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Biochemistry

एक स्वचालित वर्कस्टेशन का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्लाज्मा नमूना तैयारी

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/59842
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Advanced Clinical Biosystems Institute, Smidt Heart institute, Cedars Sinai Medical Center, 2Beckman Coulter Life Sciences

Summary

यहां, हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित मात्रात्मक प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए एक स्वचालित प्लाज्मा प्रोटीन पाचन विधि प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, प्रोटीन डेन्यूमेंटेशन, कमी, एल्किलेशन और ट्राइप्सिन पाचन प्रतिक्रियाओं के लिए तरल हस्तांतरण और ऊष्मायन कदम सुव्यवस्थित और स्वचालित होते हैं। वांछित परिशुद्धता के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करने में लगभग पांच घंटे लगते हैं।

Abstract

प्रोटेओमिक्स में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करने के लिए पेप्टाइड मिश्रण में प्रोटीन के एंजाइमैटिक क्लीवेज की आवश्यकता होती है। इस प्रक्रिया में डेन्यूमेंट, कमी, एल्किलेशन और क्लीवेज प्राप्त करने के लिए कई ऊष्मायन और तरल हस्तांतरण चरण शामिल हैं। एक स्वचालित वर्कस्टेशन पर इस कार्यप्रवाह को अनुकूलित करने से दक्षता में वृद्धि हो सकती है और विचरण के गुणांक को कम किया जा सकता है, जिससे नमूना प्रकारों के बीच सांख्यिकीय तुलना के लिए अधिक विश्वसनीय डेटा प्रदान किया जा सकता है। हमने पहले एक स्वचालित प्रोटेओमिक नमूना तैयारी कार्यप्रवाह1वर्णित किया था। यहां, हम निम्नलिखित फायदों के साथ अधिक कुशल और बेहतर नियंत्रित कार्यप्रवाह के विकास की रिपोर्ट करते हैं: 1) अभिकर्मकों के संयोजन से तरल हस्तांतरण चरणों की संख्या नौ से घटाकर छह कर दी जाती है; 2) कई चैनलों के साथ 96-पोजीशन पाइपिंग सिर का उपयोग करके चयनात्मक टिप पाइपटिंग द्वारा पाइपिंग समय कम हो जाता है; 3) क्षमता थ्रूपुट 45 डेक पदों तक की उपलब्धता से बढ़ जाती है; 4) प्रणाली का पूरा बाड़े बेहतर तापमान और पर्यावरण नियंत्रण प्रदान करता है और नमूनों या अभिकर्मकों के संदूषण की क्षमता को कम करता है; और 5) स्थिर आइसोटोप लेबल पेप्टाइड्स के अलावा, साथ ही प्रत्येक नमूने के लिए, पूरी प्रक्रिया में निगरानी और गुणवत्ता नियंत्रण संभव बनाता है। ये हार्डवेयर और प्रक्रिया सुधार अच्छी प्रजनन क्षमता प्रदान करते हैं और अंतर-परख और अंतर-परख परिशुद्धता (20% से कम का सीवी) में सुधार करते हैं एलसी-एमएस आधारित प्रोटीन और पेप्टाइड क्वांटिफिकेशन के लिए। 96-अच्छी प्लेट में 96 नमूनों को पचाने के लिए पूरा कार्यप्रवाह लगभग 5 घंटे में पूरा किया जा सकता है।

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटीन और पेप्टाइड क्वांटिफिकेशन को बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक प्रयोगशालाओं2,,3में प्लाज्मा विश्लेषण के लिए बायोएनालिटिकल उपकरण के रूप में तेजी से लागू किया जा रहा है । अपेक्षित इंस्ट्रूमेंटेशन और सूचनाएं तेजी से बढ़ी हैं क्योंकि एमएस एक ही एमएस रन4में सैकड़ों पेप्टाइड्स की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता के कारण विशिष्ट पेप्टाइड दृश्यों को लक्षित करके प्रोटीन या संशोधित प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए पसंद की विधि बन गई है । नमूना तैयारी किसी भी प्रोटेमिक विश्लेषण के लिए नींव के रूप में कार्य करता है। एमएस विश्लेषण से पहले, जैविक नमूने में प्रोटीन आमतौर पर विकृत, कम, अल्काटेड, ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स में पचाजाते हैं, और5को डिसाल्टेड करते हैं। अनियंत्रित संशोधनों को रोकने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी साइस्टीन के पास एक ही द्रव्यमान है, अल्किलेशन ब्लॉक सिस्टीन होते हैं। इसके बाद, पेप्टाइड्स में प्रोटीन को पचाने के लिए ट्राइप्सिन जोड़ा जाता है। इनमें से प्रत्येक चरण को अनुकूलन की आवश्यकता होती है, और पूरी प्रक्रिया पारंपरिक रूप से मैन्युअल रूप से की जाती है, जिससे विश्लेषणात्मक त्रुटियों को लागू करने की अनुमति होती है।

पारंपरिक बायोमार्कर विकास पाइपलाइन में दो मुख्य प्रक्रियाएं शामिल हैं: वैश्विक प्रोटीन खोज के लिए शॉटगन प्रोटेओमिक्स एक गहन प्रोटीन इन्वेंट्री6 बनाने के लिए और उच्च सटीक और उच्च थ्रूपुट प्रोटीन क्वांटिटेशन7के उद्देश्य से सत्यापन और सत्यापन के लिए लक्षित प्रोटेओमिक्स। एमएस दृष्टिकोण की परवाह किए बिना, नमूना तैयारी एक ही है और एक पेप्टाइड मिश्रण में प्रोटीन के एंजाइमैटिक दरार पर केंद्र है । जैसा कि वैन आइक और सोभानी8द्वारा प्रस्तावित है, एक विधि है जो खोज और लक्षित परख दोनों के लिए सटीक, सटीक और प्रजनन विश्लेषण के लिए अनुमति देती है, खोज बायोमार्कर को नैदानिक लागू परखों में प्रभावी ढंग से स्थानांतरित करने के लिए वांछित है। ऐसा करने के लिए, नमूना तैयारी का स्वचालन सहायक होगा और उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए दक्षता बढ़ाने की क्षमता प्रदान करेगा। मैनुअल तरीके आमतौर पर संशोधित बायोएनालिटिकल मेथोड सत्यापन मार्गदर्शन में खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा निर्दिष्ट स्वीकार्य सीमाओं से परे विश्लेषणात्मक त्रुटियों को पेश करते हैं, जिसमें बायोमार्कर और निदान2,,9शामिल हैं। बायोमार्कर अनुसंधान की सुविधा के लिए तेजी से, अत्यधिक सटीक और हाथों से मुक्त एमएस प्रोटीन नमूना तैयारी कार्यप्रवाह का विकास आवश्यक होगा, जिसके लिए हजारों जैविक नमूनों को तैयार करने और विश्लेषण करने की आवश्यकता है। एमएस नमूना तैयारी में कई कदम हैं जहां त्रुटियों को पेश किया जा सकता है, और प्रक्रिया थकाऊ और समय लेने वाली है।

हमारी बेहतर विधि में, एक स्वचालित वर्कस्टेशन को कुल 6 चरणों(चित्रा 1)में सभी आवश्यक प्लाज्मा नमूना तैयारी प्रक्रियाओं को करने के लिए प्रोग्राम किया गया था: 1) सटीक तरल हस्तांतरण; 2) प्रतिक्रिया शुरू की और एक सुसंगत समय पर बंद कर दिया है; 3) प्रतिक्रिया नियंत्रित तापमान (यानी, इनक्यूबेटर) पर की जाती है; और 4) प्रतिक्रिया सभी प्रतिक्रियाओं के लिए एक समान मिश्रण है। हमने 96-अच्छी तरह से प्रारूप में एलसी-एमएस आधारित प्रोटीन और पेप्टाइड क्वाटिफिकेशन की गुणवत्ता और पुन: प्रवर्तक थ्रूपुट सुनिश्चित करने के लिए एक्सोजेनस गुणवत्ता नियंत्रण प्रोटीन और आंतरिक मानकों (स्थिर आइसोटोप-लेबल पेप्टाइड मानक) को जोड़ने को भी लागू किया। अभिकर्मक तैयारी, काम के समय के घंटे और कुल १,०००,००० पाइपिंग कदम सहित व्यक्तिगत ट्यूबों में ९६ नमूनों को संसाधित करने की आवश्यकता होगी । स्वचालन हाथ पर समय और शामिल मानव बातचीत की संख्या कम कर देता है ।

Protocol

1. स्वचालित तरल हैंडलर के लिए प्रोग्रामिंग

  1. फ़ाइल मेनू से एक नई विधि बनाएं(फ़ाइल । नई विधि)
    नोट: दिए गए आदेश में चरणों को पूरा करें। इटालिक फ़ॉन्ट बायोमेक सॉफ्टवेयर में टाइप करने के लिए टेक्स्ट को दर्शाता है। पाइपिंग तकनीकों और टेम्पलेट्स के बारे में जानकारी के लिए लेखकों से संपर्क करें।
  2. टेबल 1 में सूचीबद्ध स्टार्ट स्टेप में टाइप स्टेप वेरिएबल ्स और उनके मूल्य शुरू करें।
  3. चयनात्मक टिप पाइपिंग के लिए कॉलम सेट करें। चरण 1.3-1.7 के लिए, नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में सेट ग्लोबल स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें।
    1. सेट ग्लोबल स्टेप का उपयोग करते हुए, वेरिएबल FirstColumn_Globalके लिए वैल्यू =फर्स्टकॉलम सेट करें, वेरिएबल LastColumn_Globalके लिए वैल्यू =लास्टकॉलम, वैल्यू =लास्टकॉलम-फर्स्टकॉलम +1 टू वेरिएबल कॉलम,और वैल्यू =कॉलम * 8 से वेरिएबल वेल्स।
    2. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में स्क्रिप्ट चरण का चयन करें और इसे विधि में खींचें। चित्रा 2में संकेत के रूप में वीबी स्क्रिप्ट टाइप करें ।
  4. सेट ग्लोबल और समाधान घोला जा सकता है के लिए वॉल्यूम सेट करना।
    1. सेट ग्लोबल स्टेप का उपयोग करके, तालिका 2 में दिखाए गए वॉल्यूम मिक्स चर के अनुरूप मूल्यनिर्धारित करें।
    2. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में यदि कदम पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। शर्तों के तहत, ऑटोसैंपलरटाइप करें।
    3. तबके तहत, नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में सेट ग्लोबल स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें।
    4. सेट ग्लोबल स्टेप का उपयोग करते हुए, सेट वैल्यू =(मोबाइलफेज *कॉलम))+10 से वेरिएबल मोबाइलफेजवेलतक।(
    5. अन्यकेतहत, कंट्रोल स्टेप्स के तहत टूलबार में सेट ग्लोबल स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें।
    6. सेट ग्लोबल स्टेप का उपयोग करके, वेरिएबल मोबाइलफेजवेल के लिए मूल्य =0 सेट करें
  5. गाइडेड लैबवेयर सेटअप (जीएलएस) कॉन्फ़िगर करना
    1. यूटिलिटीजके तहत टूलबार में डेक एडिटर स्टेप पर क्लिक करें । चित्रा 3 में डेक लेआउट के अनुरूप एक नया डेक बनाएं और इसे डेक 1 के रूप में लेबल करें।
    2. सेटअप और उपकरणों के तहत टूलबार में गाइडेड सेटअप स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। टेबल 3में इंगित डेक पदों में लैबवेयर प्रकार खींचें और छोड़ दें। इसके बाद टेबल 3 और फिगर 4 (गाइडेड सेटअप सेट अप) में दिखाए गए टैब को टेबल में भरें।
  6. टिप गिनती के लिए प्रक्रिया स्थापित करना
    1. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में परिभाषित प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। टिपकाउंटके रूप में नाम प्रक्रिया।
    2. कंट्रोल स्टेप्स के तहत टूलबार में स्क्रिप्ट स्टेप पर क्लिक करें और उसे विधि पर खींचें। चित्रा 5 (टिप गिनती स्क्रिप्ट) में इंगित के रूप में वीबी स्क्रिप्ट टाइप करें ।
    3. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में यदि कदम पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें।
    4. शर्तों के तहत, टाइप TL5 = 0।
    5. इसकेतहत, सेटअप और डिवाइस स्टेप्स के तहत टूलबार में मूव लैबवेयर स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। टीएल5 से टीआर3 तक लैबवेयर ले जाएं। सेटअप और डिवाइस चरणों के तहत टूलबार में मूव लैबवेयर स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। टीएल2 से टीएल5 तक लैबवेयर ले जाएं। अंत में, सेटअप और डिवाइस चरणों के तहत टूलबार में मूव लैबवेयर स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। बीसी90 से टीएल2 तक लैबवेयर ले जाएं।
  7. इनक्यूबेटर के लिए प्रक्रिया को परिभाषित करना
    1. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में परिभाषित प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। इनक्यूबेटर के रूप में नाम प्रक्रिया।
    2. हाफटाइम में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और 1800 डिफॉल्ट वैल्यू के रूप में।
    3. नेक्स्टटेम्प में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और डिफ़ॉल्ट वैल्यू के रूप में 22।
    4. टेम्प में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और डिफॉल्ट वैल्यू के रूप में 60।
    5. सेटअप और डिवाइस स्टेप्स के तहत टूलबार में एन्हांस्ड मूव लैबवेयर स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। P11 से INHECO1 के लिए लैबवेयर ले जाएँ।
    6. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में रन प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। टिपकाउंट के रूप में नाम प्रक्रिया।
    7. इंटीग्रेशन के तहत टूलबार में इनहेको इनक्यूबेट स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। स्थिति में डिवाइस का उपयोग करने के लिए INHECO1 में टाइप करें, = इनक्यूबेट के लिए हाफटाइम, डिग्री सेल्सियस के लिए = अस्थायी और लक्ष्य तापमान के डिग्री सेल्सियस के लिए 3। विकल्प और कक्षीय (दक्षिणावर्त)शेक शैली को इनक्यूबेटकरते हुए शेक का चयन करें। सेटिंग्स के लिए, 1.00 मिमी साइड टू साइड में टाइप करें, 6.6 बार एक सेकंड, 1.00 मिमी आगे विज्ञापन पीछे की ओर और 6.6 बार एक दूसरे।
      नोट: सुनिश्चित करें कि इनहेको इनक्यूबेटर सॉफ्टवेयर स्थापित किया गया है।
    8. इंटीग्रेशन के तहत टूलबार में इनहेको इनक्यूबेट स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। स्थिति में डिवाइस का उपयोग करने के लिए INHECO1 में टाइप करें, = इनक्यूबेट के लिए हाफटाइम, डिग्री सेल्सियस के लिए = अस्थायी और लक्ष्य तापमान के डिग्री सेल्सियस के लिए 3। इनक्यूबेटिंग ऑप्शन और ऑर्बिटल (काउंटर-क्लॉकवाइज)शेक स्टाइल करते हुए शेक का चयन करें। सेटिंग्स के लिए, 1.00 मिमी साइड टू साइड में टाइप करें, 6.6 बार एक सेकंड, 1.00 मिमी आगे और पीछे की ओर 6.6 बार एक सेकंड पर।
    9. सेटअप और डिवाइस स्टेप्स के तहत टूलबार में ठहराव चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। 1 एस के लिए पूरी प्रणाली को थामने।
    10. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में परिभाषित प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। इनक्यूबेटर के रूप में नाम प्रक्रिया।
    11. इंटीग्रेशन के तहत टूलबार में इनहेको इनक्यूबेट स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। स्थिति में डिवाइस का उपयोग करने के लिए INHECO1 में टाइप करें, इनक्यूबेट के लिए 1, डिग्री सेल्सियस के लिए = नेक्स्टटेम्प और लक्ष्य तापमान के डिग्री सेल्सियस के लिए 3।
  8. कक्षीय के लिए प्रक्रिया को परिभाषित करना।
    1. सेटअप और डिवाइस स्टेप्स के तहत टूलबार में एन्हांस्ड मूव लैबवेयर स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। P11 से ऑर्बिटल1 के लिए लैबवेयर ले जाएँ।
    2. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में रन प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। प्रक्रिया टिपकाउंट का चयन करें।
    3. सेटअप और डिवाइस स्टेप्स के तहत टूलबार में डिवाइस एक्शन स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। डिवाइस ऑरिटलशेकर0 का चयन करें, कमांड टाइमडिशेक। मिलाते हुए गति 1000दर्ज करें , पूर्ण गति 2तक पहुंचने का समय , 30को हिलाने का समय ।
    4. सेटअप और डिवाइस स्टेप्स के तहत टूलबार में एन्हांस्ड मूव लैबवेयर स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। लैबवेयर ऑर्बिटल1 से P11 तक ले जाएं।
  9. पहला मिश्रण स्थापित करना
    1. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। पुनर्व्यवस्थित स्थिति TL4 का चयन करें।
    2. इंटीग्रेशन के तहत टूलबार में इनहेको इनक्यूबेट स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। स्थिति में डिवाइस का उपयोग करने के लिए INHECO1 में टाइप करें, इनक्यूबेट के लिए 1, डिग्री सेल्सियस के लिए 60 और लक्ष्य तापमान के डिग्री सेल्सियस के लिए 3।
    3. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में लूप स्टेप पर क्लिक करें और चुनिंदा टिप स्टेप के भीतर इसे विधि पर खींचें। कोल को वेरिएबल के रूप में टाइप करें = स्टार्ट के रूप में फर्स्टकॉलम, = अंत के रूप में लास्टकॉलम, और 1 वेतन वृद्धि के रूप में।
    4. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स लोड टिप्स स्टेप पर क्लिक करें और लूप स्टेप के भीतर इसे विधि पर खींचें। ड्रॉप-डाउन मेनू से BC90 Tips, TL5 स्थान और TL2 बैकअप टिप्स स्थान का चयन करें। सिंगल कॉलम (एस) चुनें और 1में टाइप करें ।
    5. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स एस्पिरेट स्टेप पर क्लिक करें और लूप स्टेप के भीतर इसे विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और पुनः एजेंट प्लेट स्थिति का चयन करें। वॉल्यूम = FirstMixमें टाइप करें, कॉलम 1 और पंक्ति 1पर एस्पिरेट। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    6. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स डिस्पेंस स्टेप पर क्लिक करें लूप स्टेप के भीतर इसे विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और पुनः एजेंट प्लेट स्थिति का चयन करें। वॉल्यूम = FirstMixमें टाइप करें, कॉलम = कर्नल और पंक्ति 1पर बांटें। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    7. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स अनलोड स्टेप पर क्लिक करें और लूप स्टेप के भीतर इसे विधि पर खींचें। TR1 के लिए अनलोड टिप्स चुनें।
  10. नमूनों की स्थापना
    1. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में यदि कदम पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। स्थिति के रूप में नमूना प्लेट टाइप करें।
    2. इसके तहत, लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स लोड टिप्स स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। ड्रॉप-डाउन मेनू से BC90 Tips, TL5 स्थान और TL2 बैकअप टिप्स स्थान का चयन करें। सिंगल कॉलम (एस) चुनें और =टिपकॉलममें टाइप करें।
    3. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में चुनिंदा टिप्स एस्पिरेट स्टेप पर क्लिक करें और उसे विधि में खींचें, फिर भी। Greiner96RoundPS लैबवेयर प्रकार और नमूने की स्थिति का चयन करें । मात्रा में टाइप करें = नमूना,कॉलम = FirstColumn और पंक्ति 1पर एस्पिरेट। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    4. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स डिस्पेंस स्टेप पर क्लिक करें और उसे विधि में खींचें, फिर भी। BCDeep96Round Labware प्रकार और प्रतिक्रिया प्लेट स्थिति का चयन करें। मात्रा में टाइप करें = नमूना,कॉलम = FirstColumn और पंक्ति 1पर बांटना। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    5. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स अनलोड स्टेप पर क्लिक करें और उसे विधि में खींचें, फिर भी। TR1 के लिए अनलोड टिप्स चुनें।
    6. यदि चरण के अंत के बाद, नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में रन प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। प्रक्रिया इनक्यूबेटर का चयन करें। हाफटाइम में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और 1800 डिफॉल्ट वैल्यू के रूप में। नेक्स्टटेम्प में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और डिफ़ॉल्ट वैल्यू के रूप में 22। टेम्प में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और डिफॉल्ट वैल्यू के रूप में 60।
  11. साइस्टीन ब्लॉक की स्थापना
    1. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में लूप स्टेप पर क्लिक करें और चुनिंदा टिप स्टेप के भीतर इसे विधि पर खींचें। कोल को वेरिएबल के रूप में टाइप करें = स्टार्ट के रूप में फर्स्टकॉलम, = अंतिम कॉलम अंत के रूप में और 1 वेतन वृद्धि के रूप में।
    2. लूपके तहत, लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स लोड टिप्स स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। ड्रॉप-डाउन मेनू से BC90 Tips, TL5 स्थान और TL2 बैकअप टिप्स स्थान का चयन करें। सिंगल कॉलम (एस) चुनें और 1में टाइप करें ।
    3. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में चुनिंदा टिप्स एस्पिरेट स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और पुनः एजेंट प्लेट स्थिति का चयन करें। वॉल्यूम = साइस्टीनमिक्समें टाइप करें, कॉलम 2 और पंक्ति 1पर एस्पिरेट। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    4. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स डिस्पेंस स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और प्रतिक्रिया प्लेट स्थितिका चयन करें । मात्रा में टाइप = साइस्टीनमिक्स,कॉलम = कर्नल और पंक्ति 1पर बांटना। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    5. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स अनलोड स्टेप पर क्लिक करें और उसे विधि में खींचें, फिर भी। TR1 के लिए अनलोड टिप्स चुनें।
    6. यदि लूप के अंत के बाद, नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में रन प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। प्रक्रिया इनक्यूबेटर का चयन करें। हाफटाइम में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और डिफॉल्ट वैल्यू के रूप में 300। नेक्स्टटेम्प में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और डिफॉल्ट वैल्यू के रूप में 43। टेम्प में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और डिफ़ॉल्ट वैल्यू के रूप में 25।
  12. दूसरा मिश्रण स्थापित करना
    1. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में लूप स्टेप पर क्लिक करें और चुनिंदा टिप स्टेप के भीतर इसे विधि पर खींचें। कोल को वेरिएबल के रूप में टाइप करें = स्टार्ट के रूप में फर्स्टकॉलम, = अंतिम कॉलम अंत के रूप में और 1 वेतन वृद्धि के रूप में।
    2. लूप के तहत, लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स लोड टिप्स स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। ड्रॉप-डाउन मेनू से BC90 Tips, TL5 स्थान और TL2 बैकअप टिप्स स्थान का चयन करें। सिंगल कॉलम (एस) चुनें और 1में टाइप करें ।
    3. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में चुनिंदा टिप्स एस्पिरेट स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और पुनः एजेंट प्लेट स्थिति का चयन करें। वॉल्यूम में टाइप करें = सेकेंडमिक्स,कॉलम 3 और पंक्ति 1पर एस्पिरेट। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    4. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स डिस्पेंस स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और प्रतिक्रिया प्लेट स्थिति का चयन करें। मात्रा में टाइप करें = सेकेंडमिक्स,कॉलम = कर्नल और पंक्ति 1पर बांटें । तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    5. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स अनलोड स्टेप पर क्लिक करें और उसे विधि में खींचें, फिर भी। TR1 के लिए अनलोड टिप्स चुनें।
    6. लूप के अंत के बाद, नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में रन प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। प्रक्रिया कक्षीय का चयन करें।
    7. सेटअप और डिवाइस स्टेप्स के तहत टूलबार में ठहराव चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। 1 एस के लिए पूरी प्रणाली को थामने।
  13. ट्रिप्सिन इसके अलावा स्थापित करना
    1. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में लूप स्टेप पर क्लिक करें और चुनिंदा टिप स्टेप के भीतर इसे विधि पर खींचें। कोल को वेरिएबल के रूप में टाइप करें = स्टार्ट के रूप में फर्स्टकॉलम, = अंतिम कॉलम अंत के रूप में और 1 वेतन वृद्धि के रूप में।
    2. लूपके तहत, लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स लोड टिप्स स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। ड्रॉप-डाउन मेनू से BC90 Tips, TL5 स्थान और TL2 बैकअप टिप्स स्थान चुनें। सिंगल कॉलम (एस) चुनें और 1में टाइप करें ।
    3. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में चुनिंदा टिप्स एस्पिरेट स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और पुनः एजेंट प्लेट स्थिति का चयन करें। वॉल्यूम = ट्रिप्सिन,कॉलम 4 और पंक्ति 1पर एस्पिरेट में टाइप करें। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    4. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स डिस्पेंस स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि में खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और प्रतिक्रिया प्लेट स्थिति का चयन करें। मात्रा में टाइप करें = ट्रिप्सिन,कॉलम = कर्नल और पंक्ति 1पर बांटें। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    5. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स अनलोड स्टेप पर क्लिक करें और उसे विधि में खींचें, फिर भी। TR1 के लिए अनलोड टिप्स चुनें।
    6. यदि लूप के अंत के बाद, नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में रन प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। प्रक्रिया इनक्यूबेटर का चयन करें। हाफटाइम में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और डिफॉल्ट वैल्यू के रूप में 3600। नेक्स्टटेम्प में वेरिएबल नाम के रूप में और 25 को डिफॉल्ट वैल्यू के रूप में टाइप करें। टेम्प में वेरिएबल नाम के रूप में टाइप करें और डिफॉल्ट वैल्यू के रूप में 43।
    7. इंटीग्रेशन के तहत टूलबार में इनहेको इनक्यूबेट स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। सुनिश्चित करें कि इनहेको इनक्यूबेटर सॉफ्टवेयर स्थापित है। स्थिति में डिवाइस का उपयोग करने के लिए INHECO1 में टाइप करें, इनक्यूबेट के लिए 1, डिग्री सेल्सियस के लिए 25 और लक्ष्य तापमान के डिग्री सेल्सियस के लिए 5।
  14. शमन की स्थापना
    1. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में लूप स्टेप पर क्लिक करें और चुनिंदा टिप स्टेप के भीतर इसे विधि पर खींचें। कोल को वेरिएबल के रूप में टाइप करें = स्टार्ट के रूप में फर्स्टकॉलम, = अंतिम कॉलम अंत के रूप में और 1 वेतन वृद्धि के रूप में।
    2. लूपके तहत, लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स लोड टिप्स स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। ड्रॉप-डाउन मेनू से BC90 Tips, TL5 स्थान और TL2 बैकअप टिप्स स्थान का चयन करें। सिंगल कॉलम (एस) चुनें और 1में टाइप करें ।
    3. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में चुनिंदा टिप्स एस्पिरेट स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और पुनः एजेंट प्लेट स्थिति का चयन करें। मात्रा = बुझाना,कॉलम 5 और पंक्ति 1पर एस्पिरेट में टाइप करें। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    4. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स डिस्पेंस स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और प्रतिक्रिया प्लेट स्थितिका चयन करें । मात्रा = बुझानामें टाइप करें, कॉलम = कर्नल और पंक्ति 1पर बांटें। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    5. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में चुनिंदा टिप्स अनलोड स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि में खींचें, फिरके भीतर । TR1 के लिए अनलोड टिप्स चुनें।
    6. लूप के अंत के बाद, नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में रन प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। प्रक्रिया कक्षीयका चयन करें ।
    7. सेटअप और डिवाइस स्टेप्स के तहत टूलबार में ठहराव चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। 1 एसके लिए पूरी प्रणाली को थामने ।
    8. सेटअप और डिवाइस स्टेप्स के तहत टूलबार में ठहराव चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। पूरी व्यवस्था को थामने काचयन करें और इस संदेश को प्रदर्शित करें । संदेश में टाइप करें 'सेंट्रलाइज्ड के बाद जारी रखें'।
  15. ऑटोसैंपलर के लिए प्लेट स्थापित करना
    1. नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में यदि चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें, चुनें टिप चरण के भीतर। स्थिति के रूप में ऑटोसैंपलर टाइप करें।
    2. तबके तहत, नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में लूप स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। कोल को वेरिएबल के रूप में टाइप करें = स्टार्ट के रूप में फर्स्टकॉलम, = अंतिम कॉलम अंत के रूप में और 1 वेतन वृद्धि के रूप में।
    3. लूपके तहत, लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स लोड टिप्स स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। ड्रॉप-डाउन मेनू से BC230 टिप्स, TL6 स्थान और TL2 बैकअप टिप्स स्थान का चयन करें। सिंगल कॉलम (एस) चुनें और 1में टाइप करें ।
    4. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में चुनिंदा टिप्स एस्पिरेट स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और पुनः एजेंट प्लेट स्थितिका चयन करें । वॉल्यूम =मोबाइलफेज,कॉलम 6 और पंक्ति 1पर एस्पिरेट में टाइप करें। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    5. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स डिस्पेंस स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि पर खींचें। लैबवेयर टाइप और ऑटोसैंपलर प्लेट पोजीशन Bio_RadPCR96 चुनें। मात्रा में टाइप = मोबाइलफेज,कॉलम = कर्नल और पंक्ति 1पर बांटना । तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    6. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में चुनिंदा टिप्स अनलोड स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि में खींचें, फिरके भीतर । TR1 के लिए अनलोड टिप्स चुनें।
    7. यदि लूप के अंत के बाद, नियंत्रण चरणों के तहत टूलबार में रन प्रक्रिया चरण पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। प्रक्रिया टिपकाउंटका चयन करें।
    8. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स लोड टिप्स स्टेप पर क्लिक करें और इसे विधि पर खींचें। ड्रॉप-डाउन मेनू से BC90 Tips, TL5 स्थान और TL2 बैकअप टिप्स स्थान चुनें। सिंगल कॉलम (एस) चुनें और =टिपकॉलममें टाइप करें।
    9. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स एस्पिरेट स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर विधि पर खींचें। BCDeep96Round Labware प्रकार और प्रतिक्रिया प्लेट स्थितिका चयन करें । मात्रा में टाइप करें = डाइजेस्टट्रांसफर,कॉलम = फर्स्टकॉलम और पंक्ति 1पर एस्पिरेट। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    10. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में सेलेक्ट टिप्स डिस्पेंस स्टेप पर क्लिक करें और लूप के भीतर इसे विधि पर खींचें। लैबवेयर टाइप और ऑटोसैंपलर प्लेट पोजीशन Bio_RadPCR96 चुनें। वॉल्यूम =मोबाइलफेजमें टाइप करें, कॉलम = फर्स्टकॉलम और पंक्ति 1पर बांटें। तकनीक ड्रॉप-डाउन मेनू से एक अनुकूलित तकनीक का चयन करें।
    11. लिक्विड हैंडलिंग स्टेप्स के तहत टूलबार में चुनिंदा टिप्स अनलोड स्टेप पर क्लिक करें और फिर इसे विधिमें खींचें । TR1 के लिए अनलोड टिप्स चुनें। चुनिंदा टिप्स स्टेप यहीं खत्म होता है।
    12. सहेजें और विधि का नाम।

2. नमूना, लैबवेयर, और अभिकर्मक तैयार करें

  1. पूल्ड स्वस्थ मानव प्लाज्मा के 5 μL को पॉलीप्रोपाइलीन, 96-राउंड डीप वेल प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों और आपूर्ति के लिए सामग्री की तालिका देखें। टीपीके इलाज ट्राइप्सिन खरीदा गया था और अनुपात को सब्सट्रेट करने के लिए ट्रिप्सिन और ऊष्मायन समय को विशेष रूप से अनुकूलित किया गया था। यदि ट्राइप्सिन के एक अलग ग्रेड का उपयोग किया जाता है, जैसे अनुक्रम ग्रेड पुनः संयोजन ट्राइप्सिन, एंजाइम को सब्सट्रेस्ट अनुपात और ऊष्मायन समय का परीक्षण और अनुकूलित किया जाना चाहिए।

3. ऑपरेटिंग प्रक्रिया

  1. सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल क्लिक करें।
  2. विधि टैब के तहत, स्वचालित तरल हैंडलर को उन्मुख करने और तैयार करने के लिए होम ऑल एक्स का चयन करें। सुनिश्चित करें कि सभी वर्कस्टेशन सीरिंज में कोई दृश्यमान हवा के बुलबुले नहीं होते हैं।
  3. फाइलके तहत, ओपन चुनें । विधि।
  4. विधि का चयन करें(चित्र 6)।
  5. हरे त्रिकोण के आकार के रन आइकन पर क्लिक करके विधि शुरू करें।
  6. विधि के अंत में एक ऑटोसैंपलर प्लेट तैयार करने के लिए, 'ऑटोसैंपलर' प्रॉम्प्ट के लिए उपयोग करने के लिए एक मूल्य दर्ज करें और फिर ओकेपर क्लिक करें। यदि एक ऑटोसैंपलर प्लेट तैयार नहीं की जा रही है, तो मूल्य 'झूठी' दर्ज करें, और फिर ओकेपर क्लिक करें।
  7. 'firstcolumn' प्रॉम्प्ट के लिए उपयोग करने के लिए एक मूल्य दर्ज करें और फिर ठीकक्लिक करें।
  8. 'लास्टकॉलम' प्रॉम्प्ट के लिए उपयोग करने के लिए एक मूल्य दर्ज करें, और फिर ओकेपर क्लिक करें।
    नोट: यह कदम और चरण ४.७ वर्कस्टेशन को ९६-अच्छी तरह से प्लेट के 12 स्तंभों पर पाचन करने के लिए कहते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्लेट के सभी कुओं का उपयोग पाचन के लिए किया जा रहा है
  9. यदि कम से कम 20 माइक्रोन के नमूना मात्रा के साथ एक नमूना प्लेट का उपयोग किया जा रहा है, तो 'सैंपलप्लेट' त्वरित के लिए उपयोग करने के लिए एक मूल्य दर्ज करें, और फिर ओकेपर क्लिक करें। यदि एक नमूना प्लेट का उपयोग नहीं किया जा रहा है, तो मूल्य 'झूठा' दर्ज करें, और फिर ओकेपर क्लिक करें।
    नोट: यदि एक नमूना प्लेट का उपयोग नहीं किया जा रहा है, तो रिएक्शन प्लेट के प्रत्येक समान कुएं में नमूना के 5 μL जोड़ें।
  10. गाइडेड लैबवेयर सेटअप विंडो में निर्देशों का पालन करें और जारी रखें।
    नोट: अगली खिड़की "रिएजेंट प्लेट" के लिए लेआउट का वर्णन तैयार किया जाना है(चित्रा 7, पूरक तालिका 1)। निम्नलिखित खंडों को 1 एमएल डीप राउंड 96-वेल प्लेट में एक कॉलम के 8 कुओं में से प्रत्येक में बहाया जाएगा:
    कॉलम 1: रिएक्शन मिक्स 1 का 540 माइक्रोन।
    कॉलम 2: साइस्टीन ब्लॉक का 50 माइक्रोन।
    कॉलम 3: रिएक्शन मिक्स 2 का 730 माइक्रोन।
    कॉलम 4: ट्रिप्सिन का 130 माइक्रोन।
    कॉलम 5: शमन समाधान के 130 μL।
    कॉलम 5: मोबाइल चरण समाधान का 1090 माइक्रोन (यदि उपयोगकर्ता चरण 6 में 'सच' में प्रवेश करता है)।
  11. अगले क्लिक करें और निम्नलिखित खिड़की नमूना प्लेट में aliquot ed करने के लिए आवश्यक न्यूनतम मात्रा (20 μL) का वर्णन करता है । यदि उपयोगकर्ता ने नमूना प्लेट (चरण 9) को शामिल करने वाले त्वरित के लिए मूल्य 'झूठा' दर्ज किया है, तो उपयोगकर्ता को रिएक्शन प्लेट में 5 माइक्रोन नमूना जोड़ने के लिए कहा जाएगा।
  12. आगेक्लिक करें ।
    नोट: अगली खिड़की से पता चलता है कि एक खाली 90 μL टिप बॉक्स स्वचालित तरल हैंडलर डेक पर रखा जाना चाहिए।
  13. अगले फिर से क्लिक करें, निर्दिष्ट और सचित्र के रूप में स्वचालित तरल हैंडलर डेक बिछाने(चित्रा 8)रिएजेंट प्लेट, प्रतिक्रिया प्लेट, नमूना प्लेट, Autosampler प्लेट, 6 पूर्ण ९० μL टिप बक्से, एक खाली ९० μL टिप बॉक्स, और एक पूर्ण २३० μL टिप बॉक्स सहित ।
  14. विधि शुरू करने के लिए खत्म पर क्लिक करें।
    नोट: खत्मक्लिक करने के बाद, उपयोगकर्ता स्वचालित तरल हैंडलर में नहीं पहुंच सकता है। इससे मशीन का ' हल्का पर्दा टूट जाएगा ' और सुरक्षा एहतियात के तौर पर लिक्विड हैंडलर को बंद कर देगा ।
  15. केंद्रीकरण के तुरंत बाद जारी रखें, रिएक्शन प्लेट को पुनः प्राप्त करें और इसे 3,000 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्री करें।
  16. केंद्रीकरण पूरा होने के बाद, प्रतिक्रिया प्लेट को स्वचालित तरल हैंडलर को उस स्थिति में लौटा दें जो केंद्रीकरण से पहले थी, और जारी रखें।
    नोट: विधि पूरी होने पर स्वचालित तरल हैंडलर फिर से बंद हो जाएगा। यदि उपयोगकर्ता ने चरण 6 के लिए 'ट्रू' में प्रवेश किया, तो ऑटोसैंपलर प्लेट को वर्कस्टेशन से हटाया जा सकता है और विश्लेषण के लिए तरल क्रोमेटोग्राफी इंस्ट्रूमेंट के ऑटोसैंपलर में रखा जा सकता है।

4. एलसी-एमएसएमएस

  1. एक उच्च प्रवाह एचपीएलसी पर पेप्टाइड्स को हल करें जिसमें सी18 2.1 मिमी x 100 मिमी, 0.25 मीटर/मिन की प्रवाह दर के साथ 3.5 माइक्रोन कॉलम शामिल है और ट्रिपल क्वारुपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर पर इनलाइन का विश्लेषण किया गया है।
    नोट: पेप्टाइड पाचन के बाद, रोबोटिक तैयार नमूनों से पेप्टाइड्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए लक्षित एलसी-एमएसएमएस विधि को एलसी-एमएसएमएस के संक्षिप्त विवरण के बाद विस्तारसे वर्णित किया गया है।
  2. कॉलम ओवन तापमान को 40 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। दो मोबाइल चरणों के रूप में बफर ए (2% एसीएन, 98% पानी, 0.1% फोरमिक एसिड) और बफर बी (95% एसीएन, 5% पानी, 0.1% फोरमिक एसिड) का उपयोग करें।
  3. लोडिंग के बाद 5 मिनट के लिए 5% बी के साथ कॉलम को समतुल्य करें। 30 मिनट से अधिक पेप्टाइड्स को एक रैखिक 5% से 35% बफर बी के ढाल के साथ एलुट करें।
    1. 10 मिनट के लिए 98% बी के साथ धोने और फिर 5% बी के साथ 5 मिनट के लिए अगले नमूना लोड करने से पहले कॉलम को रीसायकल कर दें।
    2. ऑन-लाइन डायवर्जन के लिए, दो चरण स्विचिंग वाल्व का उपयोग करके आयन स्रोत में प्रवेश करने से पहले कचरे के लिए पोस्ट-कॉलम एल्यूंट को डायवर्ट करें।
  4. एमआरएम डेटा प्रोसेस करें।

Representative Results

स्वचालित वर्कस्टेशन पर स्वचालित प्रोटेओमिक्स नमूना तैयारी कार्यप्रवाह को हमारे पिछले स्वचालित प्रोटोकॉल से एक मजबूत एलसी-एसआरएम-एमएस अधिग्रहण विधि1 के साथ एल्बुमिन, चयनित प्लाज्मा प्रोटीन, और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए उपयोग किए जाने वाले एक एक्सोजेनस प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया गया था। प्रसंस्करण के बाद, नमूनों को सीरम एल्बुमिन, ए-गैलेक्टोसिडास को लक्षित करने वाली एसआरएम परख में ट्रिपल क्वाड्रपोल एलसी-एमएस पर चलाया गया। प्रत्येक संक्रमण के लिए एसआरएम सिग्नल के भिन्नता (सीवी) के गुणांक का उपयोग स्वचालित पाचन प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता की निगरानी के लिए किया गया था।

हमने 2 घंटे के ऑन-डेक-इनक्यूबेटर ट्राइप्सिन इन्क्यूबेशन के साथ 5 माइक्रोन प्लाज्मा नमूनों के पाचन के लिए रिएजेंट अतिरिक्त और मिश्रण चरणों को स्वचालित किया। प्रजनन क्षमता का निर्धारण करने के लिए, प्लाज्मा पूल के 5 μL को मल्टीचैनल हेड (96 पिन) के साथ रिएक्शन प्लेट के कई कुओं में पाइप किया गया था। स्थिरता के लिए निगरानी करने के लिए, हमने कमी और एल्किलेशन प्रतिक्रियाओं से पहले एक-लड़की प्रोटीन जोड़ा। स्वचालित प्रोटेओमिक्स नमूना तैयारी कार्यप्रवाह का परीक्षण एक मजबूत एलसी-एसआरएम-एमएस अधिग्रहण विधि के साथ किया गया था जिसमें एल्बुमिन, उच्चतम बहुतायत प्लाज्मा प्रोटीन और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए उपयोग किए जाने वाले उच्चतम बहुतायत प्लाज्मा प्रोटीन और एक-लड़की प्रोटीन शामिल हैं। तीन-गल पेप्टाइड्स और दो एल्बुमिन पेप्टाइड्स को प्रोसेस्ड प्लाज्मा एल्बुमिन प्रोटीन और नुकीला-गल प्रोटीन(टेबल 4)से निगरानी की गई थी।

समय बचाने और प्रक्रिया को सरल बनाने के प्रयास में, हमने वर्कस्टेशन के साथ रिएजेंट और प्रतिक्रिया मिश्रण को जोड़ने/मिलाने/इनक्यूबेशन के तरल हस्तांतरण कदमों को नौ चरण के कार्यप्रवाह से छह कदम के कार्यप्रवाह(चित्रा 1)तक कम कर दिया । कुल प्रोटेओमिक कार्यप्रवाह में दो प्रायोगिक घटक शामिल थे: स्वचालित नमूना तैयारी और एलसी-एमएस/एमएस । सबसे पहले, हमने ऑटोसैंपलर प्लेट के एक ही पाचन कुएं से लगातार आठ इंजेक्शन द्वारा एलसी-एमएस/एमएस एसआरएम डेटा अधिग्रहण की सटीकता का मूल्यांकन किया । स्वचालित नमूना तैयारी कार्यप्रवाह की सटीकता की गणना एलसी-एमएस/एमएस(चित्रा 9बी)के कुल प्रोटेओमिक एसआरएम वर्कफ्लो माइनस% सीवी के विचरण (% सीवी) के गुणांक के प्रतिशत से की गई थी। स्वचालित वर्कस्टेशन पर सुव्यवस्थित प्लाज्मा पाचन प्रक्रिया के साथ, स्वचालित नमूनों की तैयारी की प्रायोगिक परिशुद्धता एक्सोजेनस नुकीला-गल प्रोटीन (औसत के रूप में 10.0%) के लिए 11.4% से कम थी, और सबसे प्रचुर मात्रा में मानव सीरम एल्बुमिन (औसत के रूप में 9.9%)(चित्रा 9)के लिए 14.9% से कम थी। मानव सीरम एल्बुमिन और उम्मीद के अनुसार लड़की प्रोटीन दोनों के लिए अच्छी सिग्नल तीव्रता देखी गई(चित्र 9सी)।

प्रत्येक पाइपिंग और तरल स्थानांतरित करने के कदम के लिए, तकनीकों को विशेष रूप से अनुकूलित किया गया था। तरल हस्तांतरण चरणों की सटीकता की निगरानी के लिए, हमने तीन स्वतंत्र रिएजेंट स्थानांतरित करने वाले चरणों में एंडोजेनस ह्यूमन सीरम एल्बुमिन प्रोटीन और एक्सोजेनस-गल प्रोटीन के लिए स्थिर आइसोटोप-लेबल (एसवाईएल) पेप्टाइड मानकों को नुकीला किया: रिएक्शन मिक्स 1, साइस्टीन ब्लॉकर, और रिएक्शन मिक्स 2(चित्रा 10)। स्वचालित तरल हस्तांतरण कदम की सटीकता की निगरानी के लिए इन पांच एसवाईएल पेप्टाइड्स से एमआरएम संकेतों का अधिग्रहण किया गया था। पेप्टाइड्स, डीडीएनपीएनएलपीआर ^, और जीडीएफक्यूएफएनआईएसआर के लिए औसत % सीवी ^ (^ रिएक्शन मिक्स 1 चरण से 1.8% से लेकर 11.2% तक N15 लेबल अमीनो एसिड का प्रतिनिधित्व करता है) । साइस्टीन ब्लॉकर चरण से एक पेप्टाइड (IDPNAWVER^) का औसत% सीवी 6.6 से 8.8% तक था। दो पेप्टाइड्स (WVGYGQDSR^ और LVNEVTEFAK^) का औसत % सीवी 6.2% से लेकर 11.9%(चित्रा 10)तक था।

स्वचालित प्रोटेओमिक्स नमूना तैयारी कार्यप्रवाह को मान्य करने के लिए, हमने मानव सीरम एल्बुमिन, एक्सोजेनस ए-गल और 40 अतिरिक्त प्लाज्मा प्रोटीन के लिए कई प्रोटीन और कई दिनों में प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन किया। हमने 21 दोहराने वाले नमूनों (सामान्य मानव प्लाज्मा को पूल किया), तीन अलग-अलग दिनों में चित्रा 11एमें दिखाया गया स्थान। इंट्रा-डे सीवी की गणना उसी दिन तैयार किए गए 21 कुओं से की गई थी। 40 प्रोटीन के लिए मतलब इंट्रा-डे% सीवी 4% - 20%(चित्रा 11बी)से लेकर। प्लेट आधारित स्वचालित कार्यप्रवाह के किनारे प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, % सीवी की गणना नामित स्तंभों और पंक्तियों के भीतर विशिष्ट कुओं से की गई थी (कॉलम और पंक्ति मानचित्र के लिएचित्र 12ए चित्रा)। एमआरएम संकेतों की तीव्रता सभी कॉलम और पंक्ति विन्यास में 3% - 22%(चित्रा 12बी)से लेकर % सीवी के समान थी।

सारांश में, अनुकूलित स्वचालित कार्यप्रवाह उत्कृष्ट प्रयोगात्मक परिशुद्धता के साथ पांच घंटे से भी कम समय में 96 समान रूप से संसाधित नमूने पैदा करता है। एक स्वचालित कार्यप्रवाह के साथ अनुकूलता के लिए, हमने उन अभिकर्मकों का चयन किया जिनके पास नगण्य गैर-विशिष्ट दुष्प्रभाव हैं, परिवेश प्रकाश में स्थिर हैं, एलसी-एमएस/एमएस के अनुकूल हैं, और जमे हुए एलिकोट्स के रूप में संग्रहीत किए जा सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: नमूना तैयारी कार्यप्रवाह की स्कीमा। मुख्य 6 तरल स्थानांतरित करने वाले कदम सूचीबद्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: टिप लोडिंग स्क्रिप्ट। वीबी स्क्रिप्ट विवरण यहां में दिखाया गया है । स्क्रिप्ट टिप लोडिंग की स्थिति निर्दिष्ट करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: स्वचालित वर्कस्टेशन डेक लेआउट। डेक में 1x1 एएलपी, टिप लोडिंग एएलपी, ट्रैश, टिप वॉश, पेल्टियर और एक इनक्यूबेटर शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अभिकर्मक प्लेट के गुण। गाइडेड लैबवेयर सेटअप का उपयोग करके एक्सेस किए जाने पर रिएजेंट प्लेट लैबवेयर के लिए आवश्यक गुण दिखाए गए हैं। इसी कॉलम का चयन करें और आंकड़े में इंगित के रूप में चर में टाइप करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: टिप गिनती स्क्रिप्ट। यह स्क्रिप्ट डेक पर सुझावों की संख्या का ट्रैक रखने में मदद करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: प्लाज्मा नमूनों को पचाने और एलिकोट करने के लिए विधि का अवलोकन। तरल हैंडलर की विधि में अभिकर्मक गणना, लैबवेयर सेटअप और तरल जोड़तोड़ के लिए कदम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: अभिकर्मक प्लेट का लेआउट। दिखाया गया है कि प्लाज्मा पाचन और ऑटोसैंपलर तैयार करने के लिए आवश्यक रासायनिक अभिकर्मक हैं और रिएजेंट प्लेट लैबवेयर में वितरित किए जाते हैं। इस आंकड़े को तकनीकी नोट10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: स्वचालित वर्कस्टेशन के डेक पर लैबवेयर के लिए लेआउट। दिखाया गया है कि तरल हैंडलर के लिए प्लाज्मा पाचन विधि के लिए डेक लेआउट है। इस आंकड़े को तकनीकी नोट10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: कुल प्रोटेओमिक कार्यप्रवाह की सटीकता वर्कस्टेशन सीवी और लक्षित एलसी एमएस/एमएस सीवी शामिल है ।
प्रत्येक पेप्टाइड के लिए क्रोमेटोग्राम और पेप्टाइड प्रतिधारण समय(ए),सटीक 30 कुओं/नमूनों प्रसंस्करण प्रतिनिधि प्रयोग, कुल प्रोटेओमिक वर्कफ्लो के लिए सीवी%, एलसी एमएस/एमएस विश्लेषण और स्वचालित नमूना प्रसंस्करण की गणना(बी)से पांच पेप्टाइड्स की गणना की गई थी । कुल मिलाकर, पचा पेप्टाइड्स ने 1x105 से लेकर 1x108तक अच्छे संकेत दिखाए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: तरल हस्तांतरण कदम के लिए परिशुद्धता का निर्धारण । सिंथेटिक पेप्टाइड्स कदम विशिष्ट अभिकर्मकों में नुकीला थे, और स्वचालित तरल हस्तांतरण कुल% सीवी द्वारा निर्धारित किया गया था। 30 कुओं/नमूनों से प्रयोग माइनस% सीवी एलसी एमएसएमएस (8 द्वारा निर्धारित एलसी एमएसएमएस इंजेक्शन दोहराएं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11: 42 प्रोटीन एमआरएम विश्लेषण के साथ स्वचालित प्रोटेओमिक नमूना तैयारी कार्यप्रवाह की बहु-दिवसीय प्रजनन क्षमता। (A)तीन दिनों में से प्रत्येक के लिए रिएक्शन प्लेट मैप यहां दिखाया गया है, 21 कुओं में से प्रत्येक में 5 माइक्रोनप्लाज जोड़ा गया था । 3 कुओं को मिला 5 उल पानी का इस्तेमाल निगेटिव/ब्लैंक कंट्रोल के तौर पर किया जाता था। (ख)190 संक्रमणों की औसत तीव्रता में 75 पेप्टाइड्स और 42 प्रोटीन (बाएं) और प्रत्येक एमआरएम संक्रमण के लिए% सीवी शामिल हैं, प्रत्येक दिन (दाएं) के लिए 21 कुओं से गणना की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 12
चित्रा 12: कुओं के विशिष्ट स्थानों की पुन: उत्पादन (कॉलम और पंक्तियों की स्थिति)। (A)प्लेट मैप के साथ कॉलम और पंक्तियों का स्थान यहां दिखाया गया है। (ख)कॉलम और पंक्ति स्थान एक ही प्लेट पाचन से निर्दिष्ट कुओं (बाएं) और सीवी% (दाएं) से औसत तीव्रता के विशिष्ट एमआरएम संकेत । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 13
चित्रा 13: तकनीक संपादक के स्क्रीन शॉट । प्रत्येक पाइपटिंग टेम्पलेट के लिए, तरल स्तर संवेदन, थक्का पता लगाने, पियर्सिंग, तरल प्रकार, जनरल, एस्पिरेट, डिस्पेंस, मिक्स और कैलिब्रेशन के गुणों को परिभाषित करें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले टेम्पलेट और तकनीकों को पूरक तालिका 2में दिखाया गया है) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चर चर मान विवरण
ऑटोसैंपलर बूलियन सच ऑटोसैंपलर का उपयोग करें
बेटागल पूर्णांक 5 बेतगल मात्रा
बीजी1 पूर्णांक 0.8 BG1 वॉल्यूम
बीजी2 पूर्णांक 0.8 BG2 वॉल्यूम
बीजी3 पूर्णांक 0.8 बीजी3 वॉल्यूम
साइस्टीनब्लॉकर पूर्णांक 1.25 साइस्टीन अवरोधक मात्रा
साइस्टीनबफर पूर्णांक 0.45 साइस्टीन बफर वॉल्यूम
डेनाटुरेंट पूर्णांक 5 डेनाटुरेंट वॉल्यूम
डाइजेस्टट्रांसफर पूर्णांक 10 डाइजेस्ट ट्रांसफर वॉल्यूम
पहला बफर पूर्णांक 25.9 पहला बफर वॉल्यूम
पहला कॉलम पूर्णांक 1 पहला कॉलम
एचएसए1 पूर्णांक 0.8 एचएसए1 वॉल्यूम
एचएसए2 पूर्णांक 0.8 एचएसए2 वॉल्यूम
अंतिम स्तंभ पूर्णांक 12 अंतिम कॉलम
मोबाइलफेज पूर्णांक 90 मोबाइल चरण की मात्रा
बुझाने पूर्णांक 10 शमन कॉलम
एजेंट को कम करना पूर्णांक 5 एजेंट कॉलम को कम करना
नमूना पूर्णांक 5 नमूना कॉलम
सैंपलप्लेट बूलियन सच नमूना प्लेट का उपयोग करें
दूसरा बफर पूर्णांक 58.4 दूसरा बफर वॉल्यूम
ट्रिप्सिन पूर्णांक 10 ट्रिप्सिन कॉलम

तालिका 1: चरण चर शुरू करें

मान चर
= Firstबफर +Denaturant +कम करने वाला एजेंट +बेटागल +BG1+HSA1 फर्स्टमिक्स
= साइस्टीनब्लॉकर + साइस्टीनबफर +BG2 साइस्टीनमिक्स
=Secondबफर+BG3+HSA2 सेकेंड मिक्स
=(FirstMix*Columns) +30 फर्स्टमिक्सवेल
= (साइस्टीनमिक्स *कॉलम) + 20 साइस्टीनवेल
=(SecondMix*Columns) +10 सेकेंड मिक्सवेल
=(ट्रिप्सिन *कॉलम) + 10 ट्रिप्सिनवेल
=(बुझाना *कॉलम) + 10 शमनवेल
=(firstMixWell *8) + 100 फर्स्टमिक्सस्टॉक
= साइस्टीनवेल * 8 +20 साइस्टीनमिक्सस्टॉक
=(SecondMixWell*8) + 100 सेकेंडमिक्सस्टॉक

तालिका 2: वॉल्यूम मिक्स वेरिएबल्स

प्रकार नाम स्थिति गहराई गुण उपयोग?
बीसीदीप96राउंड रिएजेंट प्लेट पी5 1 (शीर्ष) # =नहीं सैंपलप्लेट
बीसीदीप96राउंड रिएजेंट प्लेट पी5 1 (शीर्ष) # =सैंपलप्लेट
बीसीदीप96राउंड रिएक्शन प्लेट P11 1 (शीर्ष) सच
Bio_RadPCR96* नमूने पी9 1 (शीर्ष) =सैंपलप्लेट
Bio_RadPCR96* ऑटोसैंपलर प्लेट पी10 1 (शीर्ष) = ऑटोसैंपलर
बीसी90 खाली 1 (शीर्ष) सच
बीसी90 1 (शीर्ष) सच
बीसी90 1 (शीर्ष) सच
बीसी230 1 (शीर्ष) = ऑटोसैंपलर
बीसी90 1 (शीर्ष) =कॉलम>1
बीसी90 1 (शीर्ष) =कॉलम एंड जीटी;3
बीसी90 1 (शीर्ष) =कॉलम एंड जीटी;5
बीसी90 1 (शीर्ष) =कॉलम एंड जीटी;7
बीसी90 1 (शीर्ष) =कॉलम>9
नोट:
*: 96 अच्छी तरह से बायो-रेड प्लेट से मेल खाती है।
#: गुणों पर क्लिक करें और फिर मात्रा चर दर्ज करें जैसा कि चित्र6 में इंगित किया गया है।

तालिका 3: निर्देशित सेटअप की स्थापना

प्रोटीन आईडी पेप्टाइड अनुक्रम Q1 मास (डीए) Q3 मास (डीए) समय (मिन) टुकड़ा आयन विक्लस्टरिंग क्षमता टकराव ऊर्जा टकराव सेल से बाहर निकलने की क्षमता
एसपी। P00722। BGAL_ELOCI जीडीएफक्यूएफएनआईएसआर 542.3 262.1 19.7 +2y2 61 21 8
542.3 636 19.7 +2y5 61 25 12
542.3 764.2 19.7 +2y6 61 25 18
आईडीपीएनवीवर 550.3 436.1 18.1 +2y7+2 61 23 8
550.3 871.2 18.1 +2y7 61 25 18
550.3 774.2 18.1 +2y6 61 33 8
WVGYGQDSR 534.3 782.1 12.1 +2y7 51 25 6
534.3 562.1 12.1 +2y5 51 27 6
534.2 505.2 12.1 +2y4 90 25 8
एसपी। P02768। ALBU_HUMAN डीडीएनपीएनएलपीआर 470.8 596.2 9.2 +2y5 61 27 16
470.8 499.3 9.2 +2y4 61 27 18
470.8 710.4 9.2 +2y6 61 27 18
LVNEVTEFAK 575.3 694.4 18.2 +2y6 73.1 29.6 18
575.3 937.5 18.2 +2y8 73.1 29.6 18
575.3 823.4 18.2 +2y7 73.1 29.6 18

तालिका 4: एमआरएम पैरामीटर

पूरक तालिका 1: रिएजेंट प्लेट कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 2: प्रोटोकॉल टेम्पलेट कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना प्रसंस्करण के लिए प्रोटीन डेनाटुरिशन, कमी और एल्किलेशन की आवश्यकता होती है ताकि सिस्टीन को अवरुद्ध किया जा सके, और पेप्टाइड्स में प्रोटीन को क्लीव करने के लिए ट्राइप्सिन पाचन होता है। प्रत्येक रासायनिक या एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को एक निर्धारित समय पर शुरू करने और नियंत्रित तापमान पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है, और इस प्रक्रिया में हर कदम में कई तरल हस्तांतरण कदम शामिल हैं जहां प्रयोगात्मक भिन्नता शुरू की जा सकती है। स्वचालित नमूना प्रसंस्करण इस दुविधा का समाधान प्रदान करता है। वर्तमान में उपलब्ध तरल हैंडलिंग सिस्टम में अभिकर्मकों को 96-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित करने की क्षमता है, जो सिर और टिप प्रकार के आधार पर उपयोग की जाती है, और 14 डिग्री सेल्सियस से लेकर 70 डिग्री सेल्सियस तक नियंत्रित तापमान के तहत, यदि वांछित हो तो मिलाते हुए नमूनों को इनक्यूबेट करने के लिए। हम एक स्वचालित तरल हैंडलर का इस्तेमाल किया एक ९६ अच्छी तरह से प्रारूप में एसआरएम परख के लिए प्लाज्मा प्रक्रिया ।

सीरम, प्लाज्मा और अन्य जैविक नमूनों में प्रोटीन के जटिल मिश्रण के भीतर कई हजारों प्रोटीज़ दरार साइटें हैं; और इनमें से प्रत्येक प्रोटीन में दरार साइट पहुंच और परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स की स्थिरता को प्रभावित करने वाले अद्वितीय गुण होते हैं। इसलिए, एक नमूना प्रसंस्करण प्रक्रिया डिजाइन करना असंभव है जो हर प्रोटीन के लिए इष्टतम है। सबसे अच्छा विकल्प के रूप में संभव के रूप में सुसंगत होना है ।

स्थिरता प्राप्त करने के लिए, हमने स्वचालित तरल हैंडलर द्वारा किए गए प्रत्येक पाइपटिंग चरण को अनुकूलित किया। हमने पहली बार तरल के प्रकार (प्लाज्मा, जलीय, या कार्बनिक) और इसी गुणों (चिपचिपाहट, सामंजस्य और अस्थिरता), हार्डवेयर (वर्कस्टेशन पाइपिंग-हेड और प्लेट हथियाने वाली बाहों) और लैबवेयर द्वारा लगाई गई मात्रा और बाधाओं पर विचार किया। हम तो गति और आकांक्षा के लिए हवा अंतर पीछे, गति और वितरण के लिए दरार मात्रा, और बल और मिश्रण की अवधि के लिए, जबकि आकांक्षा के बादFigure 13एक टिप Supplemental Table 1स्पर्श को शामिल करने और/ स्थिरता के लिए पूर्व-जांच की गई एक अद्वितीय एसवाईएल पेप्टाइड को प्रत्येक रिएजेंट में नुकीला किया गया था ताकि प्रत्येक तरल हैंडलिंग चरण की सटीकता की निगरानी करना संभव हो सके। अनुकूलन के बाद, अधिकांश संक्रमणों के लिए प्रक्रिया सीवी 10% से कम थी, स्वचालित वर्कस्टेशन के साथ अच्छी प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन करते हुए(चित्रा 9, चित्रा 10, चित्रा 11 और चित्रा 12)।

यहां प्रस्तुत स्वचालित कार्यप्रवाह में बेहतर प्रजनन क्षमता और मैनुअल तरीकों की तुलना में थ्रूपुट के साथ लगातार एंजाइमैटिक पाचन की व्यवस्था की गई है(चित्र 9, चित्रा 10)। यह दृष्टिकोण बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बायोमार्कर खोज और सत्यापन की सटीकता और विश्वसनीयता में सुधार करने का वादा करता है।

Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

कोई नहीं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A Pooled healthy human plasma Bioreclamation Inc. human plasma tested in the manuscript
Acetonitrile, HPLC Grade Thermo Fisher Scientific A998SK1 LC MS/MS solvent
B-Galactosidase Recombinant from E.Coli Sigma-Aldrich G3153-5MG exogenous control proteins.
Biomek i7 Automated Workstation Beckman Coulter, Inc. The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions
Biomek i-Series Tips 230µL Non-Sterile Beckman Coulter, Inc. B85903  Tips, i7 consumable
Biomek i-Series Tips 90µL Non-Sterile Beckman Coulter, Inc. B85881  Tips, i7 consumable
FG, Kit Trypsin TPCK Sciex 4445250 Trypsin used in digestion
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear  Bio-Rad #hsp9641 Autosampler plate
Octyl B-D-Glucopyranoside Sigma-Aldrich O9882-5G detergent used in digestion
Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile Beckman Coulter, Inc. 267007 Reagent and digestion plate
Prominence UFLCXR HPLC system Shimadzu, Japan High flow LC sytem
QTRAP 6500 SCIEX Mass spectrometer
Water, HPLC Grade Thermo Fisher Scientific W54 LC MS/MS solvent
Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm Waters 186003564 LC MSMS column

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References

  1. Fu, Q., et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  2. Lehmann, S., et al. Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold? Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).
  3. Abbatiello, S. E., et al. Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).
  4. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).
  5. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
  6. Yates, J. R. 3rd Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).
  7. Nilsson, T., et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).
  8. Van Eyk, J. E., Sobhani, K. Precision Medicine. Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).
  9. Hoofnagle, A. N., et al. Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays. Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).
  10. Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series. Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू 158 लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-टैंडेममास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी/एमएस/एमएस) लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-चुनिंदा रिएक्शन मॉनिटरिंग (एलसी-एसआरएम) ऑटोमेशन प्रोटीन सैंपल तैयार करना रिप्रोजिबिलिटी हाई थ्रूपुट
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Fu, Q., Johnson, C. W.,… More

Fu, Q., Johnson, C. W., Wijayawardena, B. K., Kowalski, M. P., Kheradmand, M., Van Eyk, J. E. A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation. J. Vis. Exp. (158), e59842, doi:10.3791/59842 (2020).

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