨酸，并尝试蛋白消化，将蛋白质切成肽。每个化学或酶反应都需要在指定时间启动，并在受控温度下进行，过程的每一步都涉及多个液体转移步骤，其中可以引入实验变异。自动样品处理为这一困境提供了解决方案。目前可用的液体处理系统能够将试剂转移到96孔板中，精度和精度低于5%，具体取决于所使用的头部和尖端类型，并在14°C至70°C的受控温度下孵育样品，如果需要，可进行摇动。我们使用自动液体处理程序处理 96 井格式的 SRM 检测等离子体。
在血清、血浆和其他生物样本中蛋白质的复杂混合物中，有数千个蛋白酶裂解位点;这些蛋白质中的每一种都有独特的特性，影响裂解部位的可访问性和由此产生的肽的稳定性。因此，不可能设计适合每种蛋白质的样品处理程序。最好的选择是尽可能保持一致。
为了实现一致性，我们优化了自动液体处理机执行的每个移液步骤。我们首先考虑了液体类型（等离子体、水或有机）和相应的特性（粘度、粘合度和波动性）、硬件（工作站移液头和板抓臂）和实验室软件所施加的体积和约束。然后，我们改变速度和尾随空气间隙的吸入，速度和井喷体积的点胶，以及力和混合持续时间，同时结合提示触摸后，吸入和/或分配，如果需要，以消除液体粘附在尖端外部（图13，补充表1）。一个独特的SIL肽，预先筛选的稳定性，被刺到每个试剂，以便能够监测每个液体处理步骤的精度。优化后，大多数转换的过程 CV 小于 10%，显示自动工作站具有良好的重现性（图 9、图 10、图 11和图 12）。
此处介绍的自动化工作流提供了一致的酶消化，与手动方法相比，提高了可重复性和吞吐量（图 9，图 10）。这种方法有望通过质谱法提高生物标志物发现和验证的准确性和可靠性。
Disclosures
没有。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A Pooled healthy human plasma | Bioreclamation Inc. | human plasma tested in the manuscript | |
| Acetonitrile, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | A998SK1 | LC MS/MS solvent |
| B-Galactosidase Recombinant from E.Coli | Sigma-Aldrich | G3153-5MG | exogenous control proteins. |
| Biomek i7 Automated Workstation | Beckman Coulter, Inc. | The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions | |
| Biomek i-Series Tips 230µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85903 | Tips, i7 consumable |
| Biomek i-Series Tips 90µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85881 | Tips, i7 consumable |
| FG, Kit Trypsin TPCK | Sciex | 4445250 | Trypsin used in digestion |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | #hsp9641 | Autosampler plate |
| Octyl B-D-Glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O9882-5G | detergent used in digestion |
| Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile | Beckman Coulter, Inc. | 267007 | Reagent and digestion plate |
| Prominence UFLCXR HPLC system | Shimadzu, Japan | High flow LC sytem | |
| QTRAP 6500 | SCIEX | Mass spectrometer | |
| Water, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | W54 | LC MS/MS solvent |
| Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm | Waters | 186003564 | LC MSMS column |
References
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