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Biochemistry

Una preparación de muestra de plasma para espectrometría de masas utilizando una estación de trabajo automatizada

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/59842
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Advanced Clinical Biosystems Institute, Smidt Heart institute, Cedars Sinai Medical Center, 2Beckman Coulter Life Sciences

Summary

Aquí, presentamos un método automatizado de digestión de proteínas plasmáticas para el análisis proteómico cuantitativo basado en espectrometría de masas. En este protocolo, se simplifican y automatizan los pasos de transferencia e incubación de líquidos para la desnaturalización de proteínas, reducción, alquilación y digestión de trippsina. Se tarda aproximadamente cinco horas en preparar una placa de 96 pocillos con la precisión deseada.

Abstract

La preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas en proteómica requiere escisión enzimática de proteínas en una mezcla de péptidos. Este proceso implica numerosas etapas de incubación y transferencia de líquidos con el fin de lograr la desnaturalización, reducción, alquilación y escisión. La adaptación de este flujo de trabajo a una estación de trabajo automatizada puede aumentar la eficiencia y reducir los coeficientes de varianza, proporcionando así datos más fiables para las comparaciones estadísticas entre tipos de muestra. Anteriormente describimos un flujo de trabajo automatizado de preparación de muestras proteómicas1. Aquí, informamos del desarrollo de un flujo de trabajo más eficiente y mejor controlado con las siguientes ventajas: 1) El número de pasos de transferencia de líquido se reduce de nueve a seis mediante la combinación de reactivos; 2) El tiempo de pipeteo se reduce mediante pipeteo selectivo de punta utilizando un cabezal de pipeteo de 96 posiciones con múltiples canales; 3) El rendimiento potencial se incrementa por la disponibilidad de hasta 45 posiciones de cubierta; 4) La carcasa completa del sistema proporciona un mejor control de la temperatura y del medio ambiente y reduce el potencial de contaminación de muestras o reactivos; y 5) La adición de isótopos estables etiquetados como péptidos, así como proteína de galactosidasa, a cada muestra hace posible el monitoreo y control de calidad a lo largo de todo el proceso. Estas mejoras en el hardware y los procesos proporcionan una buena reproducibilidad y mejoran la precisión del análisis e interensayo (CV de menos del 20%) para la cuantificación de proteínas y péptidos basada en LC-MS. Todo el flujo de trabajo para digerir 96 muestras en una placa de 96 pocillos se puede completar en aproximadamente 5 horas.

Introduction

La cuantificación de proteínas y péptidos basada en espectrometría de masas (MS) se está aplicando cada vez más como herramienta bioanalítica para el análisis plasmático en laboratorios clínicos y de investigación básica2,,3. La instrumentación e informática necesarias han avanzado rápidamente a medida que la EP se ha convertido en el método de elección para cuantificar proteínas o proteínas modificadas mediante secuencias de péptidos específicos debido a su capacidad para cuantificar cientos de péptidos en una sola MS run4. La preparación de muestras sirve como base para cualquier análisis proteómico. Antes del análisis de la EM, las proteínas de una muestra biológica suelen desnaturalizarse, reducirse, alquilarse, digerirse en péptidos trípticos y desalar5.5 La alquilación bloquea las cisteínas para evitar modificaciones incontroladas y garantizar que todas las cisteínas tengan la misma masa. A continuación, la trippsina se añade para digerir las proteínas en péptidos. Cada uno de estos pasos requiere optimización, y todo el proceso se realiza tradicionalmente manualmente, lo que permite la introducción de errores analíticos.

La canalización de desarrollo de biomarcadores tradicional consta de dos procesos principales: proteómica de escopeta para el descubrimiento global de proteínas para crear un inventario de proteínas en profundidad6 y proteómica dirigida para la verificación y validación dirigida a la cuantificación de proteínas de alta precisión y alto rendimiento7. Independientemente del enfoque de la EM, la preparación de la muestra es la misma y se centra en la escisión enzimática de proteínas en una mezcla de péptidos. Como proponeN Van Eyk y Sobhani8,se desea contar con un método que permita un análisis preciso, preciso y reproducible tanto para el descubrimiento como para ensayos dirigidos para mover eficazmente biomarcadores de descubrimiento a ensayos clínicos implementados. Para ello, la automatización de la preparación de muestras será útil y proporcionará la capacidad de aumentar la eficiencia al análisis de alto rendimiento. Los métodos manuales suelen introducir errores analíticos más allá de los límites aceptables especificados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en la Guía de validación de métodos bioanalíticos revisada, que incluye biomarcadores y diagnósticos2,,9. El desarrollo de un flujo de trabajo de preparación de muestras de proteínas de MS rápido, altamente preciso y manos libres será necesario para facilitar la investigación de biomarcadores, lo que requiere preparar y analizar miles de muestras biológicas. La preparación de la muestra de MS tiene muchos pasos en los que se pueden introducir errores y el proceso es tedioso y requiere mucho tiempo.

En nuestro método mejorado, se programó una estación de trabajo automatizada para realizar todos los procedimientos de preparación de muestras de plasma necesarios en un total de 6 pasos(Figura 1) para garantizar: 1) transferencias de líquidos precisas; 2) la reacción se inicia y se detiene en un momento constante; 3) la reacción se realiza a temperatura controlada (es decir, incubadora); y 4) la reacción tiene una mezcla uniforme para todas las reacciones. También implementamos la adición de proteínas de control de calidad exógenas y estándares internos (estándares estables de péptidos etiquetados con isótopos) para garantizar una calidad y un rendimiento reproducible de la cuantificación de proteínas y péptidos basada en LC-MS en un formato de 96 polos. Incluyendo la preparación de reactivos, horas de tiempo de trabajo y un total de 1.000.000 pasos de pipeteo sería necesario para procesar 96 muestras en tubos individuales. La automatización reduce el tiempo práctico y el número de interacciones humanas implicadas.

Protocol

1. Programación para el manipulador automatizado de líquidos

  1. Crear un nuevo método a partir del menú Archivo (Archivo ? Nuevo método)
    NOTA: Complete los pasos en el orden indicado. La fuente en cursiva denota texto para escribir en el software Biomek. Póngase en contacto con los autores para obtener información sobre las técnicas y plantillas de pipeteo.
  2. Escriba Las variables de paso de inicio y sus valores en el paso de inicio como se muestra en la tabla 1.
  3. Establezca columnas para pipeteo de punta selectiva. Para los pasos 1.3-1.7, haga clic en el paso Establecer global en la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método.
    1. Mediante el paso Establecer global, establezca el valor "FirstColumn" en la variable FirstColumn_Global, el valor "LastColumn" en lavariable LastColumn_Global , el valor "LastColumn-FirstColumn+1" en la variable Columnsy el valor "Columns*8" en la variable Wells.
    2. Seleccione el paso Script en la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Escriba el script VB como se indica en la Figura 2.
  4. Configuración de volúmenes para mezclas Set Global y soluciones.
    1. Mediante el paso Establecer global, establezca los valores correspondientes en las variables de mezcla de volumen como se muestra en la Tabla 2.
    2. Haga clic en el paso If de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. En condiciones, escriba Autosampler.
    3. En A continuación, haga clic en el paso Establecer global de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método.
    4. Mediante el paso Establecer global, establezca el valor .(MobilePhase*Columns)+10 en la variable MobilePhaseWell.
    5. En Else, haga clic en el paso Establecer global de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método.
    6. Mediante el paso Establecer global, establezca el valor .0 en la variable MobilePhaseWell
  5. Configuración de la configuración guiada de Labware (GLS)
    1. Haga clic en el paso Editor de mazos de la barra de herramientas en Utilidades. Crea un mazo nuevo que se corresponda con el diseño del mazo en la Figura 3 y etiquétalo como Deck 1.
    2. Haga clic en el paso Configuración guiada de la barra de herramientas en Configuración y dispositivos y arrástrelo al método. Arrastre y suelte los tipos de material de laboratorio en las posiciones de la cubierta como se indica en el Cuadro 3. A partir de entonces, rellene las pestañas de la tabla como se muestra en la Tabla 3 y la Figura 4 (Configuración de la configuración guiada).
  6. Configuración del procedimiento para el recuento de propinas
    1. Haga clic en el paso Definir procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Name procedure as TipCount.
    2. Haga clic en el paso Script de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Escriba el script VB como se indica en la Figura 5 (secuencia de comandos de recuento de sugerencias).
    3. Haga clic en el paso If de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método.
    4. En las condiciones, escriba TL5 a 0.
    5. En A continuación, haga clic en el paso Mover Labware de la barra de herramientas en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Mueva labware de TL5 a TR3. Haga clic en el paso Move Labware de la barra de herramientas, en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Mueva labware de TL2 a TL5. Por último, haga clic en el paso Move Labware de la barra de herramientas en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Mueva labware de BC90 a TL2.
  7. Definir el procedimiento para la incubadora
    1. Haga clic en el paso Definir procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Procedimiento de nombre como Incubadora.
    2. Escriba HalfTime como Nombre de variable y 1800 como Valor predeterminado.
    3. Escriba NextTemp como Nombre de variable y 22 como Valor predeterminado.
    4. Escriba temp como Nombre de variable y 60 como Valor predeterminado.
    5. Haga clic en el paso Enhanced Move Labware de la barra de herramientas en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Mueva el material de laboratorio de P11 a INHECO1.
    6. Haga clic en el paso Ejecutar procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Procedimiento de nombre como TipCount.
    7. Haga clic en el paso Incubar inHECO de la barra de herramientas en Integraciones y arrástrelo al método. Escriba INHECO1 para utilizar el dispositivo en la posición, "Medio tiempo para Incubar" para, Temp para "C" y 3 para el "C" de la temperatura objetivo. Seleccione la opción Agitar durante la incubación y el estilo de agitación Orbital (en el sentido de las agujas del reloj). Para la configuración, escriba 1,00 mm de lado a lado, 6,6 veces por segundo, 1,00 mm hacia delante y 6,6 veces por segundo.
      NOTA: Asegúrese de que el software INHECO Incubator esté instalado.
    8. Haga clic en el paso Incubar inHECO de la barra de herramientas en Integraciones y arrástrelo al método. Escriba INHECO1 para utilizar el dispositivo en la posición, "Medio tiempo para Incubar" para, Temp para "C" y 3 para el "C" de la temperatura objetivo. Seleccione la opción Agitar durante la incubación y el estilo de agitación Orbital (en sentido antihorario). Para los ajustes, escriba 1,00 mm de lado a lado, 6,6 veces por segundo, 1,00 mm hacia delante y hacia atrás a 6,6 veces por segundo.
    9. Haga clic en el paso Pausa de la barra de herramientas en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Pausa todo el sistema durante 1 s.
    10. Haga clic en el paso Definir procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Procedimiento de nombre como Incubadora.
    11. Haga clic en el paso Incubar inHECO de la barra de herramientas en Integraciones y arrástrelo al método. Escriba INHECO1 para utilizar el dispositivo en la posición, 1 para Incubar for, .NextTemp para .C y 3 para el c de la temperatura objetivo.
  8. Definir el procedimiento para Orbital.
    1. Haga clic en el paso Enhanced Move Labware de la barra de herramientas en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Mueva labware de P11 a Orbital1.
    2. Haga clic en el paso Ejecutar procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Seleccione el procedimiento TipCount.
    3. Haga clic en el paso Acción del dispositivo de la barra de herramientas en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Seleccione Device OritalShaker0, Command TimedShake. Ingrese la velocidad de agitación 1000, Tiempo para alcanzar la velocidad completa 2, Tiempo para agitar 30.
    4. Haga clic en el paso Enhanced Move Labware de la barra de herramientas en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Mueva labware Orbital1 a P11.
  9. Configuración de la primera mezcla
    1. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencia de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método. Seleccione reorganizar la posición TL4.
    2. Haga clic en el paso Incubar inHECO de la barra de herramientas en Integraciones y arrástrelo al método. Escriba INHECO1 para utilizar el dispositivo en la posición, 1 para Incubar for, 60 para c y 3 para la temperatura objetivo.
    3. Haga clic en el paso Bucle de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método, en el paso Seleccionar sugerencia. Escriba col como variable .FirstColumn como Start, .LastColumn como End y 1 como Increment.
    4. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de carga de sugerencias en la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del paso de bucle. Seleccione las puntas BC90, la ubicación del TL5 y la ubicación de las puntas de la copia de seguridad del TL2 de la ubicación del menú desplegable. Seleccione Columna(s) única(s) y escriba 1.
    5. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de aspirar en la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del paso de bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type y Reagent Plate Position. Escriba el volumen "FirstMix", Aspirar en la columna 1 y la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    6. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias dispense de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del paso de bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type y Reagent Plate Position. Escriba el volumen "FirstMix",dispensar en la columna "col" y en la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    7. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de descarga de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del paso de bucle. Seleccione Descargar sugerencias en TR1.
  10. Configuración de las muestras
    1. Haga clic en el paso If de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Escriba SamplePlate como condición.
    2. En A continuación, haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de carga de sugerencias de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método. Seleccione las puntas BC90, la ubicación del TL5 y la ubicación de las puntas de la copia de seguridad del TL2 de la ubicación del menú desplegable. Seleccione Columna(s) única(s) y escriba .tipcolumns.
    3. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de aspirar en la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro de entonces. Seleccione Greiner96RoundPS Labware Type y Samples Position. Escriba el volumen "Muestra",Aspirar en la columna "FirstColumn" y en la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    4. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de dispensación en la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro de entonces. Seleccione BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Escriba el volumen "Muestra",dispensar en la columna " FirstColumn" y la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    5. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de descarga de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro de ese momento. Seleccione Descargar sugerencias en TR1.
    6. Después del final del paso If, haga clic en el paso Ejecutar procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Seleccione el procedimiento Incubadora. Escriba HalfTime como Nombre de variable y 1800 como Valor predeterminado. Escriba NextTemp como Nombre de variable y 22 como Valor predeterminado. Escriba temp como Nombre de variable y 60 como Valor predeterminado.
  11. Creación del bloque de cisteína
    1. Haga clic en el paso Bucle de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método, en Seleccionar paso de sugerencia. Escriba col como variable .FirstColumn como Start, .LastColumn como End y 1 como Increment.
    2. En Bucle, haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de carga de sugerencias de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método. Seleccione las puntas BC90, la ubicación del TL5 y la ubicación de las puntas de la copia de seguridad del TL2 de la ubicación del menú desplegable. Seleccione Columna(s) única(s) y escriba 1.
    3. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias aspirar de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type y Reagent Plate Position. Escriba el volumen "CysteineMix", aspirar en la columna 2 y en la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    4. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias dispense de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Escriba el volumen : CysteineMix, dispensar en la columna - col y fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    5. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de descarga de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro de ese momento. Seleccione Descargar sugerencias en TR1.
    6. Después del final del bucle If, haga clic en el paso Ejecutar procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Seleccione el procedimiento Incubadora. Escriba HalfTime como Nombre de variable y 300 como Valor predeterminado. Escriba NextTemp como Nombre de variable y 43 como Valor predeterminado. Escriba temp como Nombre de variable y 25 como Valor predeterminado.
  12. Configuración de la segunda mezcla
    1. Haga clic en el paso Bucle de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método, en Seleccionar paso de sugerencia. Escriba col como variable .FirstColumn como Start, .LastColumn como End y 1 como Increment.
    2. En bucle, haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de carga de sugerencias de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método. Seleccione las puntas BC90, la ubicación del TL5 y la ubicación de las puntas de la copia de seguridad del TL2 de la ubicación del menú desplegable. Seleccione Columna(s) única(s) y escriba 1.
    3. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias aspirar de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type y Reagent Plate Position. Escriba el volumen "SecondMix", Aspirar en la columna 3 y la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    4. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias dispense de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Escriba el volumen : SecondMix, Dispense en la columna - col y fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    5. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de descarga de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro de ese momento. Seleccione Descargar sugerencias en TR1.
    6. Después del final del bucle If the, haga clic en el paso Ejecutar procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Seleccione el procedimiento Orbital.
    7. Haga clic en el paso Pausa de la barra de herramientas en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Pausa todo el sistema durante 1 s.
  13. Configuración de la adición de Trypsin
    1. Haga clic en el paso Bucle de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método, en Seleccionar paso de sugerencia. Escriba col como variable .FirstColumn como Start, .LastColumn como End y 1 como Increment.
    2. En Bucle, haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de carga de sugerencias de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método. Seleccione las sugerencias BC90, la ubicación del TL5, y la ubicación de las puntas de la copia de seguridad TL2 del menú desplegable. Seleccione Columna(s) única(s) y escriba 1.
    3. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias aspirar de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type y Reagent Plate Position. Escriba el volumen "Trypsin", Aspirate en la columna 4 y la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    4. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias dispense de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método dentro del bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Escriba el volumen "Trypsin", Dispense en la columna "col" y la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    5. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de descarga de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro de ese momento. Seleccione Descargar sugerencias en TR1.
    6. Después del final del bucle If, haga clic en el paso Ejecutar procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Seleccione el procedimiento Incubadora. Escriba HalfTime como Nombre de variable y 3600 como Valor predeterminado. Escriba NextTemp como Nombre de variable y 25 como Valor predeterminado. Escriba temp como Nombre de variable y 43 como Valor predeterminado.
    7. Haga clic en el paso Incubar inHECO de la barra de herramientas en Integraciones y arrástrelo al método. Asegúrese de que el software INHECO Incubator esté instalado. Escriba INHECO1 para utilizar el dispositivo en la posición, 1 para Incubar for, 25 para oC y 5 para c de temperatura objetivo.
  14. Configuración del temple
    1. Haga clic en el paso Bucle de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método, en el paso Seleccionar sugerencia. Escriba col como variable .FirstColumn como Start, .LastColumn como End y 1 como Increment.
    2. En Bucle, haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de carga de sugerencias de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método. Seleccione las puntas BC90, la ubicación del TL5 y la ubicación de las puntas de la copia de seguridad del TL2 de la ubicación del menú desplegable. Seleccione Columna(s) única(s) y escriba 1.
    3. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias aspirar de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type y Reagent Plate Position. Escriba el volumen "Quench", Aspirar en la columna 5 y la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    4. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias dispense de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Escriba el volumen "Quench", Dispense en la columna " col" y la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    5. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de descarga de la barra de herramientas en Pasos de manipulación líquida y arrástrelo al método, en A continuación. Seleccione Descargar sugerencias en TR1.
    6. Después del final del bucle If the, haga clic en el paso Ejecutar procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Seleccione el procedimiento Orbital.
    7. Haga clic en el paso Pausa de la barra de herramientas en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Detenga todo el sistema durante 1 s.
    8. Haga clic en el paso Pausa de la barra de herramientas en Configuración y pasos del dispositivo y arrástrelo al método. Seleccione Pausar todo el sistema y muestre este mensaje. Escriba el mensaje 'Continuar después de la centrifugación'.
  15. Configuración de la placa para el muestreador automático
    1. Haga clic en el paso Si de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método, dentro del paso Seleccionar sugerencia. Escriba Autosampler como condición.
    2. En A continuación, haga clic en el paso Bucle de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Escriba col como variable .FirstColumn como Start, .LastColumn como End y 1 como Increment.
    3. En Bucle, haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de carga de sugerencias de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método. Seleccione las puntas BC230, la ubicación TL6 y la ubicación de las puntas de la copia de seguridad TL2 del menú desplegable. Seleccione Columna(s) única(s) y escriba 1.
    4. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias aspirar de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type y Reagent Plate Position. Escriba el volumen "MobilePhase", Aspirar en la columna 6 y en la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    5. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias dispense de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del bucle. Seleccione Bio_RadPCR96 Tipo de Labware y Posición de la placa del muestreador automático. Escriba el volumen "MobilePhase", Dispense en la columna "col" y "fila 1". Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    6. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de descarga de la barra de herramientas en Pasos de manipulación líquida y arrástrelo al método, en A continuación. Seleccione Descargar sugerencias en TR1.
    7. Después del final del bucle If, haga clic en el paso Ejecutar procedimiento de la barra de herramientas en Pasos de control y arrástrelo al método. Seleccione el procedimiento TipCount.
    8. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de carga de sugerencias en la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método. Seleccione las sugerencias BC90, la ubicación del TL5, y la ubicación de las puntas de la copia de seguridad TL2 del menú desplegable. Seleccione Columna(s) única(s) y escriba .tipcolumns.
    9. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de aspirar en la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método dentro del bucle. Seleccione BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Escriba el volumen "DigestTransfer", Aspirate en la columna "firstcolumn" y la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    10. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias dispense de la barra de herramientas en Pasos de manipulación de líquidos y arrástrelo al método, dentro del bucle. Seleccione Bio_RadPCR96 Tipo de Labware y Posición de la placa del muestreador automático. Escriba el volumen "MobilePhase", Dispense en la columna "FirstColumn" y la fila 1. Seleccione una técnica optimizada en el menú desplegable de la técnica.
    11. Haga clic en el paso Seleccionar sugerencias de descarga de la barra de herramientas en Pasos de manipulación líquida y arrástrelo al método dentro de Entonces. Seleccione Descargar sugerencias en TR1. El paso de sugerencias de selección termina aquí.
    12. Guarde y asigne un nombre al método.

2. Prepare muestras, utensilios de laboratorio y reactivos

  1. Transfiera 5 l de plasma humano sano acumulado a una placa de pozo profundo de polipropileno de 96 balas.
    NOTA: Consulte la Tabla de materiales para ver los reactivos y suministros utilizados en este protocolo. TPCK Treated Trypsin fue comprado y la relación de trippsina al sustrato y el tiempo de incubación se optimizaron específicamente. Si se utiliza un grado diferente de tripsina, como la trippsina recombinante de grado de secuencia, la relación enzima-sustrato y el tiempo de incubación deben probarse y optimizarse.

3. Procedimiento de funcionamiento

  1. Haga doble clic en el icono del software.
  2. En la pestaña Método, seleccione Inicio de todos los ejes para orientar y preparar el controlador de líquidos automatizado. Asegúrese de que todas las jeringas de la estación de trabajo no contengan burbujas de aire visibles.
  3. En Archivo, seleccione Abrir . Método.
  4. Seleccione el método(Figura 6).
  5. Inicie el método haciendo clic en el icono Ejecutar con forma de triángulo verde.
  6. Para tener una placa de muestreador automático preparada al final del método, introduzca el valor 'true' en el símbolo del sistema Intro un valor que se utilizará para 'Autosampler' y, a continuación, haga clic en Aceptar. Si no se está preparando una placa del muestreador automático, introduzca el valor 'false' y, a continuación, haga clic en Aceptar.
  7. Introduzca el valor '1' en el símbolo del sistema Introducir un valor que se utilizará para 'firstcolumn' y, a continuación, haga clic en Aceptar.
  8. Escriba el valor '12' en el símbolo del sistema Introducir un valor que se utilizará para 'lastcolumn' y, a continuación, haga clic en Aceptar.
    NOTA: Este paso y el paso 4.7 indican a la estación de trabajo que realice una digestión en 12 columnas de una placa de 96 pocillos, lo que resulta en todos los pocillos de la placa que se utilizan para la digestión
  9. Si se está utilizando una placa de muestra con volúmenes de muestra de al menos 20 ml, introduzca el valor 'true' en el símbolo del sistema Intro un valor que se utilizará para 'SamplePlate' y, a continuación, haga clic en Aceptar. Si no se utiliza una placa de muestra, introduzca el valor 'false' y, a continuación, haga clic en Aceptar.
    NOTA: Si no se está utilizando una placa de muestra, añada 5 ml de muestra a cada pocel correspondiente de la placa de reacción.
  10. Siga las instrucciones de la ventana Configuración guiada de Labware y haga clic en Continuar.
    NOTA: La siguiente ventana describe el diseño de la "placa de reactivo" que se debe preparar(Figura 7, Tabla suplementaria 1). Los siguientes volúmenes se alíscarán en cada uno de los 8 pocillos de una sola columna en la placa de pozo de 1 mL Deep Round 96:
    Columna 1: 540 l de mezcla de reacción 1.
    Columna 2: 50 l de bloque de cisteína.
    Columna 3: 730 l de mezcla de reacción 2.
    Columna 4: 130 l de trippsina.
    Columna 5: 130 l de solución de temple.
    Columna 5: 1090 l de solución de fase móvil (si el usuario ha introducido 'true' en el paso 6).
  11. Haga clic en Siguiente y en la siguiente ventana se describe el volumen mínimo (20 l) necesario para que se haya situado en la placa de muestra. Si el usuario ha introducido el valor 'false' para el mensaje que implica la placa de muestra (paso 9), se le pedirá al usuario que agregue una muestra de 5 l a la placa de reacción.
  12. Haga clic en Siguiente.
    NOTA: La siguiente ventana muestra que se debe colocar una caja de punta sin corriente sin trabajo de 90 l en la cubierta automatizada del controlador de líquidos.
  13. Haga clic en Siguiente de nuevo, colocando la cubierta del controlador de líquidoautomatizado según lo especificado e ilustrado(Figura 8), incluyendo la placa de reactivo, la placa de reacción, la placa de muestra, la placa del muestreador automático, 6 cajas de puntas completas de 90 l, una caja de punta vacía de 90 l y una caja de puntas completa de 230 ol.
  14. Haga clic en Finalizar para iniciar el método.
    NOTA: Después de hacer clic en Finalizar, el usuario no puede acceder al controlador de líquidos automatizado. Esto "romperá la cortina de luz" de la máquina y detendrá el manipulador de líquidos como precaución de seguridad.
  15. En el indicador Continuar después de la centrifugación, recupere la placa de reacción y centrifugarla durante 30 minutos a 3.000 rpm.
  16. Una vez completada la centrifugación, devuelva la placa de reacción al manipulador de líquidos automatizado a la posición en la que se encontraba antes de la centrifugación y haga clic en Continuar.
    NOTA: El controlador de líquido automatizado se detendrá de nuevo cuando se complete el método. Si el usuario ha introducido 'true' para el paso 6, la placa del muestreador automático puede retirarse de la estación de trabajo y colocarse en el muestreador automático de un instrumento de cromatografía líquida para su análisis.

4. LC-MSMS

  1. Resuelva los péptidos en un HPLC de alto flujo que comprende una columna C18 de 2,1 mm x 100 mm, 3,5 m con un caudal de 0,25 ml/min y analizado en línea en un espectrómetro de masa súcular triple.
    NOTA: Después de la digestión de péptidos, el método LC-MSMS específico para cuantificar péptidos de muestras preparadas robóticamente se describe en detalle1 después de una breve descripción de LC-MSMS.
  2. Establezca la temperatura del horno de columna en 40 oC. Utilice el tampón A (2% ACN, 98% agua, 0,1% ácido fórmico) y tampón B (95% ACN, 5% agua, 0,1% ácido fórmico) como las dos fases móviles.
  3. Equilibrar la columna con 5% B durante 5 minutos después de la carga. Eluir los péptidos durante 30 minutos con un gradiente lineal de 5% a 35% del tampón B.
    1. Recicle la columna antes de cargar la siguiente muestra lavándolo con 98% B durante 10 minutos y luego 5% B durante 5 minutos.
    2. Para la desviación en línea, desvíe el eluyente posterior a la columna antes de que entre en la fuente de iones utilizando una válvula de conmutación de dos fases.
  4. Procesar los datos MRM.

Representative Results

El flujo de trabajo automatizado de preparación de muestras proteómicas en la estación de trabajo automatizada se adaptó de nuestro protocolo automatizado anterior con un robusto método de adquisición LC-SRM-MS1 para la albúmina, la proteína plasmática seleccionada y la galactosidasa( é-gal), una proteína exógena utilizada para el control de calidad. Después del procesamiento, las muestras se ejecutaron en un triple cuadripolo LC-MS en un ensayo SRM dirigido a la albúmina sérica, la galactosidasa. El coeficiente de variación (CV) de la señal SRM para cada transición se utilizó para monitorear la reproducibilidad del protocolo de digestión automatizado.

Automatizamos los pasos de adición y mezcla de reactivos para una digestión de muestras de plasma de 5 l con una incubación de trippsina de incubadora de incubadora en cubierta de 2 horas. Para determinar la reproducibilidad, se pipeteó 5 l de una piscina de plasma en varios pozos de una placa de reacción con un cabezal multicanal (96 pines). Para controlar la consistencia, añadimos proteína de la gasíva antes de las reacciones de reducción y alquilación. El flujo de trabajo automatizado de preparación de muestras proteómicas se probó con un sólido método de adquisición LC-SRM-MS que incluye albúmina, la proteína plasmática de mayor abundancia y proteína de gal, utilizada para el control de calidad. Se monitorizaron tres péptidos de gal y dos péptidos de albúmina a partir de proteínas de albúmina plasmática procesadas y proteína de espiga de gal(Tabla 4).

En un esfuerzo por ahorrar tiempo y simplificar el procedimiento, redujimos los pasos de transferencia de líquido sin añadir/mezclar/incubar mezcla de reactivo sin reacción con la estación de trabajo de un flujo de trabajo de nueve pasos a un flujo de trabajo de seis pasos(Figura 1). El flujo de trabajo proteómico total se componía de dos componentes experimentales: preparación automatizada de muestras y LC-MS/MS. En primer lugar, evaluamos la precisión de la adquisición de datos LC-MS/MS SRM mediante ocho inyecciones consecutivas del mismo pozo de digestión de la placa automuestreador. La precisión del flujo de trabajo automatizado de preparación de muestras se calculó mediante el porcentaje de coeficiente de varianza (%CV) del flujo de trabajo total de SRM proteómico menos%CV de lc-MS/MS(figura 9B). Con el procedimiento de digestión plasmática simplificado en la estación de trabajo automatizada, la precisión experimental de la preparación automatizada de muestras fue inferior al 11,4% para las proteínas exógenas de glométricas (10,0% como promedio), y menos del 14,9% para la albúmina sérica humana más abundante (9,9% como promedio)(Figura 9). Se observaron buenas intensidades de señal tanto para la albúmina sérica humana como para las proteínas de gal como se esperaba(Figura 9C).

Para cada paso de pipeteo y transferencia de líquidos, las técnicas fueron optimizadas específicamente. Para monitorear la precisión de los pasos de transferencia de líquidos, hemos punzonado los estándares estables de péptidos etiquetados con isótopos (SIL) para la proteína endógena de albúmina sérica humana y la proteína exógena de la proteína de gal en tres pasos de transferencia de reactivos independientes: Reaction Mix 1, Cysteine Blocker y Reaction Mix 2(Figura 10). Se adquirieron señales MRM de estos cinco péptidos SIL para monitorear la precisión de los pasos automatizados de transferencia de líquidos. El promedio de %CV para los péptidos, DDNPNLPR y GDFQFNISR (en adelante, el aminoácido etiquetado N15) de Reaction Mix 1 osciló entre el 1,8% y el 11,2%. El %CV promedio de un péptido (IDPNAWVER) del paso Bloqueador de cisteína osciló entre 6,6 y 8,8%. El %CV medio de dos péptidos (WVGYGQDSR y LVNEVTEFAK) osciló entre el 6,2% y el 11,9%(Figura 10).

Para validar el flujo de trabajo automatizado de preparación de muestras proteómicas, evaluamos la reproducibilidad en múltiples proteínas y varios días para la albúmina sérica humana, la glorina exógena y las 40 proteínas plasmáticas adicionales. Procesamos 21 muestras de réplica (plasma humano normal agrupado), ubicación del pozo que se muestra en la Figura 11A,en tres días diferentes. Los CV intradía se calcularon a partir de 21 pozos preparados el mismo día. La media intradía de %CV para 40 proteínas osciló entre el 4% y el 20%(Figura 11B). Para evaluar el efecto de borde del flujo de trabajo automatizado basado en placas, %CV se calculó a partir de pozos específicos dentro de columnas y filas designadas(Figura 12A para el mapa de columnas y filas). Las intensidades de las señales MRM fueron similares en todas las configuraciones de columna y fila con %CV que van desde 3% - 22%(Figura 12B).

En resumen, el flujo de trabajo automatizado optimizado produce 96 muestras procesadas uniformemente en menos de cinco horas con una excelente precisión experimental. Para la compatibilidad con un flujo de trabajo automatizado, seleccionamos reactivos que tienen reacciones laterales insignificantes no específicas, son estables en la luz ambiental, son compatibles con LC-MS/MS y se pueden almacenar como alícuotas congeladas.

Figure 1
Figura 1: Esquema del flujo de trabajo de preparación de ejemplo. Se enumeran los 6 pasos principales de transferencia de líquidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Secuencia de comandos de carga de sugerencias. Los detalles del script de VB se muestran aquí. El script especifica las condiciones de carga de la sugerencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Diseño automatizado de la cubierta de la estación de trabajo. La cubierta consta de 1x1 ALPs, AlPs de carga de puntas, Basura, Lavado de puntas, Peltier y una incubadora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Propiedades de la placa del reactivo. Se muestran las propiedades necesarias para el material de laboratorio de reactivos de placas cuando se accede mediante la configuración de Laboratorio guiada. Seleccione la columna correspondiente y escriba las variables indicadas en la figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Script de recuento de sugerencias. Este script ayuda a realizar un seguimiento del número de consejos en la cubierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Visión general del método para digerir y alícundar muestras plasmáticas. Pasos para cálculos de reactivos, configuración de material de laboratorio y manipulaciones de líquidos en el método del controlador de líquidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Disposición de la placa del reactivo. Se muestran los reactivos químicos necesarios para la digestión plasmática y la preparación del automuestreador y se distribuyen a través del material de laboratorio de placas de reactivos. Esta cifra se ha modificado a partir de una nota técnica10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Diseño para el material de laboratorio en la cubierta de la estación de trabajo automatizada. Se muestra el diseño de la cubierta para el método de digestión plasmática para el manipulador de líquidos. Esta cifra se ha modificado a partir de una nota técnica10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: La precisión del flujo de trabajo proteómico total se compone de CV de estación de trabajo y LC MS/MS CV dirigido.
Se mostraron cinco péptidos de la gaquína y la albúmina, se mostraron los cromatogramas y el tiempo de retención de péptidos para cada péptido (A), la precisión se determinó a partir de 30 pozos/muestras de procesamiento representativo del experimento, CVs% para el flujo de trabajo proteómico total, análisis LC MS/MS y procesamiento automatizado de muestras (B). En general, los péptidos digeridos mostraron buenas señales que oscilaban entre 1x105 y 1x108. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Determinación de la precisión para los pasos de transferencia de líquidos. Los péptidos sintéticos se aumentaron en reactivos específicos de pasos, y la transferencia automatizada de líquidos se determinó por porcentaje total de CV. A partir de 30 pozos / muestras experimento menos% CV LC MSMS (determinado por 8 repeticiones LC MSMS inyecciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Reproducibilidad de varios días del flujo de trabajo automatizado de preparación de muestras proteómicas con 42 análisis de MRM proteicos. (A) Mapa de la placa de reacción para cada uno de los tres días se muestra aquí, plasma de 5 L se añadió a cada uno de los 21 pozos. 3 pozos recibidos 5 ul agua se utilizaron como controles negativos / en blanco. (B) Las intensidades medias de 190 transiciones comprenden 75 péptidos y 42 proteínas (izquierda) y porcentaje de CV para cada transición MRM se calcularon a partir de 21 pozos de digestión para cada día (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12: Reproducibilidad de ubicaciones específicas de pozos (posición de columnas y filas). (A) La ubicación de columnas y filas con un mapa de placas se muestra aquí. (B) Señales MRM específicas de la ubicación de columna y fila de intensidades medias de pozos especificados (izquierda) y cv% (derecha) de una sola digestión de placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 13
Figura 13: Captura de pantalla del editor de técnicas. Para cada plantilla de pipeteo, defina las propiedades de detección de nivel de líquido, detección de clots, piercing, tipo de líquido, general, aspirado, dispensación, mezcla y calibración. La plantilla y las técnicas utilizadas en este protocolo se muestran en la Tabla Suplementaria 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Variable Variable Valor Descripción
Automuestreador Booleana Verdad Utilice el muestreador automático
Betagal Entero 5 Volumen betagal
BG1 Entero 0.8 Volumen BG1
BG2 Entero 0.8 Volumen BG2
BG3 Entero 0.8 Volumen BG3
CysteinBlocker Entero 1.25 Volumen del bloqueador de cisteína
CysteineBuffer Entero 0.45 Volumen de tampón de cisteína
Desnaturalizante Entero 5 Volumen desnaturalizante
DigestTransfer Entero 10 Volumen de transferencia de digerido
Primer búfer Entero 25.9 Primer volumen de búfer
Primera columna Entero 1 Primera columna
HSA1 Entero 0.8 Volumen HSA1
HSA2 Entero 0.8 Volumen HSA2
lastcolumn Entero 12 Ultima columna
MobilePhase Entero 90 Volumen de fase móvil
Apagar Entero 10 Columna de Temple
ReducingAgent Entero 5 Columna de agente de reducción
Muestra Entero 5 Columna de ejemplo
SamplePlate Booleana Verdad Usar placa de muestra
SecondBuffer Entero 58.4 Segundo volumen de búfer
Tripsina Entero 10 Columna de trippsina

Tabla 1: Iniciar variables de paso

Valor Variable
•FirstBuffer+Denaturant+ReducingAgent+Betagal+BG1+HSA1 FirstMix
CysteineBlocker+CysteineBuffer+BG2 CysteineMix
•Segundo Búfer+BG3+HSA2 SecondMix
•(FirstMix*Columns)+30 FirstMixWell
(CysteineMix*Columnas)+20 CysteineWell
•(SecondMix*Columns)+10 SecondMixWell
•(Trypsin*Columns)+10 TrypsinWell
•(Quench*Columnas)+10 QuenchWell
•(FirstMixWell*8)+100 FirstMixStock
•CysteineWell*8+20 CysteineMixStock
•(SecondMixWell*8)+100 SecondMixStock

Tabla 2: Variables de mezcla de volumen

Tipo Nombre Posición Profundidad Propiedades ¿Uso?
BCDeep96Round Placa de reactivo P5 1 (arriba) # No SamplePlate
BCDeep96Round Placa de reactivo P5 1 (arriba) # •SamplePlate
BCDeep96Round Placa de reacción P11 1 (arriba) Verdad
Bio_RadPCR96* Muestras P9 1 (arriba) •SamplePlate
Bio_RadPCR96* Placa del muestreador automático P10 1 (arriba) •Autosampler
BC90 Vacío 1 (arriba) Verdad
BC90 1 (arriba) Verdad
BC90 1 (arriba) Verdad
BC230 1 (arriba) •Autosampler
BC90 1 (arriba) •Columnas>1
BC90 1 (arriba) •Columnas>3
BC90 1 (arriba) •Columnas>5
BC90 1 (arriba) •Columnas>7
BC90 1 (arriba) •Columnas>9
Nota:
*: Corresponde a la placa Bio-Rad de 96 pozos.
• Haga clic en propiedades y, a continuación, escriba las variables de volumen como se indica en la figura 6.

Tabla 3: Configuración de la configuración guiada

Proteína ID Secuencia de péptidos Q1 Masa (Da) Q3 Masa (Da) Tiempo (min) Fragment Ion Potencial de desclustering Energía de colisión Potencial de salida de la célula de colisión
sp á P00722 BGAL_ELOCI GDFQFNISR 542.3 262.1 19.7 +2y2 61 21 8
542.3 636 19.7 +2y5 61 25 12
542.3 764.2 19.7 +2y6 61 25 18
IDPNAWVER 550.3 436.1 18.1 +2y7+2 61 23 8
550.3 871.2 18.1 +2y7 61 25 18
550.3 774.2 18.1 +2y6 61 33 8
WVGYGQDSR 534.3 782.1 12.1 +2y7 51 25 6
534.3 562.1 12.1 +2y5 51 27 6
534.2 505.2 12.1 +2y4 90 25 8
sp á P02768 ALBU_HUMAN DDNPNLPR 470.8 596.2 9.2 +2y5 61 27 16
470.8 499.3 9.2 +2y4 61 27 18
470.8 710.4 9.2 +2y6 61 27 18
LVNEVTEFAK 575.3 694.4 18.2 +2y6 73.1 29.6 18
575.3 937.5 18.2 +2y8 73.1 29.6 18
575.3 823.4 18.2 +2y7 73.1 29.6 18

Tabla 4: Parámetros MRM

Tabla suplementaria 1: Placa de reactivo Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 2: Plantilla de protocolo Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

El procesamiento de muestras para espectrometría de masas requiere desnaturalización de proteínas, reducción y alquilación para bloquear las cisteínas, y la digestión de trippsina para dividir las proteínas en péptidos. Cada reacción química o enzimática debe iniciarse en un momento designado y realizarse a una temperatura controlada, y cada paso del proceso implica múltiples pasos de transferencia de líquido donde se puede introducir la variación experimental. El procesamiento automatizado de muestras proporciona una solución a este dilema. Los sistemas de manipulación de líquidos disponibles actualmente tienen la capacidad de transferir reactivos en placas de 96 pocillos con una precisión inferior al 5%, dependiendo del tipo de cabeza y punta utilizado, e incubar muestras, con temblores si se desea, bajo temperaturas controladas que oscilan entre 14 oC y 70 oC. Utilizamos un manipulador de líquidos automatizado para procesar plasma para ensayos SRM en un formato de 96 pozos.

Hay muchos miles de sitios de escote proteasa dentro de las complejas mezclas de proteínas en suero, plasma y otras muestras biológicas; y cada una de estas proteínas tiene propiedades únicas que afectan la accesibilidad del sitio de escote y la estabilidad de los péptidos resultantes. Por lo tanto, es imposible diseñar un procedimiento de procesamiento de muestras que sea óptimo para cada proteína. La mejor alternativa es ser lo más consistente posible.

Para lograr la consistencia, optimizamos cada paso de pipeteo realizado por el controlador de líquido automatizado. Primero consideramos el volumen requerido y las restricciones impuestas por el tipo de líquido (plasma, acuoso u orgánico) y las propiedades correspondientes (viscosidad, cohesión y volatilidad), hardware (cabezal de pipeteo de estación de trabajo y brazos de acaparamiento de placas) y material de laboratorio. Luego variamos la velocidad y la brecha de aire final para la aspiración, la velocidad y el volumen de soplado para la dosificación, y la fuerza y duración de la mezcla, al tiempo que incorporamos un toque de punta después de la aspiración y / o dispensación, si es necesario, para eliminar el líquido adhiriendo al exterior de las puntas (Figura 13, Tabla Suplementaria 1). Un péptido SIL único, pre-analizado para la estabilidad, fue introducido en cada reactivo para que sea posible monitorear la precisión de cada paso de manejo de líquidos. Después de la optimización, los CV de proceso para la mayoría de las transiciones fueron inferiores al 10%, lo que demuestra una buena reproducibilidad con la estación de trabajo automatizada(Figura 9, Figura 10, Figura 11 y Figura 12).

El flujo de trabajo automatizado que se presenta aquí proporciona una digestión enzimática coherente con una reproducibilidad y un rendimiento mejorados en comparación con los métodos manuales(Figura 9, Figura 10). Este enfoque promete mejorar la precisión y fiabilidad del descubrimiento y validación de biomarcadores mediante espectrometría de masas.

Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Ninguno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A Pooled healthy human plasma Bioreclamation Inc. human plasma tested in the manuscript
Acetonitrile, HPLC Grade Thermo Fisher Scientific A998SK1 LC MS/MS solvent
B-Galactosidase Recombinant from E.Coli Sigma-Aldrich G3153-5MG exogenous control proteins.
Biomek i7 Automated Workstation Beckman Coulter, Inc. The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions
Biomek i-Series Tips 230µL Non-Sterile Beckman Coulter, Inc. B85903  Tips, i7 consumable
Biomek i-Series Tips 90µL Non-Sterile Beckman Coulter, Inc. B85881  Tips, i7 consumable
FG, Kit Trypsin TPCK Sciex 4445250 Trypsin used in digestion
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear  Bio-Rad #hsp9641 Autosampler plate
Octyl B-D-Glucopyranoside Sigma-Aldrich O9882-5G detergent used in digestion
Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile Beckman Coulter, Inc. 267007 Reagent and digestion plate
Prominence UFLCXR HPLC system Shimadzu, Japan High flow LC sytem
QTRAP 6500 SCIEX Mass spectrometer
Water, HPLC Grade Thermo Fisher Scientific W54 LC MS/MS solvent
Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm Waters 186003564 LC MSMS column

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References

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Bioquímica Número 158 espectrometría de masas tándem de cromatografía líquida (LC/MS/MS) monitoreo de reacciones seleccionado por cromatografía líquida (LC-SRM) Automatización preparación de muestras de proteínas reproducibilidad alto rendimiento
Una preparación de muestra de plasma para espectrometría de masas utilizando una estación de trabajo automatizada
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Fu, Q., Johnson, C. W., Wijayawardena, B. K., Kowalski, M. P., Kheradmand, M., Van Eyk, J. E. A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation. J. Vis. Exp. (158), e59842, doi:10.3791/59842 (2020).

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