Summary
Her presenterer vi en automatisert plasmaproteinfordøyelsesmetode for massespektrometribasert kvantitativ proteomisk analyse. I denne protokollen er væskeoverførings- og inkubasjonstrinnene for proteindenaturering, reduksjon, alkylering og trypsinfordøyelsesreaksjoner strømlinjeformet og automatisert. Det tar omtrent fem timer å lage en 96-brønnplate med ønsket presisjon.
Abstract
Prøveforberedelse for massespektrometrianalyse i proteomikk krever enzymatisk spalting av proteiner i en peptidblanding. Denne prosessen innebærer mange inkubasjons- og væskeoverføringstrinn for å oppnå avnaturering, reduksjon, alkylering og spalting. Tilpasning av denne arbeidsflyten til en automatisert arbeidsstasjon kan øke effektiviteten og redusere kombitrene i varians, og dermed gi mer pålitelige data for statistiske sammenligninger mellom utvalgstyper. Vi har tidligere beskrevet en automatisert proteomisk prøveforberedelsearbeidsflyt1. Her rapporterer vi utviklingen av en mer effektiv og bedre kontrollert arbeidsflyt med følgende fordeler: 1) Antall væskeoverføringstrinn reduseres fra ni til seks ved å kombinere reagenser; 2) Pipetteringstiden reduseres ved selektiv tupppipettering ved hjelp av et 96-posisjons pipetteringshode med flere kanaler; 3) Potensiell gjennomstrømning økes med tilgjengeligheten av opptil 45 dekksposisjoner; 4) Fullstendig kabinett av systemet gir forbedret temperatur og miljøkontroll og reduserer potensialet for forurensning av prøver eller reagenser; og 5) Tilsetning av stabile isotop merkede peptider, samt β-galaktosidase protein, til hver prøve gjør overvåking og kvalitetskontroll mulig gjennom hele prosessen. Disse maskinvare- og prosessforbedringene gir god reproduserbarhet og forbedrer intraanalyse- og interanalysepresisjon (CV på mindre enn 20 %) for LC-MS-basert protein- og peptidkvantifisering. Hele arbeidsflyten for å fordøye 96 prøver i en 96-brønnplate kan fullføres på ca. 5 timer.
Introduction
Massespektrometri (MS) -basert protein og peptid kvantifisering blir i økende grad brukt som et bioanalytisk verktøy for plasmaanalyse i grunnleggende forskning og kliniske laboratorier2,3. Den nødvendige instrumentering og informatikk har avansert raskt som MS har blitt metoden for valg for kvantifisere proteiner eller modifiserte proteiner ved å målrette spesifikke peptid sekvenser på grunn av sin evne til å kvantifisere hundrevis av peptider i en enkelt MS kjøre4. Prøveforberedelse fungerer som grunnlag for enhver proteomisk analyse. Før MS-analyse blir proteinene i en biologisk prøve vanligvis denaturert, redusert, alkylated, fordøyd til tryptiske peptider og desaltet5. Alkylation blokkerer cysteines for å hindre ukontrollerte modifikasjoner og sikre at alle cysteiner har samme masse. Deretter blir trypsin lagt til for å fordøye proteiner i peptider. Hver av disse trinnene krever optimalisering, og hele prosessen utføres tradisjonelt manuelt, noe som åpner for innføring av analytiske feil.
Den tradisjonelle biomarker utviklingsrørledningen består av to hovedprosesser: hagle proteomics for global protein oppdagelse for å skape en grundig protein inventar6 og målrettet proteomics for verifisering og validering rettet mot høy presisjon og høy gjennomstrømning protein kvantitet7. Uavhengig av MS-tilnærmingen er prøveforberedelse det samme og sentrerer seg om enzymatisk spalting av proteiner i en peptidblanding. Som foreslått av Van Eyk og Sobhani8, er det ønsket å effektivt flytte oppdagelsesbiomarkører til klinisk implementerte analyser. For å gjøre dette vil automatisering av prøveforberedelse være nyttig og gi muligheten til å øke effektiviteten til analyse med høy gjennomstrømning. Manuelle metoder introduserer vanligvis analytiske feil utover akseptable grenser spesifisert av Food and Drug Administration (FDA) i den reviderte Bioanalytical Method Validation Guidance, som inkluderer biomarkører og diagnostikk2,9. Utviklingen av en rask, svært nøyaktig og håndfri MS protein prøve forberedelse arbeidsflyt vil være nødvendig for å lette biomarker forskning, som krever utarbeidelse og analyse av tusenvis av biologiske prøver. MS prøveforberedelse har mange trinn der feil kan innføres, og prosessen er kjedelig og tidkrevende.
I vår forbedrede metode ble en automatisert arbeidsstasjon programmert til å utføre alle nødvendige plasmaprøveforberedelsesprosedyrer i totalt 6 trinn (figur 1) for å sikre: 1) nøyaktigvæskeoverføringer; 2) reaksjonen er initiert og stoppet på en konsekvent tid; 3) reaksjonen utføres ved en kontrollert temperatur (dvs. inkubator); og 4) reaksjonen har ensartet blanding for alle reaksjoner. Vi implementerte også å legge til eksogene kvalitetskontrollproteiner og interne standarder (stabile isotop-merkede peptidstandarder) for å sikre en kvalitet og reproduserbar gjennomstrømming av LC-MS-basert protein- og peptidkvantifisering i et 96-brønnformat. Inkludert reagensforberedelse, arbeidstid og totalt 1 000 000 pipetteringstrinn vil være nødvendig for å behandle 96 prøver i individuelle rør. Automatisering reduserer praktisk tid og antall menneskelige interaksjoner involvert.
Protocol
1. Programmering for automatisert væskebehandling
- Opprett en ny metode fra Fil-menyen (Fil | Ny metode)
MERK: Fullfør trinnene i den angitte rekkefølgen. Den kursike skriften betegner tekst som skal skrives inn i Biomek-programvaren. Ta kontakt med forfatterne for informasjon om pipetteringsteknikker og maler. - Skriv inn Start trinnvariabler og verdiene i starttrinnet som er oppført i tabell 1.
- Angi kolonner for selektiv tupppiptting. For trinnene 1.3-1.7 klikker du på Angi globalt trinn på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar det til metoden.
- Ved hjelp av set global trinn, angi verdi = FirstColumn til variabel FirstColumn_Global, verdi = LastColumn til variabel LastColumn_Global, verdi = LastColumn-FirstColumn + 1 til variabel kolonner, og verdi = Kolonner * 8 til variabel Brønner.
- Velg skripttrinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Skriv inn VB-skriptet som angitt i figur 2.
- Innstilling av volumer for mikser Set Global og løsninger.
- Bruk trinnet Angi globalt til å angi de tilsvarende verdiene til volumblandingsvariablene som vist i tabell 2.
- Klikk Hvis-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Under betingelser skriver du inn Autosampler.
- Under Deretterklikker du angi globalt trinn på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden.
- Ved hjelp av angi globalt trinn, angi verdi =(MobilePhase * Kolonner)+10 til variabel MobilePhaseWell.
- Klikk Angi globalt trinn på verktøylinjen under Kontrolltrinn under Else,og dra det til metoden.
- Ved hjelp av set global trinn, angi verdi = 0 til variabel MobilePhaseWell
- Konfigurere guidet labware oppsett (GLS)
- Klikk på Deck Editor-trinnet på verktøylinjen under Verktøy. Lag et nytt deck for å korrespondere med dekkoppsettet i figur 3 og merk det som dekk 1.
- Klikk trinnet Veiledet oppsett på verktøylinjen under Oppsett og enheter, og dra det til metoden. Dra og slipp labware-typene i dekksposisjonene som angitt i tabell 3. Deretter fyller du fanene i tabellen som vist i tabell 3 og figur 4 (Konfigurere det veiledede oppsettet).
- Definere prosedyre for tipstelling
- Klikk trinnet Definer prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra den til metoden. Navneprosedyre som TipCount.
- Klikk skripttrinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Skriv inn VB-skriptet som angitt i figur 5 (skript for tipstelling).
- Klikk Hvis-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden.
- Under betingelser skriver du inn TL5 = 0.
- Under Deretterklikker du på Flytt Labware-trinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og drar det til metoden. Flytt labware fra TL5 til TR3. Klikk trinnet Flytt Labware på verktøylinjen under Trinn for oppsett og enhet, og dra det til metoden. Flytt labware fra TL2 til TL5. Til slutt klikker du på Flytt Labware-trinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn og drar det til metoden. Flytt labware fra BC90 til TL2.
- Definere prosedyre for inkubator
- Klikk trinnet Definer prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra den til metoden. Navnprosedyre som inkubator.
- Skriv inn HalfTime som variabelnavn og 1800 som standardverdi.
- Skriv inn NextTemp som variabelnavn og 22 som standardverdi.
- Skriv inn temp som variabelnavn og 60 som standardverdi.
- Klikk trinnet Forbedret Move Labware på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Flytt labware fra P11 til INHECO1.
- Klikk trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra den til metoden. Navneprosedyre som TipCount.
- Klikk inheco inkubat-trinnet på verktøylinjen under Integrasjoner, og dra det til metoden. Skriv inn INHECO1 for bruk enheten i posisjon, =HalfTime for Incubate for, =Temp for °C og 3 for °C med måltemperatur. Velg alternativet Rist under inkubering og Orbital (med klokken)rist stil. For innstillinger skriver du inn 1,00 mm fra side til side, 6,6 ganger i sekundet, 1,00 mm fremover annonsen bakover og 6,6 ganger i sekundet.
MERK: Kontroller at INHECO Inkubatorprogramvaren er installert. - Klikk inheco inkubat-trinnet på verktøylinjen under Integrasjoner, og dra det til metoden. Skriv inn INHECO1 for bruk enheten i posisjon, =HalfTime for Incubate for, =Temp for °C og 3 for °C med måltemperatur. Velg alternativet Rist under inkubering og Orbital (Mot klokken)rist stil. For innstillinger skriver du inn 1,00 mm fra side til side, 6,6 ganger i sekundet, 1,00 mm forover og bakover med 6,6 ganger i sekundet.
- Klikk pausetrinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Sett hele systemet på pause i 1 s.
- Klikk trinnet Definer prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra den til metoden. Navnprosedyre som inkubator.
- Klikk inheco inkubat-trinnet på verktøylinjen under Integrasjoner, og dra det til metoden. Skriv inn INHECO1 for bruk apparatet i posisjon, 1 for inkubat for, =NextTemp for °C og 3 for °C med måltemperatur.
- Definere prosedyre for Orbital.
- Klikk trinnet Forbedret Move Labware på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Flytt labware fra P11 til Orbital1.
- Klikk trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra den til metoden. Velg prosedyre TipCount.
- Klikk på enhetshandling-trinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Velg Device OritalShaker0, Command TimedShake. Angi Risting hastighet 1000, Tid for å nå full hastighet 2, Tid for å riste 30.
- Klikk trinnet Forbedret Move Labware på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Flytt labware Orbital1 til P11.
- Sette opp den første blandingen
- Klikk velg tips trinn på verktøylinjen under Flytende håndtering trinn og dra den til metoden. Velg omorganisere posisjon TL4.
- Klikk inheco inkubat-trinnet på verktøylinjen under Integrasjoner, og dra det til metoden. Skriv inn INHECO1 for bruk apparatet i posisjon, 1 for inkubat for, 60 for °C og 3 for °C med måltemperatur.
- Klikk Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i Velg tipstrinn. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som slutt og 1 som økning.
- Klikk trinnet Velg tips innlastingstips på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkketrinn. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1.
- Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkketrinn. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =FirstMix, Aspirer i kolonne 1 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkketrinn. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =FirstMix, dispenser på kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkketrinn. Velg Utlastingstips til TR1.
- Sette opp prøvene
- Klikk Hvis-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Skriv inn SamplePlate som betingelse.
- Under Deretterklikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn, og dra den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn =tipcolumns.
- Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg Greiner96RoundPS Labware Type and Samples Position. Skriv inn volum =Eksempel, Aspirer på kolonne = FirstColumn og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplateposisjon. Skriv inn volum =Eksempel, dispenser på kolonne = FirstColumn og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg Utlastingstips til TR1.
- Når du er på slutten av Hvis-trinnet, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. If Velg inkubator for prosedyre. Skriv inn HalfTime som variabelnavn og 1800 som standardverdi. Skriv inn NextTemp som variabelnavn og 22 som standardverdi. Skriv inn temp som variabelnavn og 60 som standardverdi.
- Sette opp Cysteine-blokken
- Klikk Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i Velg tipstrinn. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som Slutt og 1 som økning.
- Under Løkkeklikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn, og dra den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1.
- Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =CysteineMix, aspirer i kolonne 2 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplate posisjon. Type i volum = CysteineMix, dispensere i kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg Utlastingstips til TR1.
- Når du er på slutten av Hvis-løkken, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. Velg inkubator for prosedyre. Skriv inn HalfTime som variabelnavn og 300 som standardverdi. Skriv inn NextTemp som variabelnavn og 43 som standardverdi. Skriv inn temp som variabelnavn og 25 som standardverdi.
- Sette opp den andre blandingen
- Klikk Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i Velg tipstrinn. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som Slutt og 1 som økning.
- Under løkke klikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn og drar den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1.
- Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =SecondMix, Aspirer i kolonne 3 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplateposisjon. Skriv inn volum = SecondMix, Dispenser ved kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg Utlastingstips til TR1.
- Når du er på slutten av Hvis løkken, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. Velg prosedyre Orbital.
- Klikk pausetrinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Sett hele systemet på pause i 1 s.
- Sette opp Trypsin-tillegg
- Klikk Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i Velg tipstrinn. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som Slutt og 1 som økning.
- Under Løkkeklikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn, og dra den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1.
- Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =Trypsin, Aspirer i kolonne 4 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplateposisjon. Skriv inn volum =Trypsin, Dispenser på kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg Utlastingstips til TR1.
- Når du er på slutten av Hvis-løkken, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. Velg inkubator for prosedyre. Skriv inn HalfTime som variabelnavn og 3600 som standardverdi. Skriv inn NextTemp som variabelnavn og 25 som standardverdi. Skriv inn temp som variabelnavn og 43 som standardverdi.
- Klikk inheco inkubat-trinnet på verktøylinjen under Integrasjoner, og dra det til metoden. Kontroller at INHECO Inkubatorprogramvaren er installert. Skriv inn INHECO1 for bruk apparatet i posisjon, 1 for inkubat for, 25 for °C og 5 for °C med måltemperatur.
- Sette opp slukking
- Klikk Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i Velg tipstrinn. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som Slutt og 1 som økning.
- Under Løkkeklikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn, og dra den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1.
- Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum = Slukk, Aspirer i kolonne 5 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplate posisjon. Skriv inn volum =Slukk, Dispenser ved kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i Deretter. Velg Utlastingstips til TR1.
- Når du er på slutten av Hvis løkken, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. Velg prosedyre Orbital.
- Klikk pausetrinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Sett hele systemet på pause i 1 s.
- Klikk pausetrinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Velg Sett hele systemet på pause, og vis denne meldingen. Skriv inn meldingen "Fortsett etter sentrifugering".
- Sette opp platen for Autosampler
- Klikk Hvis-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i velg tips-trinnet. Select Tip Skriv autosampler som betingelse.
- Klikk Then deretter Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som Slutt og 1 som økning.
- Under Løkkeklikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn, og dra den til metoden. Velg BC230 Tips, TL6 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1.
- Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =MobilePhase, Aspirer i kolonne 6 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg Bio_RadPCR96 Labware Type og Autosampler Plate Position. Skriv inn volum =MobilePhase, Dispenser ved kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i Deretter. Velg Utlastingstips til TR1.
- Når du er på slutten av Hvis-løkken, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. Velg prosedyre TipCount.
- Klikk trinnet Velg tips innlastingstips på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn =tipcolumns.
- Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplate posisjon. Skriv inn volum =DigestTransfer, Aspirer på kolonne = førstekolonne og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg Bio_RadPCR96 Labware Type og Autosampler Plate Position. Skriv inn volum =MobilePhase, Dispense på kolonne = FirstColumn og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk.
- Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden i Deretter. Velg Utlastingstips til TR1. Velg tipstrinnet slutter her.
- Lagre og gi metoden et navn.
2. Klargjør prøve,labware og reagenser
- Overfør 5 μL samlet sunt humant plasma til en polypropylen, 96-runde deep well plate.
MERK: Se materialtabellen for reagenser og forsyninger som brukes i denne protokollen. TPCK Behandlet Trypsin ble kjøpt og trypsin til substrat ratio og inkubasjontid ble optimalisert spesielt. Hvis en annen karakter av trypsin brukes, for eksempel sekvensklasse rekombinant trypsin, bør enzymet til substratforholdet og inkubasjonstiden testes og optimaliseres.
3. Prosedyre for drift
- Dobbeltklikk på programvareikonet.
- Under Kategorien Metode velger du Hjem alle akser for å orientere og klargjøre den automatiserte væskebehandleren. Sørg for at alle arbeidsstasjonssprøyter ikke inneholder synlige luftbobler.
- Velg FileÅpne | Metode.
- Velg metoden (Figur 6).
- Start metoden ved å klikke på Run det grønne trekantformede Kjør-ikonet.
- Hvis du vil at en autosamplerplate skal klargjøres på slutten av metoden, angir du verdien "sann" i ledeteksten Angi en verdi som skal brukes for "Autosampler", og deretter klikker du OK. Hvis en autosamplerplate ikke blir klargjort, angir du verdien 'false', og deretter klikker du OK.
- Angi verdien '1' i angi en verdi som skal brukes for 'firstcolumn'-ledeteksten, og klikk deretter OK.
- Angi verdien '12' i angi en verdi som skal brukes for 'lastcolumn' prompt, og klikk deretter OK.
MERK: Dette trinnet og trinn 4.7 ber arbeidsstasjonen om å utføre en fordøyelse på 12 kolonner med en 96-brønnplate, noe som resulterer i at alle brønnene på platen brukes til fordøyelsen - Hvis en prøveplate brukes med prøvevolumer på minst 20 μL, angir du verdien "sann" i ledeteksten Angi en verdi som skal brukes for "SamplePlate", og deretter klikker du OK. Hvis en eksempelplate ikke brukes, angir du verdien 'false', og deretter klikker du OK.
MERK: Hvis en prøveplate ikke brukes, tilsett 5 μL prøve til hver tilsvarende brønn i reaksjonsplaten. - Følg instruksjonene i vinduet Guided Labware Setup , og klikk på Fortsett.
MERK: Det neste vinduet beskriver oppsettet for "Reagensplaten" som skal klargjøres (figur 7 , tilleggstabell 1). Følgende volumer vil bli sitert inn i hver av de 8 brønnene i en enkelt kolonne i 1 ml Deep Round 96-brønnplate:
Kolonne 1: 540 μL reaksjonsblanding 1.
Kolonne 2: 50 μL cysteinblokk.
Kolonne 3: 730 μL reaksjonsblanding 2.
Kolonne 4: 130 μL Trypsin.
Kolonne 5: 130 μL slukkeløsning.
Kolonne 5: 1090 μL mobilfaseløsning (hvis brukeren gikk inn i "sann" i trinn 6). - Klikk Neste, og følgende vindu beskriver minimumsvolumet (20 μL) som trengs for å bli lagret i prøveplaten. Hvis brukeren har angitt verdien "false" for ledeteksten som involverer prøveplaten (trinn 9), blir brukeren bedt om å legge til 5 μL-prøve i reaksjonsplaten.
- Klikk Neste.
MERK: Det neste vinduet viser at en tom 90 μL-tip-boks må plasseres på det automatiserte væskebehandlingsaggregatet. - Klikk Neste igjen, legg ut den automatiserte væskebehandlerens dekk som spesifisert og illustrert (Figur 8) inkludert reagensplaten, reaksjonsplaten, prøveplaten, autosamplerplaten, 6 hele 90 μL-tipbokser, en tom 90 μL-tip-boks og en full 230 μL-tipboks.
- Klikk Fullfør for å starte metoden.
MERK: Etter å ha klikket Fullfør, kan ikke brukeren nå inn i den automatiserte væskebehandleren. Dette vil "bryte lysgardinen" på maskinen og stoppe væskehåndtereren som en sikkerhetsforanstaltning. - Ved fortsett etter sentrifugering sentrifugering, hente reaksjonsplaten og sentrifuge den i 30 minutter ved 3000 rpm.
- Når sentrifugeringen er fullført, returnerer du reaksjonsplaten til den automatiserte væskebehandleren til den posisjonen den var i før sentrifugeringen, og klikker fortsett.
MERK: Den automatiserte væskebehandleren stopper igjen når metoden er fullført. Hvis brukeren skrev inn "true" for trinn 6, kan autosamplerplaten deretter fjernes fra arbeidsstasjonen og plasseres i autosampleren til et flytende kromatografiinstrument for analyse.
4. LC-MSMS
- Løs peptider på en høy strømning HPLC bestående av en C18 2,1 mm x 100 mm, 3,5 μm kolonne med en strømningshastighet på 0,25 ml / min og analysert inline på en trippel quadrupole massespektrometer.
MERK: Etter fordøyelsen peptid er den målrettede LC-MSMS-metoden for å kvantifisere peptider fra robotforberedte prøver beskrevet i detalj1 etter en kort beskrivelse av LC-MSMS. - Sett søyleovnstemperaturen til 40 °C. Bruk buffer A (2 % ACN, 98 % vann, 0,1 % maursyre) og buffer B (95 % ACN, 5 % vann, 0,1 % maursyre) som de to mobile fasene.
- Likevekten kolonnen med 5 % B i 5 minutter etter lasting. Elute peptidene over 30 minutter med en lineær 5% til 35% gradient av buffer B.
- Resirkuler kolonnen før du laster neste prøve ved å vaske med 98% B i 10 minutter og deretter 5% B i 5 minutter.
- For on-line avledning, avlede post-kolonne eluent til avfall før den kom inn i ion kilden ved hjelp av en to-fase vekslingsventil.
- Behandle MRM-dataene.
Representative Results
Den automatiserte proteomics prøve forberedelse arbeidsflyt på automatisert arbeidsstasjon ble tilpasset fra vår tidligere automatiserte protokoll med en robust LC-SRM-MS oppkjøpsmetode1 for albumin, det valgte plasmaproteinet, og β-galaktosidase (β-gal), et eksogene protein som brukes til kvalitetskontroll. Etter behandling ble prøvene kjørt på en trippel quadrupole LC-MS i en SRM analyse rettet mot serum albumin, β-galaktosidase. Variasjonskoeffisienten (CV) av SRM-signal for hver overgang ble brukt til å overvåke reproduserbarheten til automatisert fordøyelsesprotokoll.
Vi automatiserte reagenstillegget og blandetrinnene for en fordøyelse på 5 μL plasmaprøver med en 2-timers inkubatortrypsinkubasjon på dekk. For å bestemme reproduserbarheten ble 5 μL av et plasmabasseng pipetted i flere brønner av en reaksjonsplate med et flerkanals hode (96 pin). For å overvåke for konsistens, la vi til β-gal protein før reduksjonog alkylering reaksjoner. Den automatiserte proteomics prøve forberedelse arbeidsflyten ble testet med en robust LC-SRM-MS oppkjøpsmetode inkludert albumin, den høyeste overflod plasma protein, og β-gal protein, brukes for kvalitetskontroll. Tre β-gal peptider og to albumin peptider ble overvåket fra bearbeidet plasma albumin proteiner og piggete β-gal protein (Tabell 4).
I et forsøk på å spare tid og forenkle prosedyren, reduserte vi væskeoverføringstrinnene for å legge til / blande / inkubasjon av reagens og reaksjonblanding med arbeidsstasjonen fra en ni-trinns arbeidsflyt til en seks-trinns arbeidsflyt (figur 1). Den totale proteomiske arbeidsflyten består av to eksperimentelle komponenter: automatisert prøveklargjøring og LC-MS/MS. For det første evaluerte vi presisjonen til LC-MS/MS SRM-datainnhenting med åtte påfølgende injeksjoner fra samme fordøyelsesbrønn av autosamplerplaten. Presisjonen til den automatiserte arbeidsflyten for prøveklargjøring ble beregnet av prosent av varianskoeffisienten (%CV) av total proteomisk SRM-arbeidsflyt minus %CV for LC-MS/MS (figur 9B). Med strømlinjeformet plasma fordøyelsesprosedyre på den automatiserte arbeidsstasjonen, eksperimentell presisjon av automatiserte prøver forberedelse var mindre enn 11,4% for eksogene piggete β-gal proteiner (10,0% som gjennomsnitt), og mindre enn 14,9% for de mest tallrike humane serum albumin (9,9% som et gjennomsnitt) (Figur 9). Det ble observert gode signalintensiteter for både humant serumalbumin- og β-gal-proteiner som forventet (figur 9C).
For hvert pipetterings- og væskeoverføringstrinn ble teknikkene spesielt optimalisert. For å overvåke presisjonen av væskeoverføringstrinn, økte vi stabile isotop-merkede (SIL) peptidstandarder for endogene humant serumalbuminprotein og eksogene β-gal protein i tre uavhengige reagensoverføringstrinn: Reaction Mix 1, Cysteine Blocker og Reaction Mix 2 (Figur 10). MRM-signaler fra disse fem SIL-peptidene ble anskaffet for å overvåke presisjonen av automatiserte væskeoverføringstrinn. Gjennomsnittlig %CV for peptider, DDNPNLPR^, og GDFQFNISR^ (^ representerer N15-merket aminosyre) fra Reaction Mix 1 trinn varierte fra 1,8% til 11,2%. Gjennomsnittlig %CV for ett peptid (IDPNAWVER^) fra Cysteine Blocker-trinnet varierte fra 6,6 til 8,8 %. Gjennomsnittlig %CV av to peptider (WVGYGQDSR^ og LVNEVTEFAK^) varierte fra 6,2% til 11,9% (figur 10).
For å validere den automatiserte proteomics prøve forberedelse arbeidsflyten, evaluerte vi reproduserbarhet på tvers av flere proteiner og flere dager for humanserumalbumin, eksogene β-gal og 40 ekstra plasmaproteiner. Vi behandlet 21 replikering prøver (samlet normal menneskelig plasma), godt plassering vist i figur 11A, på tre forskjellige dager. Intradag-CV-er ble beregnet ut fra 21 brønner tilberedt samme dag. Gjennomsnittlig intradag %CVer for 40 proteiner varierte fra 4 % - 20 % (figur 11B). For å evaluere kanteffekten til platebasert automatisert arbeidsflyt ble %CV beregnet fra bestemte brønner i angitte kolonner og rader (Figur 12A for kolonne- og radkart). MRM signaler intensiteten var lik i alle kolonne- og radkonfigurasjoner med %CV fra 3 % - 22 % (figur 12B).
Oppsummert gir den optimaliserte automatiserte arbeidsflyten 96 jevnt behandlede prøver på mindre enn fem timer med utmerket eksperimentell presisjon. For kompatibilitet med en automatisert arbeidsflyt valgte vi reagenser som har ubetydelige ikke-spesifikke sidereaksjoner, er stabile i omgivelseslys, er LC-MS/MS-vennlige, og kan lagres som frosne aliquots.
Figur 1: Skjema for arbeidsflyt for prøveklargjøring. De 6 viktigste væskeoverføringstrinnene er oppført. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tips lasting Script. VB Script-detaljene vises her inne. Skriptet angir tipsinnlastingsbetingelser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Automatisert arbeidsstasjon Deck layout. Decket består av 1x1 ALPs, Tip Loading ALPs, Trash, Tip wash, Peltier og en inkubator. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Egenskaper for reagensplaten. Vist er egenskaper som trengs for reagensplaten labware når du får tilgang til ved hjelp av guidet Labware Setup. Velg den tilsvarende kolonnen, og skriv inn variablene som angitt i figuren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Tipstellingsskript. Dette skriptet bidrar til å holde oversikt over antall tips på dekk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Oversikt over metoden for å fordøye og sisitere plasmaprøver. Trinn for reagensberegninger, labware oppsett og flytende manipulasjoner i flytende behandlingsmetoden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Utformingen av reagensplaten. Vist er de kjemiske reagensene som trengs for plasmafordøyelse og autosamplerforberedelse og fordeles over reagensplaten labware. Dette tallet er endret fra et teknisk notat10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Layout for labware på dekk av den automatiserte arbeidsstasjonen. Vist er dekkoppsettet for plasmafordøyelsesmetoden for væskebehandleren. Dette tallet er endret fra et teknisk notat10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Presisjonen i total proteomisk arbeidsflyt består av arbeidsstasjons-CV og målrettet LC MS/MS CV.
Fem peptider fra β-gal og albumin ble overvåket, kromatogram og peptid oppbevaringstid for hvert peptid vises (A), Presisjon ble bestemt fra 30 brønner / prøver behandling representative eksperiment, CV% for total proteomisk arbeidsflyt, LC MS / MS analyse og automatisert prøvebehandling ble beregnet (B). Samlet sett viste de fordøyde peptidene gode signaler varierte fra 1x105 til 1x108. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Bestemmelse av presisjon for væskeoverføringstrinn. Syntetiske peptider ble spiked i trinn spesifikke reagenser, og automatisert væskeoverføring ble bestemt av total%CV. Fra 30 brønner/prøver eksperimenterer minus% CV LC MSMS (bestemmes av 8 gjentatte LC MSMS-injeksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Multi-days reproduserbarhet av automatisert proteomisk prøveforberedelsesarbeidsflyt med 42 protein MRM-analyse. (A) Reaksjonplatekart for hver av tre dager er vist her, 5 μL plasma ble tilsatt hver av 21 brønner. 3 brønner mottatt 5 ul vann ble brukt som negative /blanke kontroller. (B) Gjennomsnittlig intensitet på 190 overganger består av 75 peptider og 42 proteiner (venstre) og %CV for hver MRM-overgang ble beregnet ut fra 21 brønner for hver dag (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Reproduserbarhet av bestemte brønner (posisjon av kolonner og rader). (A) Kolonner og rader plassering med et platekart vises her. (B) Kolonne- og radplasseringsspesifikke MRM-signaler av gjennomsnittlige intensiteter fra spesifiserte brønner (venstre) og cv% (høyre) fra en enkelt plate fordøyelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 13: Skjermbilde av teknikkeditor. For hver pipetteringsmal definerer du egenskapene til væskenivåsregistrering, Clot detection, Piercing, Liquid Type, General, Aspirate, Dispense, Mix og Calibration. Malen og teknikkene som brukes i denne protokollen, vises i tilleggstabell 2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Variabel | Variabel | Verdi | Beskrivelse |
| Autosampler (autosampler) | Boolsk | Sant | Bruke autosampler |
| Betagal (andre versjon) | Heltall | 5 | Betagal volum |
| Bg1 (andre kan være på samme | Heltall | 0.8 | BG1-volum |
| Bg2 (andre kan være på samme | Heltall | 0.8 | BG2-volum |
| Bg3 (andre kan være på samme | Heltall | 0.8 | BG3-volum |
| CysteinBlocker (andre er i drift) | Heltall | 1.25 | Cysteine blokkering volum |
| CysteineBuffer (andre er i drift) | Heltall | 0.45 | Cysteine buffervolum |
| Denatureant (denaturant) | Heltall | 5 | Avnaturant volum |
| DigestTransfer (andre er i dag) | Heltall | 10 | Volum for ufullstendig overføring |
| Første buffer | Heltall | 25.9 | Første buffervolum |
| Første kolonne | Heltall | 1 | Første kolonne |
| HSA1 (andre har vært på stedet) | Heltall | 0.8 | HSA1-volum |
| HSA2 (andre er) | Heltall | 0.8 | HSA2-volum |
| sistekolonne | Heltall | 12 | Siste kolonne |
| MobilePhase (mobilfase) | Heltall | 90 | Mobilt fasevolum |
| Slukke | Heltall | 10 | Slukkekolonne |
| ReducingAgent (andre kan være på | Heltall | 5 | Redusere agentkolonne |
| Eksempel | Heltall | 5 | Eksempelkolonne |
| SamplePlate (sampleplate) | Boolsk | Sant | Bruk prøveplate |
| SecondBuffer (andrebuffer) | Heltall | 58.4 | Andre buffervolum |
| Trypsin (andre er i stedet) | Heltall | 10 | Trypsin-kolonnen |
Tabell 1: Starttrinnvariabler
| Verdi | Variabel |
| =FirstBuffer+Denaturant+ReduceAgent+Betagal+BG1+HSA1 | FirstMix (andre verdenskrig) |
| =CysteineBlocker+CysteineBuffer+BG2 | CysteineMix (Andre) |
| =SecondBuffer+BG3+HSA2 | SecondMix (andre miks) |
| =(FirstMix*Kolonner)+30 | FirstMixWell (andre er i gang med å |
| = (CysteineMix*Kolonner)+20 | CysteineWell (andre er i gang med å |
| =(SecondMix*Kolonner)+10 | AndreMixWell (andre miksen) |
| =(Trypsin*Kolonner)+10 | TrypsinWell (andre er i stedet) |
| =(Slukke*kolonner)+10 | SlukkeBrønn |
| =(FirstMixWell*8)+100 | FirstMixStock (andre kan være på gang) |
| =CysteineWell*8+20 | CysteineMixStock |
| =(SecondMixWell*8)+100 | AndreMixStock (andre mikstre) |
Tabell 2: Variabeler for volumblanding
| Type | navn | Posisjon | Dybde | Egenskaper | Bruke? |
| BcDeep96Runde | Reagensplate | P5 (andre er) | 1 (øverst) | # | =Ikke SamplePlate |
| BcDeep96Runde | Reagensplate | P5 (andre er) | 1 (øverst) | # | =SamplePlate (eksempelplate) |
| BcDeep96Runde | Reaksjonplate | P11 (andre er i seg selv) | 1 (øverst) | Sant | |
| Bio_RadPCR96* | Prøver | P9 (andre er) | 1 (øverst) | =SamplePlate (eksempelplate) | |
| Bio_RadPCR96* | Autosampler Plate | P10 (andre er i stil) | 1 (øverst) | =Autosampler (autosampler) | |
| 100 000 000 00 | Tom | 1 (øverst) | Sant | ||
| 100 000 000 00 | 1 (øverst) | Sant | |||
| 100 000 000 00 | 1 (øverst) | Sant | |||
| 1999: 100 000 000 | 1 (øverst) | =Autosampler (autosampler) | |||
| 100 000 000 00 | 1 (øverst) | =Kolonner>1 | |||
| 100 000 000 00 | 1 (øverst) | =Kolonner>3 | |||
| 100 000 000 00 | 1 (øverst) | =Kolonner>5 | |||
| 100 000 000 00 | 1 (øverst) | =Kolonner>7 | |||
| 100 000 000 00 | 1 (øverst) | =Kolonner>9 | |||
| Merk: *: Tilsvarer 96-brønnen Bio-Rad-platen. #: Klikk egenskaper, og angi deretter volumvariablene som angitt i figur 6. |
|||||
Tabell 3: Konfigurere det veiledede oppsettet
| Protein ID | Peptid sekvens | Q1-messe (Da) | Q3-messe (Da) | Tid (min) | Fragment Ion | Declustering potensial | Kollisjonsenergi | Potensial for avslutning av kollisjonscelle |
| sp | P00722| BGAL_ELOCI | GDFQFNISR (andre betydninger) | 542.3 | 262.1 | 19.7 | +2y2 (andre kan være på denne siden) | 61 | 21 | 8 |
| 542.3 | 636 | 19.7 | +2y5 (andre kan være på | 61 | 25 | 12 | ||
| 542.3 | 764.2 | 19.7 | +2y6 (andre kan være på | 61 | 25 | 18 | ||
| IDPNAWVER (Andre) | 550.3 | 436.1 | 18.1 | +2y7+2 | 61 | 23 | 8 | |
| 550.3 | 871.2 | 18.1 | +2y7 (andre kan være på siden 2015 | 61 | 25 | 18 | ||
| 550.3 | 774.2 | 18.1 | +2y6 (andre kan være på | 61 | 33 | 8 | ||
| WVGYGQDSR (andre er i ferd med å bli | 534.3 | 782.1 | 12.1 | +2y7 (andre kan være på siden 2015 | 51 | 25 | 6 | |
| 534.3 | 562.1 | 12.1 | +2y5 (andre kan være på | 51 | 27 | 6 | ||
| 534.2 | 505.2 | 12.1 | +2y4 (2y4) | 90 | 25 | 8 | ||
| sp | P02768| ALBU_HUMAN | DDNPNLPR (andre betydninger) | 470.8 | 596.2 | 9.2 | +2y5 (andre kan være på | 61 | 27 | 16 |
| 470.8 | 499.3 | 9.2 | +2y4 (2y4) | 61 | 27 | 18 | ||
| 470.8 | 710.4 | 9.2 | +2y6 (andre kan være på | 61 | 27 | 18 | ||
| LVNEVTEFAK (Nær LVNEVTEFAK) | 575.3 | 694.4 | 18.2 | +2y6 (andre kan være på | 73.1 | 29.6 | 18 | |
| 575.3 | 937.5 | 18.2 | +2y8 (2y8) | 73.1 | 29.6 | 18 | ||
| 575.3 | 823.4 | 18.2 | +2y7 (andre kan være på siden 2015 | 73.1 | 29.6 | 18 |
Tabell 4: MRM-parametere
Tilleggstabell 1: Reagensplate Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggstabell 2: Protokollmal Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Prøvebehandling for massespektrometri krever proteindenaturering, reduksjon og alkylering for å blokkere cysteiner, og trypsin fordøyelse navle proteiner i peptider. Hver kjemiske eller enzymatiskreaksjon må initieres på et bestemt tidspunkt og utføres ved en kontrollert temperatur, og hvert trinn i prosessen innebærer flere flytende overføringstrinn der eksperimentell variasjon kan innføres. Automatisert prøvebehandling gir en løsning på dette dilemmaet. For tiden tilgjengelige væskehåndteringssystemer har evnen til å overføre reagenser til 96-brønnplater med en nøyaktighet og presisjon på mindre enn 5%, avhengig av hodet og tipstypen som brukes, og for å inkubere prøver, med risting om ønskelig, under kontrollerte temperaturer fra 14 °C til 70 °C. Vi brukte en automatisert væskebehandling til å behandle plasma for SRM-analyser i et 96-brønnformat.
Det er mange tusen protease cleavage steder innenfor de komplekse blandinger av proteiner i serum, plasma, og andre biologiske prøver; og hver av disse proteinene har unike egenskaper som påvirker tilgjengeligheten av spaltingsstedet og stabiliteten til de resulterende peptidene. Det er derfor umulig å designe en prøvebehandlingsprosedyre som er optimal for hvert protein. Det beste alternativet er å være så konsekvent som mulig.
For å oppnå konsistens optimaliserte vi hvert pipetteringstrinn utført av den automatiserte væskebehandleren. Vi vurderte først volumet som kreves og begrensninger pålagt av væskens type (plasma, vandige eller organiske) og tilsvarende egenskaper (viskositet, samhold og volatilitet), maskinvare (arbeidsstasjonsrør og plategripende armer) og labware. Vi varierte deretter hastigheten og etterfølgende luftgapet for aspirasjon, hastighet og utblåsningsvolum for dispensering, og kraften og varigheten av blanding, mens vi innlemmet en tip touch etter aspirasjon og / eller dispensering, om nødvendig, for å eliminere væskesomfølger til utsiden av tipsene (Figur 13, Tilleggstabell 1). Et unikt SIL-peptid, forhåndsscreenet for stabilitet, ble spiked inn i hver reagens for å gjøre det mulig å overvåke presisjonen til hvert væskehåndteringstrinn. Etter optimalisering var prosessen CVer for de fleste av overgangene mindre enn 10%, noe som viste god reproduserbarhet med den automatiserte arbeidsstasjonen (Figur 9, Figur 10, Figur 11 og Figur 12).
Den automatiserte arbeidsflyten som presenteres her gir konsekvent enzymatisk fordøyelse med forbedret reproduserbarhet og gjennomstrømning sammenlignet med manuelle metoder (Figur 9, Figur 10). Denne tilnærmingen lover å forbedre nøyaktigheten og påliteligheten til biomarkøroppdagelse og validering av massespektrometri.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A Pooled healthy human plasma | Bioreclamation Inc. | human plasma tested in the manuscript | |
| Acetonitrile, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | A998SK1 | LC MS/MS solvent |
| B-Galactosidase Recombinant from E.Coli | Sigma-Aldrich | G3153-5MG | exogenous control proteins. |
| Biomek i7 Automated Workstation | Beckman Coulter, Inc. | The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions | |
| Biomek i-Series Tips 230µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85903 | Tips, i7 consumable |
| Biomek i-Series Tips 90µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85881 | Tips, i7 consumable |
| FG, Kit Trypsin TPCK | Sciex | 4445250 | Trypsin used in digestion |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | #hsp9641 | Autosampler plate |
| Octyl B-D-Glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O9882-5G | detergent used in digestion |
| Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile | Beckman Coulter, Inc. | 267007 | Reagent and digestion plate |
| Prominence UFLCXR HPLC system | Shimadzu, Japan | High flow LC sytem | |
| QTRAP 6500 | SCIEX | Mass spectrometer | |
| Water, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | W54 | LC MS/MS solvent |
| Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm | Waters | 186003564 | LC MSMS column |
References
- Fu, Q., et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Lehmann, S., et al. Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold? Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Yates, J. R. 3rd Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).
- Nilsson, T., et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).
- Van Eyk, J. E., Sobhani, K.
- Hoofnagle, A. N., et al. Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays. Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).
- Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series. Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).
