Summary
여기서, 우리는 질량 분광법 기반 정량적 단백질 분석을 위한 자동화된 혈장 단백질 소화 방법을 제시한다. 이 프로토콜에서는 단백질 변성, 감소, 알킬화 및 트립신 소화 반응을 위한 액체 전달 및 배양 단계가 간소화되고 자동화됩니다. 원하는 정밀도로 96웰 플레이트를 준비하는 데는 약 5시간이 걸립니다.
Abstract
프로테오믹스에서 질량 분석 분석을 위한 샘플 준비에는 펩타이드 혼합물로 단백질의 효소 절단이 필요합니다. 이 프로세스는 변성, 감소, 알킬화 및 절단을 달성하기 위해 수많은 인큐베이션 및 액체 전달 단계를 수반합니다. 이 워크플로를 자동화된 워크스테이션에 적용하면 효율성을 높이고 분산 계수를 줄일 수 있어 샘플 유형 간의 통계 비교를 위해 보다 신뢰할 수 있는 데이터를 제공할 수 있습니다. 우리는 이전에 자동화 된 프로테오믹 샘플 준비워크플로우 1을설명했습니다. 여기에서는 다음과 같은 장점을 가진 보다 효율적이고 더 나은 제어 워크플로우의 개발을 보고합니다: 1) 시약을 결합하여 액체 전달 단계의 수가 9개에서 6개로 줄어듭니다. 2) 파이펫팅 시간은 여러 채널이있는 96 위치 파이펫팅 헤드를 사용하여 선택적 팁 파이펫팅에 의해 감소됩니다. 3) 최대 45개의 데크 포지션을 사용할 수 있도록 잠재적 처리량이 증가합니다. 4) 시스템의 완전한 인클로저는 향상된 온도 및 환경 제어를 제공하고 샘플 또는 시약의 오염 가능성을 감소시킵니다. 5) 각 샘플에 β-갈락토시다아제 단백질뿐만 아니라 안정적인 동위원소 표지 된 펩티드를 첨가하면 전체 공정에서 모니터링 및 품질 관리가 가능합니다. 이러한 하드웨어 및 공정 개선은 좋은 재현성을 제공하고 분석 내 및 분석 간 정밀도(CV 20% 미만)를 개선합니다. LC-MS 기반 단백질 및 펩타이드 정량화를 위해. 96웰 플레이트에서 96개의 샘플을 소화하기 위한 전체 워크플로우를 약 5시간 만에 완료할 수 있습니다.
Introduction
질량분석법(MS)-기반 단백질 및 펩타이드 정량화는 기초 연구 및 임상 실험실에서 플라즈마 분석을 위한 생체 분석 도구로 점점 더 많이 적용되고 있다2,,3. 필요한 계측 및 정보학은 MS가 단일 MS 실행4에서수백 개의 펩티드를 정량화하는 능력으로 인해 특정 펩티드 서열을 표적화함으로써 단백질 또는 변형 된 단백질을 정량화하는 방법이 됨에 따라 급속히 발전했습니다. 시료 전제제는 모든 프로테오믹 분석을 위한 기초역할을 합니다. MS 분석에 앞서, 생물학적 샘플의 단백질은 전형적으로 변성, 감소, 알킬화, 트립펩티드내로 소화되고, 및 탈염5. 알킬레이션은 비제어 수정을 방지하고 모든 시스테인이 동일한 질량을 갖도록 시스테인을 차단합니다. 다음으로, 트립신은 펩티드에 단백질을 소화하기 위해 첨가됩니다. 이러한 각 단계는 최적화가 필요하며 전체 프로세스는 일반적으로 수동으로 수행되므로 분석 오류가 도입될 수 있습니다.
전통적인 바이오마커 개발 파이프라인은 두 가지 주요 과정으로 구성됩니다: 글로벌 단백질 발견을 위한 산탄총 프로테오믹스 는 심층단백질 인벤토리6과 고정밀 및 고처리량 단백질 정량화를 목표로 하는 검증 및 검증을 위한 표적 프로테오믹스7. MS 접근법에 관계없이, 샘플 제제는 동일하며 펩타이드 혼합물로 단백질의 효소 절단을 중심으로 합니다. Van Eyk 및 Sobhani8에의해 제안된 바와 같이, 발견 및 표적 분석모두에 대한 정확하고 정밀하며 재현 가능한 분석을 가능하게 하는 방법을 갖는 것은 발견 바이오마커를 임상 구현 분석법으로 효과적으로 이동시키는 것이 요구된다. 이를 위해 시료 전처리의 자동화가 도움이 되고 높은 처리량 분석으로 효율성을 높일 수 있는 기능을 제공합니다. 수동 방법은 전형적으로 바이오마커 및 진단2,,9를포함하는 개정된 생물분석방법 검증 지침에서 식품의약품안전청(FDA)에 의해 지정된 허용 한계를 초과하는 분석 오류를 도입한다. 수천 개의 생물학적 샘플을 준비하고 분석해야 하는 바이오마커 연구를 용이하게 하기 위해서는 빠르고 매우 정확하며 핸즈프리 MS 단백질 샘플 준비 워크플로우의 개발이 필요합니다. MS 샘플 준비에는 오류가 발생될 수 있는 많은 단계가 있으며 프로세스가 지루하고 시간이 많이 걸립니다.
우리의 개선 된 방법에서, 자동화 된 워크 스테이션은 총 6 단계 (그림 1)에서 필요한 모든 플라즈마 샘플 준비 절차를 수행하도록 프로그래밍되어 1) 정확한 액체 전달을보장합니다. 2) 반응은 일관된 시간에 개시되고 중단되는; 3) 반응은 조절 된 온도 (즉, 인큐베이터)에서 수행된다; 및 4) 반응은 모든 반응에 대해 균일한 혼합을 가한다. 우리는 또한 96 웰 형식으로 LC-MS 기반 단백질 및 펩타이드 정량화의 품질과 재현 가능한 처리량을 보장하기 위해 외인성 품질 관리 단백질 및 내부 표준 (안정적인 동위 원소 표지 펩타이드 표준)을 추가구현했습니다. 시약 준비, 작업 시간 및 총 1,000,000개의 파이펫팅 단계를 포함하여 개별 튜브에서 96개의 샘플을 처리해야 합니다. 자동화는 실습 시간과 관련된 인간 상호 작용 의 수를 줄입니다.
Protocol
1. 자동 액체 처리기를 위한 프로그래밍
- 파일 메뉴에서 새 메서드 만들기(파일 | 새로운 방법)
참고: 주어진 순서대로 단계를 완료합니다. 기울임꼴 글꼴은 Biomek 소프트웨어에 입력할 텍스트를 나타냅니다. 파이펫팅 기술 및 템플릿에 대한 정보는 저자에게 문의하십시오. - 입력 시작 단계 변수 및 시작 단계의 값은 표 1에 나와 있습니다.
- 선택적 팁 파이펫팅을 위해 열을 설정합니다. 1.3-1.7 단계의 경우 제어 단계 아래의 도구 모음에서 전역 설정 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다.
- 전역 설정 단계를 사용하여 값 =FirstColumn을 변수 FirstColumn_Global,값 =LastColumn에서 변수 LastColumn_Global,값 =LastColumn-FirstColumn+1에서 변수 열로설정하고, 값 =열*8을 변수 Wells로 설정합니다.
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 스크립트 단계를 선택하고 메서드로 드래그합니다. 그림 2에표시된 대로 VB 스크립트를 입력합니다.
- 글로벌 및 솔루션 설정 믹스에 대한 볼륨 설정
- 전역 설정 단계를 사용하여 표 2에 표시된 볼륨 혼합 변수에 해당하는 값을 설정합니다.
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 If 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 조건에서 자동 샘플러를입력합니다.
- 그런 다음 제어 단계 아래의 도구 모음에서 전역 설정 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다.
- 전역 설정 단계를 사용하여 값 =(MobilePhase*열))+10을 가변 MobilePhaseWell로 설정합니다.(
- 그렇지 않으면 제어 단계 아래의 도구 모음에서 전역 설정 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다.
- 전역 설정 단계를 사용하여 값 =0을 변수 MobilePhaseWell으로 설정합니다.
- 안내식 랩웨어 설정 구성(GLS)
- 유틸리티 아래의 도구 모음에서 데크 편집기 단계를 클릭합니다. 그림 3의 덱 레이아웃에 맞게 새 데크를 만들고 데크 1로 레이블을 지정합니다.
- 설치 및 장치 아래의 도구 모음에서 안내식 설치 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 표 3에표시된 대로 데크 위치에서 랩웨어 유형을 드래그 앤 드롭합니다. 그런 다음 표 3 및 그림 4(안내식 Figure 4 설정 설정)에 표시된 대로 표의 탭을 채웁니다.
- 팁 계산 절차 설정
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 절차 정의 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 이름 프로시저를 TipCount로 지정합니다.
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 스크립트 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 그림 5(팁 계산 스크립트)에 표시된 대로 VB 스크립트를 입력합니다.
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 If 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다.
- 조건에서 TL5 = 0을 입력합니다.
- 그런 다음설치 및 장치 단계 아래의 도구 모음에서 Labware 이동 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 실험실제품을 TL5에서 TR3로 이동합니다. 도구 모음의 설치 및 장치 단계 아래에 있는 Labware 이동 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 실험실용품을 TL2에서 TL5로 이동합니다. 마지막으로 설치 및 장치 단계 아래의 도구 모음에서 Labware 이동 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 랩웨어를 BC90에서 TL2로 이동합니다.
- 인큐베이터 절차 정의
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 절차 정의 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 인큐베이터로 프로시저를 지정합니다.
- 하프타임을 가변 이름으로 입력하고 1800을 기본값으로 입력합니다.
- NextTemp를 가변 이름으로 입력하고 22를 기본값으로 입력합니다.
- 임시값을 가변 이름으로 입력하고 60을 기본값으로 입력합니다.
- 설치 및 장치 단계 아래의 도구 모음에서 향상된 이동 Labware 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 랩웨어를 P11에서 INHECO1로 이동합니다.
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 프로시저 실행 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 이름 프로시저를 TipCount로 지정합니다.
- 통합 아래의 도구 모음에서 INHECO 인큐베이트 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. INHECO1을 입력하여 장치를 위치에 사용하고, 인큐베이트의 경우 HalfTime, 목표 온도의 경우 =C의 경우 =C, 3°C를 입력합니다. 옵션을 인큐베이션하는 동안 흔들기와 궤도 (시계 방향)쉐이크 스타일을 선택합니다. 설정의 경우 좌우 1.00mm, 초당 6.6회, 뒤로 1.00mm, 광고 뒤로 6.6회 입력합니다.
참고: INHECO 인큐베이터 소프트웨어가 설치되어 있는지 확인합니다. - 통합 아래의 도구 모음에서 INHECO 인큐베이트 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. INHECO1을 입력하여 장치를 위치에 사용하고, 인큐베이트의 경우 HalfTime, 목표 온도의 경우 =C의 경우 =C, 3°C를 입력합니다. 인큐베이션 옵션과 궤도 (시계 반대 방향)쉐이크 스타일을 하면서 흔들림을 선택합니다. 설정의 경우 좌우 1.00mm, 초당 6.6회, 앞뒤로 1.00mm를 1초에 6.6회 입력합니다.
- 설정 및 장치 단계 아래의 도구 모음에서 일시 중지 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 전체 시스템을 1s동안 일시 중지합니다.
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 절차 정의 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 인큐베이터로 프로시저를 지정합니다.
- 통합 아래의 도구 모음에서 INHECO 인큐베이트 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. INHECO1을 입력하여 장치를 위치에 사용하고, 인큐베이트용 은 1, 다음Temp는 °C에, 3은 목표 온도의 경우 3입니다.
- 오비탈에 대한 프로시저를 정의합니다.
- 설치 및 장치 단계 아래의 도구 모음에서 향상된 이동 Labware 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 실험실제품을 P11에서 궤도1로 이동합니다.
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 프로시저 실행 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 절차 팁카운트를 선택합니다.
- 설정 및 장치 단계 아래의 도구 모음에서 장치 작업 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 장치 오리탈 셰이커0, 명령 시간 셰이크를 선택합니다. 흔들어 속도 1000을입력 , 시간은 최대 속도 2에 도달하는 시간 2, 30을 흔들 수있는 시간 .
- 설치 및 장치 단계 아래의 도구 모음에서 향상된 이동 Labware 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 랩웨어 궤도 1을 P11로 이동합니다.
- 첫 번째 믹스 설정
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 선택 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 위치 TL4 를 다시 정렬합니다.
- 통합 아래의 도구 모음에서 INHECO 인큐베이트 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. INHECO1을 입력하여 장치를 위치에, 1은 인큐베이트용, 60은 °C, 3은 목표 온도의 경우 3을 입력합니다.
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 루프 단계를 클릭하고 팁 선택 단계 내에서 메서드로 드래그합니다. col을 변수 =FirstColumn을 시작으로, =LastColumn을 끝으로, 1을 증분으로 입력합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 로드 선택 단계를 클릭하고 루프 단계 내에서 메서드로 드래그합니다. 드롭다운 메뉴에서 BC90 팁, TL5 위치 및 TL2 백업 팁 위치를 선택합니다. 단일 열을 선택하고 1을입력합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 흡인 선택 단계를 클릭하고 루프 단계 내에서 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 시약 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 = FirstMix, 열 1 및 행 1에서 흡인을 입력합니다. 1 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 디스펜스 선택 단계를 클릭하고 루프 단계 내에서 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 시약 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 = FirstMix를입력하여 열 = col 및 행 1에서분배합니다. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 언로드 선택 단계를 클릭하고 루프 단계 내에서 메서드로 드래그합니다. TR1에 대한 언로드 팁을 선택합니다.
- 샘플 설정
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 If 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 샘플 플레이트를 조건으로 입력합니다.
- 그런 다음액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 로드 팁 선택 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 드롭다운 메뉴에서 BC90 팁, TL5 위치 및 TL2 백업 팁 위치를 선택합니다. 단일 열을 선택하고 =팁열에 입력합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 흡인 선택 단계를 클릭하고 그 안에 메서드로 드래그합니다. Greiner96RoundPS 랩웨어 유형 및 샘플 위치를 선택합니다. 볼륨 = 샘플, 열에서 흡인도 = FirstColumn 및 행 1을입력합니다. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 분배 선택 단계를 클릭하고 그 안에 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 반응 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 = 샘플,열에서 디스펜싱 = FirstColumn 및 행 1. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 언로드 선택 단계를 클릭하고 그 안에 메서드로 드래그합니다. TR1에 대한 언로드 팁을 선택합니다.
- If 단계가 끝나면 제어 단계 아래의 도구 모음에서 절차 실행 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 절차 인큐베이터를 선택합니다. 하프타임을 가변 이름으로 입력하고 1800을 기본값으로 입력합니다. NextTemp를 가변 이름으로 입력하고 22를 기본값으로 입력합니다. 임시값을 가변 이름으로 입력하고 60을 기본값으로 입력합니다.
- 시스테인 블록 설정
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 루프 단계를 클릭하고 팁 선택 단계 내에서 메서드로 드래그합니다. col을 변수 =FirstColumn을 시작으로, =LastColumn을 끝으로, 1을 증분으로 입력합니다.
- 루프아래에서 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 로드 팁 선택 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 드롭다운 메뉴에서 BC90 팁, TL5 위치 및 TL2 백업 팁 위치를 선택합니다. 단일 열을 선택하고 1을입력합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 흡인 선택 단계를 클릭하고 루프 내에서 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 시약 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 = 시스테인 믹스를입력 , 열 2 및 행 1에서흡인 . 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 디스펜스 선택 단계를 클릭하고 루프 내에서 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 반응 플레이트 위치를선택합니다. 볼륨 = 시스테인 믹스, 컬럼 = 콜 및 행 1에서분배합니다. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 언로드 선택 단계를 클릭하고 그 안에 메서드로 드래그합니다. TR1에 대한 언로드 팁을 선택합니다.
- If 루프가 끝나면 제어 단계 아래의 도구 모음에서 프로시저 실행 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 절차 인큐베이터를 선택합니다. 하프타임을 가변 이름으로 입력하고 300을 기본값으로 입력합니다. NextTemp를 가변 이름으로 입력하고 43을 기본값으로 입력합니다. 임시값을 변수 이름으로 입력하고 25를 기본값으로 입력합니다.
- 두 번째 믹스 설정
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 루프 단계를 클릭하고 팁 선택 단계 내에서 메서드로 드래그합니다. col을 변수 =FirstColumn을 시작으로, =LastColumn을 끝으로, 1을 증분으로 입력합니다.
- 루프 아래에서 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 로드 팁 선택 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 드롭다운 메뉴에서 BC90 팁, TL5 위치 및 TL2 백업 팁 위치를 선택합니다. 단일 열을 선택하고 1을입력합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 흡인 선택 단계를 클릭하고 루프 내에서 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 시약 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 = SecondMix, 열 3 및 행 1에서흡인을 입력합니다. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 디스펜스 선택 단계를 클릭하고 루프 내에서 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 반응 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 입력 = SecondMix, 열에서 분배 = col 및 행 1. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 언로드 선택 단계를 클릭하고 그 안에 메서드로 드래그합니다. TR1에 대한 언로드 팁을 선택합니다.
- If 루프가 끝나면 제어 단계 아래의 도구 모음에서 프로시저 실행 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 프로시저 오비탈을 선택합니다.
- 설정 및 장치 단계 아래의 도구 모음에서 일시 중지 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 전체 시스템을 1s동안 일시 중지합니다.
- 트립신 추가 설정
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 루프 단계를 클릭하고 팁 선택 단계 내에서 메서드로 드래그합니다. col을 변수 =FirstColumn을 시작으로, =LastColumn을 끝으로, 1을 증분으로 입력합니다.
- 루프아래에서 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 로드 팁 선택 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 드롭다운 메뉴에서 BC90 팁, TL5 위치 및 TL2 백업 팁 위치를 선택합니다. 단일 열을 선택하고 1을입력합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 흡인 선택 단계를 클릭하고 루프 내에서 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 시약 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 = 트립신을입력 , 열 4 및 행 1에서흡인 . 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 디스펜스 선택 단계를 클릭하고 루프 내의 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 반응 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 = 트립신, 열 = 콜 및 행 1에서분배를 입력합니다. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 언로드 선택 단계를 클릭하고 그 안에 메서드로 드래그합니다. TR1에 대한 언로드 팁을 선택합니다.
- If 루프가 끝나면 제어 단계 아래의 도구 모음에서 프로시저 실행 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 절차 인큐베이터를 선택합니다. 하프타임을 가변 이름으로 입력하고 3600을 기본값으로 입력합니다. NextTemp를 가변 이름으로 입력하고 25를 기본값으로 입력합니다. 임시값을 변수 이름으로 입력하고 43을 기본값으로 입력합니다.
- 통합 아래의 도구 모음에서 INHECO 인큐베이트 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. INHECO 인큐베이터 소프트웨어가 설치되어 있는지 확인합니다. INHECO1을 입력하여 장치를 위치에, 1은 인큐베이트용, 25는 °C, 5는 목표 온도의 경우 5를 입력합니다.
- 담금질 설정
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 루프 단계를 클릭하고 팁 선택 단계 내에서 메서드로 드래그합니다. col을 변수 =FirstColumn을 시작으로, =LastColumn을 끝으로, 1을 증분으로 입력합니다.
- 루프아래에서 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 로드 팁 선택 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 드롭다운 메뉴에서 BC90 팁, TL5 위치 및 TL2 백업 팁 위치를 선택합니다. 단일 열을 선택하고 1을입력합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 흡인 선택 단계를 클릭하고 루프 내에서 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 시약 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 = 담금질,열 5 및 행 1에서흡인을 입력합니다. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 디스펜스 선택 단계를 클릭하고 루프 내에서 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 반응 플레이트 위치를선택합니다. 볼륨 = 담금질,열 = col 및 행 1에서분배를 입력합니다. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 언로드 선택 단계를 클릭하고 다음내에서 메서드로 드래그합니다. TR1에 대한 언로드 팁을 선택합니다.
- If 루프가 끝나면 제어 단계 아래의 도구 모음에서 프로시저 실행 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 프로시저 오비탈 을 선택합니다.
- 설정 및 장치 단계 아래의 도구 모음에서 일시 중지 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 1s에대한 전체 시스템을 일시 중지합니다.
- 설정 및 장치 단계 아래의 도구 모음에서 일시 중지 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 전체 시스템 일시 중지를 선택하고 이 메시지를 표시합니다. '원심분리 후 계속'라는 메시지를 입력합니다.
- 자동 샘플러용 플레이트 설정
- 제어 단계 아래의 도구 모음에서 If 단계를 클릭하고 팁 선택 단계 내에서 메서드로 드래그합니다. 자동 샘플러를 조건으로 입력합니다.
- 그런 다음 제어 단계 아래의 도구 모음에서 루프 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. col을 변수 =FirstColumn을 시작으로, =LastColumn을 끝으로, 1을 증분으로 입력합니다.
- 루프아래에서 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 로드 팁 선택 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 드롭다운 메뉴에서 BC230 팁, TL6 위치 및 TL2 백업 팁 위치를 선택합니다. 단일 열을 선택하고 1을입력합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 흡인 선택 단계를 클릭하고 루프 내에서 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 시약 플레이트 위치를선택합니다. 볼륨 = 모바일 페이즈, 열 6 및 행 1에서흡인을 입력합니다. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 디스펜스 선택 단계를 클릭하고 루프 내에서 메서드로 드래그합니다. Bio_RadPCR96 랩웨어 유형 및 자동 샘플러 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 = 모바일 페이즈, 열 = col 및 행 1에서분배합니다. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 언로드 선택 단계를 클릭하고 다음내에서 메서드로 드래그합니다. TR1에 대한 언로드 팁을 선택합니다.
- If 루프가 끝나면 제어 단계 아래의 도구 모음에서 프로시저 실행 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 절차 팁카운트 를 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 로드 팁 선택 단계를 클릭하고 메서드로 드래그합니다. 드롭다운 메뉴에서 BC90 팁, TL5 위치 및 TL2 백업 팁 위치를 선택합니다. 단일 열을 선택하고 =팁열에 입력합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 흡인 선택 단계를 클릭하고 루프 내의 메서드로 드래그합니다. BCDeep96Round 랩웨어 유형 및 반응 플레이트 위치를선택합니다. 볼륨 입력 = 다이제스트트랜스퍼,열 =firstcolumn 및 행 1에서흡기. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 디스펜스 선택 단계를 클릭하고 루프 내에서 메서드로 드래그합니다. Bio_RadPCR96 랩웨어 유형 및 자동 샘플러 플레이트 위치를 선택합니다. 볼륨 = 모바일 페이즈, 열 = 첫 번째 열 및 행 1에서분배합니다. 기술 드롭다운 메뉴에서 최적화된 기술을 선택합니다.
- 액체 처리 단계 아래의 도구 모음에서 팁 언로드 선택 단계를 클릭하고 다음내의 메서드로 드래그합니다. TR1에 대한 언로드 팁을 선택합니다. 선택 팁 단계는 여기에서 끝납니다.
- 메서드를 저장하고 이름을 지정합니다.
2. 시편, 실험실용품 및 시약 준비
- 풀린 건강한 인간 플라즈마의 5 μL을 폴리프로필렌, 96 라운드 딥 웰 플레이트로 옮김.
참고: 이 프로토콜에 사용된 시약 및 소모품에 대한 재료 표를 참조하십시오. TPCK 처리 트립신을 구입하였고, 기판 비 및 인큐베이션 시간을 특별히 최적화하였다. 서열 재조합 트립신과 같은 다른 등급의 트립신이 사용되는 경우, 효소 대 기질 비 및 배양 시간을 테스트하고 최적화해야 한다.
3. 운영 절차
- 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭합니다.
- 방법 탭에서 홈 모든 축을 선택하여 자동 액체 처리기를 방향을 지정하고 준비합니다. 모든 워크스테이션 주사기에 눈에 보이는 기포가 없는지 확인합니다.
- 파일아래에서 열기 | 메서드입니다.
- 방법을 선택합니다(그림6).
- 녹색 삼각형 모양의 실행 아이콘을 클릭하여 메서드를 시작합니다.
- 메서드의 끝에 자동 샘플러 플레이트를 준비하려면 '자동 샘플러' 프롬프트에 사용할 값을 입력에 'true' 값을 입력한 다음 확인을클릭합니다. 자동 샘플러 플레이트가 준비되지 않은 경우 값 'false'를 입력한 다음 확인을클릭합니다.
- 'firstcolumn' 프롬프트에 사용할 값 입력에 값 '1'을 입력한 다음 확인을클릭합니다.
- 'lastcolumn' 프롬프트에 사용할 값 입력에 값 '12'를 입력한 다음 확인을클릭합니다.
참고: 이 단계와 4.7 단계는 워크스테이션에 96웰 플레이트의 12개 열에서 소화를 수행하도록 지시하여 소화에 사용되는 플레이트의 모든 웰을 생성합니다. - 샘플 플레이트가 20 μL 이상의 샘플 볼륨과 함께 사용되는 경우 'SamplePlate' 프롬프트에 사용할 값 입력에 'true' 값을 입력한 다음 확인을클릭합니다. 샘플 플레이트를 사용하지 않는 경우 값 'false'를 입력한 다음 확인을클릭합니다.
참고: 샘플 플레이트를 사용하지 않는 경우 반응 플레이트의 각 해당 웰에 5 μL의 샘플을 추가합니다. - 안내식 Labware 설치 창의 지침을 따르고 계속을클릭합니다.
참고: 다음 창은 준비할 "시약 플레이트"의 레이아웃을 설명합니다(그림7, 보충 표 1). 다음 볼륨은 1 mL 딥 라운드 96 웰 플레이트의 단일 컬럼의 8개의 웰 각각에 aliquoted표시됩니다.
열 1: 540 μL의 반응 혼합 1.
열 2: 시스테인 블록의 50 μL.
열 3: 730 μL의 반응 혼합 2.
열 4: 트립신의 130 μL.
열 5: 담금질 용액의 130 μL.
열 5: 1090 μL 의 모바일 위상 솔루션(사용자가 6단계에서 'true'를 입력한 경우). - 다음을 클릭하고 다음 창은 샘플 플레이트에 aliquoted에 필요한 최소 볼륨(20 μL)을 설명합니다. 사용자가 샘플 플레이트(단계 9)와 관련된 프롬프트에 대해 'false' 값을 입력하면 반응 플레이트에 5 μL 샘플을 추가하라는 메시지가 표시됩니다.
- 다음을 클릭합니다.
참고: 다음 창은 빈 90μL 팁 박스를 자동 액체 처리기 데크에 배치해야 함을 보여줍니다. - 다음을 다시 클릭하고, 시약 플레이트, 반응 플레이트, 샘플 플레이트, 자동 샘플러 플레이트, 6 전체 90 μL 팁 박스, 빈 90 μL 팁 박스 및 전체 230 μL 팁 상자를 포함하여 지정된 그림과 그림(그림 8)에따라 자동화 된 액체 처리기의 데크를 배치합니다.
- 완료를 클릭하여 메서드를 시작합니다.
참고: 완료를클릭하면 사용자가 자동 액체 처리기에 연결할 수 없습니다. 이것은 기계의 '라이트 커튼을 깨고'안전 예방 조치로 액체 처리기를 중지합니다. - 원심분리 프롬프트 후 계속에서 반응 판을 검색하고 3,000 rpm에서 30 분 동안 원심 분리합니다.
- 원심분리가 완료된 후 반응 플레이트를 자동 액체 핸들러로 되돌리고 원심분리 전의 위치로 되돌리고 계속을 클릭합니다.
참고: 메서드가 완료되면 자동 액체 처리기가 다시 중지됩니다. 사용자가 6단계에 'true'를 입력한 경우 자동 샘플러 플레이트를 워크스테이션에서 제거하고 분석을 위해 액체 크로마토그래피 기기의 자동 샘플러에 넣을 수 있습니다.
4. LC-MSMS
- 0.25 mL/min의 유량으로 C18 2.1 mm x 100 mm, 3.5 μm 컬럼으로 구성된 고유량 HPLC에서 펩티드를 해결하고 삼중 사중극자 질량 분석계에서 인라인을 분석하였다.
참고: 펩티드 소화 후, 로봇 제조 샘플로부터 펩티드를 정량화하는 표적 LC-MSMS 방법은 LC-MSMS에 대한 간략한 설명에 따라 상세히1에 기술된다. - 컬럼 오븐 온도를 40°C로 설정합니다. 완충제 A (2 % ACN, 98 % 물, 0.1 % 포산) 및 버퍼 B (95 % ACN, 5 % 물, 0.1 % 포르믹 산)를 두 가지 이동상으로 사용하십시오.
- 로딩 후 5분 동안 5% B로 열을 평형화합니다. 완충B의 선형 5% ~ 35% 구배를 가진 30분 이상 펩티드를 용해시다.
- 다음 샘플을 10분 동안 98% B로 세척한 다음 5분 동안 5% B로 세척하여 다음 샘플을 적재하기 전에 컬럼을 재활용합니다.
- 온라인 전환을 위해 2상 스위칭 밸브를 사용하여 이온 소스에 들어가기 전에 포스트 컬럼 용리온을 낭비로 전환하십시오.
- MRM 데이터를 처리합니다.
Representative Results
자동화된 워크스테이션에서 자동화된 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우를 알부민, 선택된 혈장 단백질 및 품질 관리에 사용되는 외인성 단백질인 β-galactosidase(β-gal)에 대한 강력한 LC-SRM-MS 수집 방법1을 사용하여 이전의 자동화된 프로토콜에서 적응했습니다. 처리 후, 샘플을 SRM 분석에서 삼중 사중극자 LC-MS에서 실행하였고, 혈청 알부민, β-갈락토시다아제. 각 전이에 대한 SRM 신호의 변이계(CV)를 사용하여 자동화된 소화 프로토콜의 재현성을 모니터링하였다.
우리는 2 시간 온 데크 인큐베이터 트립신 인큐베이션으로 5 μL 플라즈마 샘플의 소화를위한 시약 첨가 및 혼합 단계를 자동화했습니다. 재현성을 결정하기 위해, 플라즈마 풀의 5 μL을 멀티채널 헤드(96 핀)로 반응 플레이트의 여러 웰로 피펫팅하였다. 일관성을 모니터링하기 위해, 우리는 감소 및 알킬화 반응 전에 β-gal 단백질을 첨가했습니다. 자동화된 프로테오믹스 시료 준비 워크플로우를 품질 관리에 사용되는 알부민, 가장 풍부한 혈장 단백질 및 β-gal 단백질을 포함한 견고한 LC-SRM-MS 수집 방법으로 테스트했습니다. 3개의 β-gal 펩티드 및 2개의 알부민 펩티드를 처리된 혈장 알부민 단백질 및 스파이크β-gal 단백질로부터 모니터링하였다(표4).
시간을 절약하고 절차를 단순화하기 위해 워크스테이션과 시약 및 반응 혼합물을 추가/혼합/인큐베이션하는 액체 이송 단계를 9단계 워크플로우에서 6단계 워크플로우로 줄였습니다(그림1). 전체 프로테오믹 워크플로우는 자동 시료 전처리 및 LC-MS/MS의 두 가지 실험 구성 요소로 구성되었으며, 먼저 자동 샘플러 플레이트의 동일한 소화 웰에서 8회 연속 주사로 LC-MS/MS SRM 데이터 수집의 정밀도를 평가했습니다. 자동화된 시료 전처리 워크플로우의 정밀도는 LC-MS/MS의 총 프로테오믹 SRM 워크플로우의 분산 계수(%CV)에서 LC-MS/MS의 %CV를 뺀 백분율로 계산되었습니다(그림9B). 자동화된 워크스테이션에서 간소화된 혈장 소화 절차로, 자동화된 시료 제제의 실험 정밀도는 외인성 스파이크 β-gal 단백질(평균 10.0%)에 대해 11.4% 미만이었고, 가장 풍부한 인간 혈청 알부민(평균 9.9%)의 경우 14.9% 미만이었다(도9). 예상대로 인간 혈청 알부민 및 β-gal 단백질 모두에 대해 양호한 신호 강도가 관찰되었다(도9C).
각 파이펫팅 및 액체 이송 공정에 대해 기술이 특별히 최적화되었습니다. 액체 전달 단계의 정밀도를 모니터링하기 위해, 우리는 내인성 인간 혈청 알부민 단백질과 외인성 β-gal 단백질에 대한 안정적인 동위원소 표지 (SIL) 펩타이드 표준을 3 개의 독립적 인 시약 전달 단계로 스파이크했습니다: 반응 혼합 1, 시스테인 차단제 및 반응 혼합 2(그림 10). 이 5개의 SIL 펩티드로부터의 MRM 신호는 자동화된 액체 전달 단계의 정밀도를 모니터링하기 위해 획득되었다. 반응 혼합 1 단계에서 펩티드, DDNPNLPR^및 GDFQFNISR^(^는 N15 표지된 아미노산을 나타낸다)에 대한 평균 %CV는 1.8%에서 11.2%까지 다양하였다. 시스테인 차단기 단계로부터의 1개의 펩티드(IDPNAWVER^)의 평균 %CV는 6.6~8.8%였다. 2개의 펩티드(WVGYGQDSR^및 LVNEVTEFAK^)의 평균 %CV는 6.2%에서 11.9%까지 다양하였다(그림10).
자동화된 프로테오믹스 시료 준비 워크플로우를 검증하기 위해, 우리는 인간 혈청 알부민, 외인성 β-gal 및 40개의 추가 혈장 단백질에 대해 여러 단백질과 여러 날에 걸쳐 재현성을 평가했습니다. 우리는 21개의 복제 샘플(풀린 정상 인간 플라즈마)을 처리하되, 그림 11A에도시된 위치가 3일 동안 잘 나타났다. 당일 준비된 21개의 우물에서 장중 이력서를 계산했습니다. 40개의 단백질에 대한 평균 일중 %CV는 4% - 20%(그림11B)에서원거리였다. 플레이트 기반 자동화 워크플로우의 에지 효과를 평가하기 위해 %CV는 지정된 열 및 행 내의 특정 웰에서 계산되었습니다(열 및 행 맵에 대한그림 12A). MRM 신호 강도는 3%에서 22%(그림12B)에이르는 %CV를 가진 모든 컬럼 및 행 구성에서 유사하였다.
요약하자면, 최적화된 자동화 된 워크플로우로 우수한 실험 정밀도로 5시간 이내에 96개의 균일하게 처리된 샘플을 얻을 수 있습니다. 자동화된 워크플로우와의 호환성을 위해 무시할 수 있는 비특이적 측면 반응이 있고, 주변 광원에서 안정적이며, LC-MS/MS 친화적이며, 냉동 aliquot로 저장할 수 있는 시약을 선택했습니다.
그림 1: 샘플 준비 워크플로우 스키마. 주요 6 개의 액체 이송 단계가 나열되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 팁 로드 스크립트. VB 스크립트 세부 정보는 여기에 나와 있습니다. 스크립트는 팁 로드 조건을 지정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 자동화된 워크스테이션 데크 레이아웃. 데크는 1x1 ALP, 팁 로딩 LP, 휴지통, 팁 워시, 펠티에 및 인큐베이터로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 시약 플레이트의 특성. 표시된 속성은 가이드 랩웨어 설정을 사용하여 액세스할 때 시약 플레이트 랩웨어에 필요한 속성입니다. 그림에 표시된 대로 해당 열을 선택하고 변수를 입력합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 팁 계산 스크립트입니다. 이 스크립트는 데크에서 팁의 수를 추적하는 데 도움이됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 플라즈마 샘플을 소화하고 알리인용하는 방법의 개요. 액체 처리기의 방법에서 시약 계산, 실험실 제품 설정 및 액체 조작을 위한 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 시약 플레이트의 레이아웃. 도시된 것은 플라즈마 소화 및 자동 샘플러 준비에 필요한 화학 시약이며 시약 플레이트 실험실용품전반에 분포되어 있다. 이 수치는 기술 노트10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 자동화된 워크스테이션 데크의 랩웨어용 레이아웃입니다. 도시된 것은 액체 처리기에 대한 플라즈마 소화 방법에 대한 데크 레이아웃이다. 이 수치는 기술 노트10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 전체 프로테오믹 워크플로우의 정밀도는 워크스테이션 CV와 타겟 LC MS/MS CV로 구성됩니다.
β-gal 및 알부민으로부터의 5개의 펩타이드를 모니터링하였고, 각 펩티드에 대한 크로마토그램 및 펩타이드 보유 시간이도시된(A),정밀도는 30웰/시료 처리 대표 실험으로부터 결정되었고, 총 프로테오믹 워크플로우에 대한 CV%, LC MS/MS 분석 및 자동 시료처리(B)를계산하였다. 전반적으로, 소화된 펩타이드는 1x105에서 1x108까지의양호한 신호를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 액체 이송 단계에 대한 정밀도 측정. 합성 펩타이드는 단계별 시약에서 스파이크되었고, 자동화된 액체 전달은 총%CV에 의해 결정되었다. 30개의 웰/샘플 실험에서 CV LC MSMS를 뺀 값(8회 반복 LC MSMS 주사로 결정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 42개의 단백질 MRM 분석을 통해 자동화된 단백질 샘플 준비 워크플로우의 수일 재현성. (a)3일간의 반응 플레이트 맵이 여기에 표시되고, 5 μL 플라즈마를 각각 21개의 웰에 첨가하였다. 3 개의 웰을 받은 5 ul 물 음의 / 빈 컨트롤로 사용되었다. (b)190개의 전이의 평균 강도는 75개의 펩티드 및 42개의 단백질(왼쪽) 및 각 MRM 전이에 대한 %CV로 구성되며, 각 MRM 전이에 대해 21웰 소화(오른쪽)로부터 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: 우물의 특정 위치(열 및 행의 위치)의 재현성. (A)플레이트 맵이 있는 열 및 행 위치가 여기에 표시됩니다. (B)단일 플레이트 소화로부터 지정된 웰(왼쪽) 및 cv%(오른쪽)의 평균 강도의 열 및 행 위치 별 MRM 신호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 13: 테크닉 편집기의 스크린샷. 각 파이펫팅 템플릿에 대해 액체 레벨 감지, 응고 감지, 피어싱, 액체 유형, 일반, 흡기, 디스펜스, 혼합 및 교정의 특성을 정의합니다. 이 프로토콜에 사용되는 템플릿 및 기술은 보충 표 2)에도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 변수 | 변수 | 값 | 설명 |
| 자동 샘플러 | 부울 | 사실 | 자동 샘플러 사용 |
| 베타갈 (있는) | 정수 | 5 | 베타갈 볼륨 |
| BG1 | 정수 | 0.8 | BG1 볼륨 |
| BG2 | 정수 | 0.8 | BG2 볼륨 |
| BG3 | 정수 | 0.8 | BG3 볼륨 |
| 시스테인 차단기 | 정수 | 1.25 | 시스테인 차단제 볼륨 |
| 시스테인 버퍼 | 정수 | 0.45 | 시스테인 버퍼 볼륨 |
| 데나투란트 (것)에 대한 | 정수 | 5 | 부정 볼륨 |
| 다이제스트 트랜스퍼 | 정수 | 10 | 다이제스트 전송 볼륨 |
| 첫 번째 버퍼 | 정수 | 25.9 | 첫 번째 버퍼 볼륨 |
| 첫 번째 열 | 정수 | 1 | 첫 번째 열 |
| HSA1 | 정수 | 0.8 | HSA1 볼륨 |
| HSA2 | 정수 | 0.8 | HSA2 볼륨 |
| 마지막 열 | 정수 | 12 | 마지막 열 |
| 페이즈 페이즈 | 정수 | 90 | 모바일 위상 볼륨 |
| 담금질 | 정수 | 10 | 담금질 열 |
| 환원 에이전트 | 정수 | 5 | 에이전트 열 줄이기 |
| 샘플 | 정수 | 5 | 샘플 열 |
| 샘플 플레이트 | 부울 | 사실 | 샘플 플레이트 사용 |
| 세컨드 버퍼 | 정수 | 58.4 | 두 번째 버퍼 볼륨 |
| 트립신 (것)과 같은 | 정수 | 10 | 트립신 열 |
표 1: 시작 단계 변수
| 값 | 변수 |
| =퍼스트 버퍼+데나투란트+환원에이전트+베타갈+BG1+HSA1 | 퍼스트 믹스 |
| =시스테인 차단기 +시스테인 버퍼 + BG2 | 시스테인 믹스 |
| =세컨드 버퍼+BG3+HSA2 | 세컨드 믹스 |
| =(첫 번째 믹스*열)+30 | 퍼스트믹스웰 |
| = (시스테인믹스*컬럼)+20 | 시스테인웰 |
| =(두 번째 믹스*열)+10 | 세컨드믹스웰 |
| =(트립신*컬럼)+10 | 트립신웰 |
| =(담금질*열)+10 | 담금질웰 |
| =(퍼스트믹스웰*8)+100 | 퍼스트믹스스톡 |
| =시스테인웰*8+20 | 시스테인믹스스톡 |
| =(세컨드믹스웰*8)+100 | 세컨드믹스스톡 |
표 2: 볼륨 혼합 변수
| 형식 | 이름 | 위치 | 깊이 | 속성 | 사용? |
| BCDeep96Round | 시약 플레이트 | P5 | 1(맨 위) | # | =샘플 플레이트 아님 |
| BCDeep96Round | 시약 플레이트 | P5 | 1(맨 위) | # | =샘플 플레이트 |
| BCDeep96Round | 반응 플레이트 | P11 | 1(맨 위) | 사실 | |
| Bio_RadPCR96* | 샘플 | P9 | 1(맨 위) | =샘플 플레이트 | |
| Bio_RadPCR96* | 자동 샘플러 플레이트 | P10 | 1(맨 위) | =자동 샘플러 | |
| BC90 | 빈 | 1(맨 위) | 사실 | ||
| BC90 | 1(맨 위) | 사실 | |||
| BC90 | 1(맨 위) | 사실 | |||
| BC230 | 1(맨 위) | =자동 샘플러 | |||
| BC90 | 1(맨 위) | =열>1 | |||
| BC90 | 1(맨 위) | =열>3 | |||
| BC90 | 1(맨 위) | =열>5 | |||
| BC90 | 1(맨 위) | =열>7 | |||
| BC90 | 1(맨 위) | =열>9 | |||
| 참고: *: 96웰 바이오라드 플레이트에 해당합니다. #: 속성을 클릭한 다음 그림 6에 표시된 볼륨 변수를 입력합니다. |
|||||
표 3: 안내식 설정 설정
| 단백질 ID | 펩타이드 서열 | Q1 질량 (다) | Q3 질량 (다) | 시간(최소) | 조각 이온 | 클러스터링 잠재력 | 충돌 에너지 | 충돌 셀 출구 전위 |
| sp | P00722 | BGAL_ELOCI | GDFFNISR | 542.3 | 262.1 | 19.7 | +2y2 | 61 | 21 | 8 |
| 542.3 | 636 | 19.7 | +2y5 | 61 | 25 | 12 | ||
| 542.3 | 764.2 | 19.7 | +2y6 | 61 | 25 | 18 | ||
| IDPNAWVER | 550.3 | 436.1 | 18.1 | +2y7+2 | 61 | 23 | 8 | |
| 550.3 | 871.2 | 18.1 | +2y7 | 61 | 25 | 18 | ||
| 550.3 | 774.2 | 18.1 | +2y6 | 61 | 33 | 8 | ||
| VVGYGQDSR | 534.3 | 782.1 | 12.1 | +2y7 | 51 | 25 | 6 | |
| 534.3 | 562.1 | 12.1 | +2y5 | 51 | 27 | 6 | ||
| 534.2 | 505.2 | 12.1 | +2y4 | 90 | 25 | 8 | ||
| sp | P02768 | ALBU_HUMAN | DDNPNLPR | 470.8 | 596.2 | 9.2 | +2y5 | 61 | 27 | 16 |
| 470.8 | 499.3 | 9.2 | +2y4 | 61 | 27 | 18 | ||
| 470.8 | 710.4 | 9.2 | +2y6 | 61 | 27 | 18 | ||
| LVNEVTEFAK | 575.3 | 694.4 | 18.2 | +2y6 | 73.1 | 29.6 | 18 | |
| 575.3 | 937.5 | 18.2 | +2y8 | 73.1 | 29.6 | 18 | ||
| 575.3 | 823.4 | 18.2 | +2y7 | 73.1 | 29.6 | 18 |
표 4: MRM 매개 변수
보충 표 1: 시약 플레이트는 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 프로토콜 템플릿은 여기를 클릭하여 이 표를 다운로드하십시오.
Discussion
질량 분석에 대한 샘플 처리는 단백질 변성, 감소 및 시스테인을 차단하기 위해 알킬화를 필요로하며, 펩티드로 단백질을 절단하는 트립신 소화. 각 화학 적 또는 효소 반응은 지정된 시간에 시작되고 제어 된 온도에서 수행되어야하며, 공정의 모든 단계는 실험 적 변화가 도입 될 수있는 여러 액체 전달 단계를 포함합니다. 자동화된 샘플 처리는 이러한 딜레마에 대한 해결책을 제공합니다. 현재 사용 가능한 액체 처리 시스템은 사용되는 헤드 및 팁 유형에 따라 5% 미만의 정확도와 정밀도로 시약을 96웰 플레이트로 이송하고, 원하는 경우 14°C에서 70°C에 이르는 제어된 온도하에서 원하는 경우 흔들림으로 샘플을 배양할 수 있습니다. 우리는 자동화된 액체 핸들러를 사용하여 96웰 형식으로 SRM 어세이에 대한 플라즈마를 처리했습니다.
혈청, 혈장 및 기타 생물학적 샘플에서 단백질의 복잡한 혼합물 내에서 프로테아제 절단 부위의 수천이있다; 그리고 이들 단백질의 각각은 분열 부위 접근성 및 생성된 펩티드의 안정성에 영향을 미치는 독특한 특성을 갖는다. 따라서 모든 단백질에 최적인 시료 처리 절차를 설계하는 것은 불가능합니다. 가장 좋은 대안은 가능한 한 일관성을 가지는 것입니다.
일관성을 달성하기 위해 자동화된 액체 처리기가 수행하는 각 파이펫팅 단계를 최적화했습니다. 우리는 먼저 액체의 유형 (플라즈마, 수성 또는 유기) 및 해당 특성 (점도, 응집력 및 변동성), 하드웨어 (워크 스테이션 파이펫 팅 헤드 및 플레이트 잡기 팔) 및 실험실용품에 의해 부과 된 부피와 제약 조건을 고려했습니다. 그런 다음 포부, 디스펜싱을 위한 속도 및 후행 공기 갭, 분배의 속도 및 송풍 량, 혼합의 힘과 지속 시간을 변화시켰으며, 필요한 경우 팁 의 외부에 액체 가재를 제거하기 위해 포부 및 /또는 디스펜싱 후 팁 터치를 통합했습니다(그림 13, 보충 표 1). 안정성을 위해 사전 스크리드된 고유한 SIL 펩타이드를 각 시약에 스파이크하여 각 액체 처리 단계의 정밀도를 모니터링할 수 있습니다. 최적화 후, 대부분의 전환에 대한 프로세스 CV는 10% 미만이었으며, 자동화된 워크스테이션으로 좋은 재현성을 입증하였다(그림9, 그림 10, 그림 11 및 그림 12).
여기에 제시된 자동화된 워크플로는 수동 방법에 비해 향상된 재현성과 처리량으로 일관된 효소 소화를제공합니다(그림 9, 그림 10). 이 접근법은 질량 분석법에 의한 바이오마커 발견 및 검증의 정확성과 신뢰성을 개선할 것을 약속합니다.
Disclosures
없음.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A Pooled healthy human plasma | Bioreclamation Inc. | human plasma tested in the manuscript | |
| Acetonitrile, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | A998SK1 | LC MS/MS solvent |
| B-Galactosidase Recombinant from E.Coli | Sigma-Aldrich | G3153-5MG | exogenous control proteins. |
| Biomek i7 Automated Workstation | Beckman Coulter, Inc. | The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions | |
| Biomek i-Series Tips 230µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85903 | Tips, i7 consumable |
| Biomek i-Series Tips 90µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85881 | Tips, i7 consumable |
| FG, Kit Trypsin TPCK | Sciex | 4445250 | Trypsin used in digestion |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | #hsp9641 | Autosampler plate |
| Octyl B-D-Glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O9882-5G | detergent used in digestion |
| Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile | Beckman Coulter, Inc. | 267007 | Reagent and digestion plate |
| Prominence UFLCXR HPLC system | Shimadzu, Japan | High flow LC sytem | |
| QTRAP 6500 | SCIEX | Mass spectrometer | |
| Water, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | W54 | LC MS/MS solvent |
| Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm | Waters | 186003564 | LC MSMS column |
References
- Fu, Q., et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Lehmann, S., et al. Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold? Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Yates, J. R. 3rd Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).
- Nilsson, T., et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).
- Van Eyk, J. E., Sobhani, K.
- Hoofnagle, A. N., et al. Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays. Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).
- Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series. Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).
