Summary
Här presenterar vi en automatiserad plasma protein matsmältningsmetod för massa spectrometri-baserade kvantitativa proteomisk analys. I detta protokoll, vätskan överföra och inkubation steg för protein denaturering, minskning, alkylering, och trypsin matsmältning reaktioner effektiviseras och automatiseras. Det tar cirka fem timmar att förbereda en 96-brunnsplatta med önskad precision.
Abstract
Provberedning för masspektrometrianalys i proteomik kräver enzymatisk klyvning av proteiner i en peptidblandning. Denna process innebär många inkubation och vätskeöverföring steg för att uppnå denaturering, minskning, alkylering och klyvning. Genom att anpassa arbetsflödet till en automatiserad arbetsstation kan effektiviteten ökas och varianskoefficienterna minskas, vilket ger mer tillförlitliga data för statistiska jämförelser mellan exempeltyper. Vi har tidigare beskrivit ett automatiskt arbetsflöde för förberedelse av proteomiska prov1. Här rapporterar vi utvecklingen av ett effektivare och bättre kontrollerat arbetsflöde med följande fördelar: 1) Antalet vätskeöverföringssteg minskas från nio till sex genom att kombinera reagenser; 2) Pipetteringstiden reduceras genom selektiv spets pipettering med hjälp av ett 96-läges pipetterande huvud med flera kanaler; 3) Potentiell genomströmning ökar genom tillgången på upp till 45 däck positioner; 4) Fullständig inneslutning av systemet ger förbättrad temperatur- och miljökontroll och minskar risken för kontaminering av prover eller reagenser; och 5) Tillsats av stabila isotop märkta peptider, samt β-galactosidase protein, till varje prov gör övervakning och kvalitetskontroll möjligt under hela processen. Dessa maskinvaru- och processförbättringar ger god reproducerbarhet och förbättrar precisionen inom analysen och analysens precision (CV på mindre än 20 %) LC-MS-baserade protein- och peptidkvantifiering. Hela arbetsflödet för att smälta 96 prover i en 96-brunnsplatta kan slutföras på cirka 5 timmar.
Introduction
Masspektrometri (MS) -baserade protein och peptid kvantifiering alltmer tillämpas som ett bioanalytiskt verktyg för plasmaanalys i grundforskning och kliniska laboratorier2,3. Den nödvändiga instrumenteringen och informatiken har utvecklats snabbt eftersom MS har blivit den metod som krävs för att kvantifiera proteiner eller modifierade proteiner genom att rikta in sig på specifika peptidsekvenser på grund av dess förmåga att kvantifiera hundratals peptider i en enda MS-körning4. Provberedningen är grunden för all proteomisk analys. Före MS-analys, proteinerna i ett biologiskt prov är vanligtvis denatureras, minskas, alkyleras, rötas till tryptiska peptider, och avsaltade5. Alkylering blockerar cysteiner för att förhindra okontrollerade modifieringar och se till att alla cysteiner har samma massa. Därefter tillsätts trypsin för att smälta proteiner i peptider. Vart och ett av dessa steg kräver optimering, och hela processen utförs traditionellt manuellt, vilket möjliggör införandet av analytiska fel.
Den traditionella biomarkörutvecklingspipelinen består av två huvudprocesser: hagelgevärsproteomik för global proteinupptäckt för att skapa en djupgående proteininventering6 och riktad proteomik för verifiering och validering som syftar till proteinkvantiteter med hög precision och hög genomströmning7. Oavsett MS-metoden, provberedning är densamma och kretsar kring enzymatisk klyvning av proteiner i en peptid blandning. Som föreslagits av Van Eyk och Sobhani8, med en metod som möjliggör korrekt, exakt och reproducerbar analys för både upptäckt och riktade analyser är önskvärt att effektivt flytta upptäckt biomarkörer till kliniska genomförda analyser. För att göra detta kommer automatisering av provberedning vara till hjälp och ge möjlighet att öka effektiviteten till hög genomströmningsanalys. Manuella metoder introducerar vanligtvis analytiska fel utöver godtagbara gränser som anges av Food and Drug Administration (FDA) i den reviderade bioanalytiska metodvalideringsvägledningen, som omfattar biomarkörer och diagnostik2,9. Utvecklingen av en snabb, mycket exakt, och handsfree MS protein prov förberedelse arbetsflöde kommer att vara nödvändigt att underlätta biomarkör forskning, vilket kräver att förbereda och analysera tusentals biologiska prover. MS provberedning har många steg där fel kan införas, och processen är tråkig och tidskrävande.
I vår förbättrade metod, en automatiserad arbetsstation programmerades för att utföra alla nödvändiga plasmaprov beredning förfaranden i totalt 6 steg(figur 1) för att säkerställa: 1) korrekta vätskeöverföringar; 2) reaktionen initieras och stoppas vid en konsekvent tidpunkt; 3) reaktionen utförs vid en kontrollerad temperatur (dvs. inkubator); och 4) reaktionen har jämn blandning för alla reaktioner. Vi implementerade också lägger till exogena kvalitetskontrollproteiner och interna standarder (stabila isotopmärkta peptidstandarder) för att säkerställa en kvalitet och reproducerbar genomströmning av LC-MS-baserade protein- och peptidkvantifiering i ett 96-brunnsformat. Inklusive reagensberedning, arbetstid och totalt 1 000 000 pipetteringssteg skulle krävas för att bearbeta 96 prover i enskilda rör. Automatisering minskar praktisk tid och antalet mänskliga interaktioner inblandade.
Protocol
1. Programmering för den automatiska vätskehanterare
- Skapa en ny metod från Arkiv-menyn (Arkiv | Ny metod)
Obs: Fyll i stegen i den angivna ordningen. Det kursivstil som beskriver text som ska skrivas in i Biomek-programvaran. Kontakta författarna för information om pipetteringstekniker och mallar. - Skriv stegvariabler för start och deras värden i startsteget enligt tabell 1.
- Ange kolumner för selektiv spets pipettering. Klicka på steget Ange globalt i verktygsfältet under Kontrollsteg för stegen 1.3-1.7.
- Med steget Ange globalt anger du värde =FirstColumn till variabeln FirstColumn_Global, värde =LastColumn till variabeln LastColumn_Global, värde =LastColumn-FirstColumn+1 till variabelkolumneroch värde =Kolumner*8 till variabelbrunnar.
- Markera skriptsteget i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden. Skriv VB-skriptet enligt figur 2.
- Ställa in volymer för mixar Set Global och lösningar.
- Med steget Ange global anger du motsvarande värden till volymmixvariablerna enligt tabell 2.
- Klicka på steget Om i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden. Skriv Autosamplerunder förhållanden .
- Klicka Thensedan på steget Ange globalt i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden.
- Med steget Ange globalt anger du värde =(MobilePhase*Kolumner)+10 till variabel MobilePhaseWell.
- Klicka på steget Ange globalt i verktygsfältet under Kontrollsteg under Annarsoch dra det till metoden.
- Med steget Ange globalt anger du värde =0 till variabel MobilePhaseWell
- Konfigurera inställningar för guidad labbprogram (GLS)
- Klicka på steg för deckarredigeraren i verktygsfältet under Verktyg. Skapa ett nytt däck för att motsvara däckets layout i figur 3 och märk det som däck 1.
- Klicka på steget Guidad installation i verktygsfältet under Installation och enhet och dra det till metoden. Dra och släpp labware typer i däck positioner som anges i tabell 3. Därefter fyller du flikarna i tabellen enligt tabell 3 och bild 4 (Ställa in den guidade inställningen).
- Ställa in proceduren för tipsräkning
- Klicka på steget Definiera procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden. Namnprocedur som TipCount.
- Klicka på skriptsteget i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden. Skriv VB-skriptet enligt figur 5 (Tips counting script).
- Klicka på steget Om i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden.
- Under förhållanden, typ TL5 = 0.
- Klicka Thensedan på steget Flytta labware i verktygsfältet under Installations- och enhetssteg och dra det till metoden. Flytta labware från TL5 till TR3. Klicka på steget Flytta labware i verktygsfältet under Inställningar och Enhetssteg och dra det till metoden. Flytta labware från TL2 till TL5. Klicka slutligen på steget Flytta labware i verktygsfältet under Installations- och enhetssteg och dra det till metoden. Flytta labware från BC90 till TL2.
- Definiera förfarande för inkubator
- Klicka på steget Definiera procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden. Namnprocedur som inkubator.
- Skriv in HalfTime som variabelnamn och 1800 som standardvärde.
- Skriv in NextTemp som variabelnamn och 22 som standardvärde.
- Skriv in temp som variabelnamn och 60 som standardvärde.
- Klicka på steget Utökad flyttlabbmaterial i verktygsfältet under Installations- och enhetssteg och dra det till metoden. Flytta labware från P11 till INHECO1.
- Klicka på steget Kör procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden. Namnprocedur som TipCount.
- Klicka på inheco-inkubera-steget i verktygsfältet under Integrationer och dra det till metoden. Skriv in INHECO1 för användning av enheten på plats, =Halvtid för inkubera för, =Temp för °C och 3 för °C för måltemperatur. Välj shake medan du ruvar och omloppsbanor (medurs)skakstil. För inställningar skriver du in 1,00 mm sida till sida, 6,6 gånger per sekund, 1,00 mm framåt och 6,6 gånger per sekund.
SE TILL att INHECO-inkubatorprogramvaran är installerad. - Klicka på inheco-inkubera-steget i verktygsfältet under Integrationer och dra det till metoden. Skriv in INHECO1 för användning av enheten på plats, =Halvtid för inkubera för, =Temp för °C och 3 för °C för måltemperatur. Välj shake medan du ruvar och omloppsbanor (moturs)skakstil. För inställningar, skriv in 1,00 mm sida till sida, 6,6 gånger per sekund, 1,00 mm framåt och bakåt vid 6,6 gånger i sekunden.
- Klicka på steget Pausa i verktygsfältet under Installation och enhetssteg och dra det till metoden. Pausa hela systemet i 1 s.
- Klicka på steget Definiera procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden. Namnprocedur som inkubator.
- Klicka på inheco-inkubera-steget i verktygsfältet under Integrationer och dra det till metoden. Skriv in INHECO1 för användning av enheten på plats, 1 för inkubera för, =NextTemp för °C och 3 för °C för måltemperatur.
- Definiera procedur för Orbital.
- Klicka på steget Utökad flyttlabbmaterial i verktygsfältet under Installations- och enhetssteg och dra det till metoden. Flytta labware från P11 till Orbital1.
- Klicka på steget Kör procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden. Välj procedur TipCount.
- Klicka på steget Enhetsåtgärd i verktygsfältet under Installation och enhetssteg och dra det till metoden. Välj Enhet oritalShaker0, Kommandotidsbild. Ange Skakning hastighet 1000, Dags att nå full hastighet 2, Dags att skaka 30.
- Klicka på steget Utökad flyttlabbmaterial i verktygsfältet under Installations- och enhetssteg och dra det till metoden. Flytta labware Orbital1 till P11.
- Ställa in den första mixen
- Klicka på steget Välj tips i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden. Välj ordna om position TL4.
- Klicka på inheco-inkubera-steget i verktygsfältet under Integrationer och dra det till metoden. Skriv in INHECO1 för användning av anordningen på plats, 1 för inkubera för, 60 för °C och 3 för °C för måltemperatur.
- Klicka på stegren Loop i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden i steget Välj tips. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End och 1 som Ökning.
- Klicka på steget Välj tips läses in i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, inom loopsteget. Välj BC90 Tips, TL5 Plats och TL2 backup Tips Plats på rullgardinsmenyn. Välj Enkolumn och skriv in 1.
- Klicka på steget Välj tips aspirera i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, inom loopsteget. Välj BCDeep96Round Labware typ och reagens plåt position. Skriv in volym =FirstMix, Aspirera i kolumn 1 och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tipsutdelning i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, inom loopsteget. Välj BCDeep96Round Labware typ och reagens plåt position. Skriv in volym =FirstMix, dispensera vid kolumn =col och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tips Lossa i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, inom loopsteget. Välj Ta bort tips till TR1.
- Ställa in proverna
- Klicka på steget Om i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden. Skriv SamplePlate som villkor.
- Klicka Thensedan på steget Välj tips lästips i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden. Välj BC90 Tips, TL5 Plats och TL2 backup Tips Plats på rullgardinsmenyn. Välj Enkolumn och skriv in =tipcolumns.
- Klicka på steget Välj tipsspirera i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden. Välj Greiner96RoundPS Labware typ och prover position. Ange volym =Prov, Aspirera vid kolumn =FirstColumn och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tipsutdelning i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden. Välj BCDeep96Round Labware typ och reaktionsplatta position. Skriv in volym =Prov, dispensera vid kolumn = FirstColumn och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tips Lossa i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden. Välj Ta bort tips till TR1.
- När steget Om har avslutats klickar du på steget Kör procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och drar det till metoden. Välj procedurInkubator. Skriv in HalfTime som variabelnamn och 1800 som standardvärde. Skriv in NextTemp som variabelnamn och 22 som standardvärde. Skriv in temp som variabelnamn och 60 som standardvärde.
- Ställa in Cysteinblocket
- Klicka på stegren Loop i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden, inom Välj tipssteg. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End och 1 som Increment.
- Klicka på steget Välj tips läses in i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg under Loopoch dra det till metoden. Välj BC90 Tips, TL5 Plats och TL2 backup Tips Plats på rullgardinsmenyn. Välj Enkolumn och skriv in 1.
- Klicka på steget Välj tips aspirera i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, inom slingan. Välj BCDeep96Round Labware typ och reagens plåt position. Skriv in volym =CysteineMix, aspirera i kolumn 2 och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tipsutdelning i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden i slingan. Välj BCDeep96Round Labware typ och reaktionsplatta position. Volymtyp = CysteineMix, fördela vid kolumn = kol och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tips Lossa i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden. Välj Ta bort tips till TR1.
- När loopen Om har avslutats klickar du på steget Kör procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och drar det till metoden. Välj procedurInkubator. Skriv in HalfTime som variabelnamn och 300 som standardvärde. Skriv in NextTemp som variabelnamn och 43 som standardvärde. Skriv in temp som variabelnamn och 25 som standardvärde.
- Ställa in den andra mixen
- Klicka på stegren Loop i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden, inom Välj tipssteg. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End och 1 som Increment.
- Klicka på steget Välj tips lästips under Vätskehanteringssteg under Körbarator och dra det till metoden. Välj BC90 Tips, TL5 Plats och TL2 backup Tips Plats på rullgardinsmenyn. Välj Enkolumn och skriv in 1.
- Klicka på steget Välj tips aspirera i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, inom slingan. Välj BCDeep96Round Labware typ och reagens plåt position. Skriv in volym =SecondMix, Aspirera i kolumn 3 och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tipsutdelning i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden i slingan. Välj BCDeep96Round Labware typ och reaktionsplatta position. Volymtyp = SecondMix, Dispensera vid kolumn = kol och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tips Lossa i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden. Välj Ta bort tips till TR1.
- Efter slutet av loopen klickar du på steget Kör procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och drar den till metoden. Välj procedur Orbital.
- Klicka på steget Pausa i verktygsfältet under Installation och enhetssteg och dra det till metoden. Pausa hela systemet i 1 s.
- Ställa in Trypsin-tillägg
- Klicka på stegren Loop i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden, inom Välj tipssteg. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End och 1 som Increment.
- Klicka på steget Välj tips läses in i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg under Loopoch dra det till metoden. Välj BC90 Tips, TL5-plats och TL2-plats för säkerhetskopieringstips på rullgardinsmenyn. Välj Enkolumn och skriv in 1.
- Klicka på steget Välj tips aspirera i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, inom slingan. Välj BCDeep96Round Labware typ och reagens plåt position. Ange volym =Trypsin, Aspirera i kolumn 4 och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tipsutdelning i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden i loopen. Välj BCDeep96Round Labware typ och reaktionsplatta position. Ange volym =Trypsin, Dispensera i kolumn = kol och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tips Lossa i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden. Välj Ta bort tips till TR1.
- När loopen Om har avslutats klickar du på steget Kör procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och drar det till metoden. Välj procedurInkubator. Skriv in HalfTime som variabelnamn och 3600 som standardvärde. Skriv in NextTemp som variabelnamn och 25 som standardvärde. Skriv in temp som variabelnamn och 43 som standardvärde.
- Klicka på inheco-inkubera-steget i verktygsfältet under Integrationer och dra det till metoden. Kontrollera att INHECO-inkubatorprogramvaran är installerad. Skriv in INHECO1 för användning av anordningen på plats, 1 för inkubera för, 25 för °C och 5 för °C för måltemperatur.
- Ställa in kylning
- Klicka på stegren Loop i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden i steget Välj tips. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End och 1 som Increment.
- Klicka på steget Välj tips läses in i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg under Loopoch dra det till metoden. Välj BC90 Tips, TL5 Plats och TL2 backup Tips Plats på rullgardinsmenyn. Välj Enkolumn och skriv in 1.
- Klicka på steget Välj tips aspirera i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, inom slingan. Välj BCDeep96Round Labware typ och reagens plåt position. Skriv in volym =Quench, Aspirera i kolumn 5 och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tipsutdelning i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden i slingan. Välj BCDeep96Round Labware typ och reaktionsplatta position. Ange volym =Quench, Fördela vid kolumn = kol och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tips Lossa i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, i Sedan. Välj Ta bort tips till TR1.
- Efter slutet av loopen klickar du på steget Kör procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och drar den till metoden. Välj procedur Orbital.
- Klicka på steget Pausa i verktygsfältet under Installation och enhetssteg och dra det till metoden. Pausa hela systemet i 1 s.
- Klicka på steget Pausa i verktygsfältet under Installation och enhetssteg och dra det till metoden. Välj Pausa hela systemet och visa det här meddelandet. Skriv in meddelandet "Fortsätt efter centrifugering".
- Ställa in plattan för Autosampler
- Klicka på steget Om i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden i steget Välj tips. Skriv Autosampler som villkor.
- Klicka Thensedan på steget Loop i verktygsfältet under Kontrollsteg och dra det till metoden. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End och 1 som Increment.
- Klicka på steget Välj tips läses in i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg under Loopoch dra det till metoden. Välj BC230 Tips, TL6 Plats och TL2 backup Tips Plats på rullgardinsmenyn. Välj Enkolumn och skriv in 1.
- Klicka på steget Välj tips aspirera i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, inom slingan. Välj BCDeep96Round Labware typ och reagens plåt position. Skriv in volym =MobilePhase, Aspirera i kolumn 6 och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tipsutdelning i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden i slingan. Välj Bio_RadPCR96 Labware-typ och autosamplerplåtsposition. Ange volym =MobilePhase, Fördela vid kolumn = kol och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tips Lossa i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden, i Sedan. Välj Ta bort tips till TR1.
- När loopen Om har avslutats klickar du på steget Kör procedur i verktygsfältet under Kontrollsteg och drar det till metoden. Välj procedur TipCount.
- Klicka på steget Välj tips läses in i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden. Välj BC90 Tips, TL5-plats och TL2-plats för säkerhetskopieringstips på rullgardinsmenyn. Välj Enkolumn och skriv in =tipcolumns.
- Klicka på steget Välj tipsspirera i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden i loopen. Välj BCDeep96Round Labware typ och reaktionsplatta position. Ange volym =DigestTransfer, Aspirera vid kolumn =firstcolumn och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tipsutdelning i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden i slingan. Välj Bio_RadPCR96 Labware-typ och autosamplerplåtsposition. Ange volym =MobilePhase, Fördela vid kolumn =FirstColumn och rad 1. Välj en optimerad teknik på den nedrullningsbara menyn teknik.
- Klicka på steget Välj tips Lossa i verktygsfältet under Vätskehanteringssteg och dra det till metoden i Then. Välj Ta bort tips till TR1. Steget välj tips slutar här.
- Spara och namnge metoden.
2. Förbered prov, labware och reagenser
- Överför 5 μl poolad frisk human plasma till en polypropylen, 96-rund djupbrunnplatta.
SE Tabell över material för reagenser och tillbehör som används i detta protokoll. TPCK Treated Trypsin köptes och trypsin till substrat förhållandet och inkubationstiden optimerades specifikt. Om en annan grad av trypsin används, såsom sekvens grade rekombinant trypsin, enzym till substrat förhållande och inkubationstid bör testas och optimeras.
3. Förfarande för drift
- Dubbelklicka på programikonen.
- Under fliken Metod väljer du Hem alla axlar för att orientera och förbereda den automatiska vätskehanteraren. Se till att alla arbetsstationssprutor inte innehåller några synliga luftbubblor.
- Under Arkivväljer du Öppna | metod.
- Välj metod (bild 6).
- Starta metoden genom att klicka på Run den gröna triangelformade körikonen.
- Om du vill att en automatiskmplerplatta ska förberedas i slutet av metoden anger du värdet "true" i uppmaningen Ange ett värde som ska användas för "Autosampler" och klickar sedan på OK. Om en automatiskmplerplatta inte förbereds anger du värdet "false" och klickar sedan på OK.
- Ange värdet '1' i länken Ange ett värde som ska användas för uppmaningen "firstcolumn" och klicka sedan på OK.
- Ange värdet '12' i länken Ange ett värde som ska användas för uppmaningen "lastcolumn" och klicka sedan på OK.
OBS: Detta steg och steg 4.7 tala om för arbetsstationen att utföra en matsmältning på 12 kolumner i en 96-brunnsplatta, vilket resulterar i att alla brunnar av plattan används för matsmältning - Om en provplatta används med provvolymer på minst 20 μL anger du värdet "true" i uppmaningen Ange ett värde som ska användas för "SamplePlate" och klickar sedan på OK. Om en provplatta inte används anger du värdet "false" och klickar sedan på OK.
OBS: Om en provplatta inte används, tillsätt 5 μl prov till varje motsvarande brunn i reaktionsplattan. - Följ anvisningarna i fönstret Guidad labware-installation och klicka på Fortsätt.
OBS: I nästa fönster beskrivs layouten för den "reagensplatta" som skall beredas (figur 7, tilläggstabell 1). Följande volymer kommer att aliquoted i var och en av de 8 brunnarna i en enda kolumn i 1 mL Deep Round 96-väl plattan:
Kolumn 1: 540 μl reaktionsmix 1.
Kolumn 2: 50 μL Cysteinblock.
Kolumn 3: 730 μl reaktionsmix 2.
Kolumn 4: 130 μL Trypsin.
Kolumn 5: 130 μl släckningslösning.
Kolumn 5: 1090 μL lösning för mobil fas (Om användaren angav "true" i steg 6). - Klicka på Nästa och i följande fönster beskrivs den minsta volym (20 μL) som behövde aliciteras i provplattan. Om användaren angav värdet "falskt" för uppmaningen som involverar provplattan (steg 9) uppmanas användaren att lägga till 5 μL-prov i reaktionsplattan.
- Klicka på Nästa.
OBS: I nästa fönster visas att en tom 90 μL spetslåda måste placeras på det automatiska vätskehanterardäcket. - Klicka på Nästa gång, om den automatiska vätskehanterarens däck enligt specificerade och illustrerade(figur 8),inklusive reagensplattan, reaktionsplattan, provplattan, autosamplerplattan, 6 hela 90 μL spetslådor, en tom 90 μL spetslåda och en komplett 230 μL spetslåda.
- Klicka på Slutför om du vill påbörja metoden.
Obs! Finish cannot Detta kommer att "bryta ljusridån" av maskinen och stoppa vätskehanteraren som en säkerhetsåtgärd. - Vid uppmaningen Fortsätt efter centrifugering hämtar du reaktionsplattan och centrifugerar den i 30 minuter vid 3 000 varv/min.
- När centrifugeringen är klar, returnera reaktionsplattan till den automatiska vätskehanteraren till det läge den befann sig i före centrifugeringen och klicka på Fortsätt.
OBS: Den automatiska vätskehanteraren stannar igen när metoden är klar. Om användaren skrev in "true" för steg 6 kan Autosampler Plate sedan tas bort från arbetsstationen och placeras i autosampleret av ett flytande kromatografiinstrument för analys.
4. LC-MSMS
- Lös peptider på en HPLC med högt flöde bestående av en C18 2,1 mm x 100 mm, 3,5 μm kolumn med en flödeshastighet på 0,25 ml/min och analyserad inline på en trippel quadrupole massspektrometer.
OBS: Efter peptidsmätning beskrivs den riktade LC-MSMS-metoden för att kvantifiera peptider från robotberedda prover i detalj1 efter en kort beskrivning av LC-MSMS. - Ställ in kolonnugnstemperaturen på 40 °C. Använd buffert A (2% ACN, 98% vatten, 0,1% myrsyra) och buffert B (95% ACN, 5% vatten, 0,1% myrsyra) som de två mobila faserna.
- Balansera kolonnen med 5% B i 5 minuter efter lastning. Elute peptiderna över 30 minuter med en linjär 5% till 35% gradient av buffert B.
- Återvinn kolonnen innan du fyller på nästa prov genom att tvätta med 98% B i 10 minuter och sedan 5% B i 5 minuter.
- För avledning på nätet, avleda eluenten efter kolonnen till avfall innan den gick in i jonkällan med hjälp av en tvåfas kopplingsventil.
- Bearbeta MRM-data.
Representative Results
Det automatiserade proteomics-provförberedelsarbetsflödet på den automatiserade arbetsstationen anpassades från vårt tidigare automatiserade protokoll med en robust LC-SRM-MS förvärvsmetod1 för albumin, det valda plasmaproteinet och β-galactosidase (β-gal), ett exogent protein som används för kvalitetskontroll. Efter bearbetning kördes proverna på en trippel quadrupole LC-MS i en SRM-analys riktad mot serumalbumin, β-galactosidase. Variationskoefficienten (CV) för varje övergång användes för att övervaka reproducerbarheten av automatiserade rötningsprotokoll.
Vi automatiserade reagenstillsats och blandningssteg för en rötning av 5 μL plasmaprover med en 2-timmars trypsininkubation på däck. För att bestämma reproducerbarheten var 5 μL av en plasmapool pipetted i flera brunnar av en reaktionsplatta med ett flerkanaligt huvud (96 stift). För att övervaka för konsekvens, tillsatte vi β-gal protein före minskning och alkylation reaktioner. Det automatiserade arbetsflödet för proteomikprovsförberedelser testades med en robust LC-SRM-MS-förvärvsmetod, inklusive albumin, det högsta överflödet av plasmaprotein och β-gal-protein, som används för kvalitetskontroll. Tre β-gal peptider och två albumin peptider övervakades från bearbetade plasma albumin proteiner och spetsade β-gal protein (tabell 4).
I ett försök att spara tid och förenkla proceduren minskade vi de vätskeöverföringsstegen för att lägga till/blanda/inkubation av reagens och reaktionsblandning med arbetsstationen från ett niostegsarbetsflöde till ett sexstegsarbetsflöde (figur 1). Det totala proteomiska arbetsflödet bestod av två experimentella komponenter: automatiserad provberedning och LC-MS/MS. För det första utvärderade vi precisionen i LC-MS/MS SRM-datainsamlingen med åtta på varandra följande injektioner från samma matsmältningsbrunn av autosamplerplattan. Precisionen i det automatiserade arbetsflödet för provförberedelser beräknades med procent av varianskoefficienten (%CV) för det totala proteomiska SRM-arbetsflödet minus%CV för LC-MS/MS(figur 9B). Med den strömlinjeformade plasmarötningsproceduren på den automatiserade arbetsstationen var den experimentella precisionen hos automatiserade proverpreparat mindre än 11,4 % för exogena spetsiga β-gal-proteiner (10,0 % i genomsnitt) och mindre än 14,9 % för det vanligast mänskliga serumalbumin (9,9 % i genomsnitt) (figur 9). Goda signalintensiteter observerades för både humant serumalbumin och β-gal-proteiner som förväntat (figur 9C).
För varje pipettering och flytande överföring steg, tekniker var särskilt optimerade. För att övervaka precisionen i vätskeöverföringssteg spetsade vi stabila isotopmärkta (SIL) peptidstandarder för endogena humana serumalbuminprotein och exogent β-gal-protein i tre oberoende reagensöverföringssteg: Reaction Mix 1, Cysteine Blocker och Reaction Mix 2 (figur 10). MRM-signaler från dessa fem SIL-peptider förvärvades för att övervaka precisionen i automatiserade vätskeöverföringssteg. Den genomsnittliga %CV för peptider, DDNPNLPR^, och GDFQFNISR ^ (^ representerar N15 märkt aminosyra) från Reaction Mix 1 steg varierade från 1,8% till 11,2%. Den genomsnittliga %CV för en peptid (IDPNAWVER^) från CysteinBlocker steg varierade från 6,6 till 8,8%. Den genomsnittliga %CV för två peptider (WVGYGQDSR^ och LVNEVTEFAK^) varierade från 6,2% till 11,9%(figur 10).
För att validera det automatiserade arbetsflödet för proteomikprovet utvärderade vi reproducerbarheten över flera proteiner och flera dagar för humant serumalbumin, exogena β-gal och 40 ytterligare plasmaproteiner. Vi bearbetade 21 replikatprover (poolade normala mänskliga plasma), väl plats som visas i figur 11A, på tre olika dagar. Intradags-CV:n beräknades från 21 brunnar som förberetts samma dag. Medelvärdet för intradags %MERIT för 40 proteiner varierade mellan 4 % och 20 % (figur 11B). För att utvärdera kanteffekten av det plattbaserade automatiserade arbetsflödet beräknades %CV från specifika brunnar i angivna kolumner och rader(figur 12A för kolumn- och radkarta). MRM signaler intensiteter var liknande i alla kolumn och rad konfigurationer med %CV från 3% - 22%(Figur 12B).
Sammanfattningsvis ger det optimerade automatiserade arbetsflödet 96 enhetligt bearbetade prover på mindre än fem timmar med utmärkt experimentell precision. För kompatibilitet med ett automatiserat arbetsflöde valde vi reagenser som har försumbara icke-specifika sidoreaktioner, är stabila i omgivande ljus, är LC-MS/MS-vänliga och kan lagras som frysta alikvoter.
Bild 1: Schema för arbetsflöde för exempelförberedelse. De viktigaste 6 vätskeöverföringsstegen listas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Tips laddar Skript. VB Script detaljer visas här. Skriptet anger tipsinläsningsvillkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Automatisk layout för arbetsstationsdäck. Däcket består av 1x1 ALPs, Tip Loading ALPs, Trash, Tip wash, Peltier och en inkubator. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Reagensplattans egenskaper. Visas är egenskaper som behövs för Reagent Plate labware när de används med hjälp av guided labware setup. Välj motsvarande kolumn och skriv in variablerna enligt figuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Tipsräkningsskript. Det här skriptet hjälper till att hålla reda på antalet tips på däck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Översikt över metoden för att smälta och alicitera plasmaprover. Steg för reagensberäkningar, labware-installation och vätskemanipuleringar i vätskehanterarens metod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Reagensplattans utformning. Visas är de kemiska reagenser som behövs för plasma matsmältning och autosampler förberedelse och distribueras över reagensplattan labware. Denna siffra har ändrats från en teknisk anmärkning10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 8: Layout för labware på däck på den automatiserade arbetsstationen. Visas är däcklayouten för plasmarötningsmetoden för vätskehanteraren. Denna siffra har ändrats från en teknisk anmärkning10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Precisionen i det totala proteomiska arbetsflödet består av arbetsstations-CV och riktade LC MS/MS CV.
Fem peptider från β-gal och albumin övervakades, kromatogram och peptidretentionstid för varje peptid visas (A), Precision fastställdes från 30 brunnar / prover bearbetning representativt experiment, CV% för totalt proteomiskt arbetsflöde, LC MS / MS analys och automatiserad provbearbetning beräknades(B). Sammantaget visade de smälta peptiderna bra signaler varierade från 1x105 upp till 1x108. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Bestämning av precision för vätskeöverföringssteg. Syntetiska peptider spetsades i steg specifika reagenser, och automatiserad vätskeöverföring fastställdes av totalt%CV. Från 30 brunnar/prover experiment minus% CV LC MSMS (bestäms av 8 upprepa LC MSMS injektioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: Reproducerbarhet för automatiserade proteomiska provberedningsarbetsflöde i flera dagar med 42 protein-MRM-analys. (A)Reaktionsplattan karta för var och en av tre dagar visas här, 5 μL plasma tillsatts var och en av 21 brunnar. 3 brunnar fick 5 ul vatten användes som negativa / tomma kontroller. (B)De genomsnittliga intensiteterna i 190 övergångar omfattar 75 peptider och 42 proteiner (vänster) och %CV för varje MRM-övergång beräknades från 21 brunnar rötning för varje dag (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12: Reproducerbarhet för specifika platser för brunnar (kolonners och raders placering). (A) Kolumner och rader plats med en skylt karta visas här. (B)Kolumn- och radplaceringsspecifika MRM-signaler av genomsnittliga intensiteter från angivna brunnar (vänster) och cv% (höger) från en enda plåtrötning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 13: Skärmdump av teknikredigeraren. För varje pipetteringsmall definierar du egenskaperna hos avkänning av vätskenivå, Clot detektion, Piercing, Flytande typ, Allmänt, Aspirera, Dispense, Mix och Kalibrering. Mallen och teknikerna som används i detta protokoll visas i tilläggstabell 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Variabel | Variabel | Värde | Beskrivning |
| Autosampler | Boolean | Sant | Använda autosampler |
| Betagal (betagal) | Heltal | 5 | Betagal volym |
| BG1 (PÅ ANDRA) | Heltal | 0.8 | BG1-volym |
| BG2 (PÅ ANDRA) sätt | Heltal | 0.8 | BG2-volym |
| BG3 (PÅ ANDRA) | Heltal | 0.8 | BG3-volym |
| CysteinBlocker ( | Heltal | 1.25 | Cysteinblockerare volym |
| Cysteinbuffer (olika år) | Heltal | 0.45 | Cysteinbuffertvolym |
| Denatureringsmedel | Heltal | 5 | Denaturant volym |
| DigestTransfer | Heltal | 10 | Smält överföringsvolym |
| Första bufferten | Heltal | 25.9 | Första buffertvolymen |
| Första kolumnen | Heltal | 1 | Första kolumnen |
| HSA1 (HSA1) | Heltal | 0.8 | HSA1-volym |
| HSA2 (HSA2) | Heltal | 0.8 | HSA2-volym |
| sistakolonn | Heltal | 12 | Sista kolumnen |
| MobilePhase (MobilePhase) | Heltal | 90 | Mobil fasvolym |
| Släcka | Heltal | 10 | Krönika Kolumn |
| ReducingAgent | Heltal | 5 | Minska agentkolumnen |
| Prov | Heltal | 5 | Exempelkolumn |
| SamplePlate (Samplingsplatta) | Boolean | Sant | Använd provplatta |
| SecondBuffer (andrabuffer) | Heltal | 58.4 | Andra buffertvolymen |
| Trypsin | Heltal | 10 | Trypsin-kolumn |
Tabell 1: Starta stegvariabler
| Värde | Variabel |
| =FirstBuffer+Denaturant+ReducingAgent+Betagal+BG1+HSA1 | FirstMix (första) |
| =CysteinBlocker+CysteineBuffer+BG2 | CysteineMix (300) |
| =SecondBuffer+BG3+HSA2 | SecondMix (andramix) |
| =(FirstMix*Kolumner)+30 | FirstMixWell (första blandat) |
| = (CysteineMix*Kolumner)+20 | CysteineWell (0) |
| =(SecondMix*Kolumner)+10 | SecondMixWell (AndraMixWell) |
| =(Trypsin*Kolumner)+10 | TrypsinWell (TrypsinWell) |
| =(Släck*kolumner)+10 | QuenchWell (SläckningBruna) |
| =(FirstMixWell*8)+100 | FirstMixStock (första blandat) |
| =CysteineWell*8+20 | CysteineMixStock (på andra) |
| =(SecondMixWell*8)+100 | SecondMixStock (andramixstock) |
Tabell 2: Variabler för volymmix
| Typ | Namn | Position | Djup | Egenskaper | Använda? |
| BCDeep96Round | Reagensplatta | P5 (S) | 1(överst) | # | =inte SamplePlate |
| BCDeep96Round | Reagensplatta | P5 (S) | 1(överst) | # | =SamplePlate |
| BCDeep96Round | Reaktionsplatta | P11 (på andra sätt) | 1(överst) | Sant | |
| Bio_RadPCR96* | Prover | P9 (S) | 1(överst) | =SamplePlate | |
| Bio_RadPCR96* | Autosampler platta | P10 (på andra sätt) | 1(överst) | =Autosampler | |
| BC90 (på andra sätt) | Tom | 1(överst) | Sant | ||
| BC90 (på andra sätt) | 1(överst) | Sant | |||
| BC90 (på andra sätt) | 1(överst) | Sant | |||
| BC230 (PÅ ANDRA) | 1(överst) | =Autosampler | |||
| BC90 (på andra sätt) | 1(överst) | =Kolumner >1 | |||
| BC90 (på andra sätt) | 1(överst) | =Kolumner >3 | |||
| BC90 (på andra sätt) | 1(överst) | =Kolumner >5 | |||
| BC90 (på andra sätt) | 1(överst) | =Kolumner >7 | |||
| BC90 (på andra sätt) | 1(överst) | =Kolumner >9 | |||
| Observera: *: Motsvarar 96 brunnen Bio-Rad plattan. #: Klicka på egenskaper och ange sedan volymvariablerna enligt figur 6. |
|||||
Tabell 3: Ställa in den guidade inställningen
| Protein ID | Peptidsekvens | Q1 Massa (Da) | Q3 Massa (Da) | Tid (min) | Fragment Jon | Declustering Potential | Kollision energi | Kan gå ut i kollisionscell |
| sp| P00722| BGAL_ELOCI | GDFQFNISR | 542.3 | 262.1 | 19.7 | +2y2 | 61 | 21 | 8 |
| 542.3 | 636 | 19.7 | +2y5 | 61 | 25 | 12 | ||
| 542.3 | 764.2 | 19.7 | +2y6 | 61 | 25 | 18 | ||
| IDPNAWVER | 550.3 | 436.1 | 18.1 | +2y7+2 | 61 | 23 | 8 | |
| 550.3 | 871.2 | 18.1 | +2y7 | 61 | 25 | 18 | ||
| 550.3 | 774.2 | 18.1 | +2y6 | 61 | 33 | 8 | ||
| WVGYGQDSR | 534.3 | 782.1 | 12.1 | +2y7 | 51 | 25 | 6 | |
| 534.3 | 562.1 | 12.1 | +2y5 | 51 | 27 | 6 | ||
| 534.2 | 505.2 | 12.1 | +2y4 | 90 | 25 | 8 | ||
| sp| P02768| ALBU_HUMAN | DDNPNLPR | 470.8 | 596.2 | 9.2 | +2y5 | 61 | 27 | 16 |
| 470.8 | 499.3 | 9.2 | +2y4 | 61 | 27 | 18 | ||
| 470.8 | 710.4 | 9.2 | +2y6 | 61 | 27 | 18 | ||
| LVNEVTEFAK | 575.3 | 694.4 | 18.2 | +2y6 | 73.1 | 29.6 | 18 | |
| 575.3 | 937.5 | 18.2 | +2y8 | 73.1 | 29.6 | 18 | ||
| 575.3 | 823.4 | 18.2 | +2y7 | 73.1 | 29.6 | 18 |
Tabell 4: MRM-parametrar
Tilläggstabell 1: Reagensplatta Klicka här för att ladda ner tabellen.
Kompletterande tabell 2: Protokollmall Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Discussion
Provbearbetning för masspektrometri kräver proteindenaturering, reduktion och alkylering för att blockera cysteiner, och trypsinsammamning för att klyva proteiner i peptider. Varje kemisk eller enzymatisk reaktion måste initieras vid en bestämd tidpunkt och utföras vid en kontrollerad temperatur, och varje steg i processen innebär flera vätskeöverföringssteg där experimentell variation kan införas. Automatiserad exempelbearbetning ger en lösning på detta dilemma. För närvarande tillgängliga vätskehanteringssystem har kapacitet att överföra reagenser till 96-brunnsplattor med en noggrannhet och precision på mindre än 5 %, beroende på vilken huvud- och spetstyp som används, och att ruva prover, med om så önskas skakningar, under kontrollerade temperaturer från 14 °C till 70 °C. Vi använde en automatiserad flytande hanterare för att bearbeta plasma för SRM-analyser i ett 96-brunnsformat.
Det finns tusentals proteas klyvning platser inom komplexa blandningar av proteiner i serum, plasma och andra biologiska prover; och vart och ett av dessa proteiner har unika egenskaper som påverkar klyvning plats tillgänglighet och stabiliteten i de resulterande peptiderna. Det är därför omöjligt att utforma ett prov bearbetning förfarande som är optimal för varje protein. Det bästa alternativet är att vara så konsekvent som möjligt.
För att uppnå konsekvens optimerade vi varje pipetteringssteg som utfördes av den automatiserade vätskehanteraren. Vi övervägde först den volym som krävs och begränsningar som ålagts av vätskans typ (plasma, vattenhaltiga eller organiska) och motsvarande egenskaper (viskositet, sammanhållning och volatilitet), hårdvara (arbetsstation pipettering-huvud och platta greppa armar), och labware. Vi varierade sedan hastighet och efterföljande luftgapet för strävan, hastighet och blowout volym för dispensering, och kraft och varaktighet blandning, samtidigt som en spets touch efter strävan och / eller dispensering, om det behövs, för att eliminera vätska som följer utsidan av tips (figur 13, Kompletterande tabell 1). En unik SIL-peptid, förskärmad för stabilitet, spetsades i varje reagens för att göra det möjligt att övervaka precisionen i varje vätskehanteringssteg. Efter optimering var process-CV:n för de flesta övergångar mindre än 10 %, vilket visade på god reproducerbarhet med den automatiserade arbetsstationen (figur 9, figur 10, figur 11 och figur 12).
Det automatiserade arbetsflöde som presenteras här ger konsekvent enzymatisk nedbrytning med förbättrad reproducerbarhet och genomströmning jämfört med manuella metoder (figur 9, figur 10). Detta tillvägagångssätt lovar att förbättra noggrannheten och tillförlitligheten hos biomarköridentifiering och validering av masspektrometri.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A Pooled healthy human plasma | Bioreclamation Inc. | human plasma tested in the manuscript | |
| Acetonitrile, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | A998SK1 | LC MS/MS solvent |
| B-Galactosidase Recombinant from E.Coli | Sigma-Aldrich | G3153-5MG | exogenous control proteins. |
| Biomek i7 Automated Workstation | Beckman Coulter, Inc. | The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions | |
| Biomek i-Series Tips 230µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85903 | Tips, i7 consumable |
| Biomek i-Series Tips 90µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85881 | Tips, i7 consumable |
| FG, Kit Trypsin TPCK | Sciex | 4445250 | Trypsin used in digestion |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | #hsp9641 | Autosampler plate |
| Octyl B-D-Glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O9882-5G | detergent used in digestion |
| Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile | Beckman Coulter, Inc. | 267007 | Reagent and digestion plate |
| Prominence UFLCXR HPLC system | Shimadzu, Japan | High flow LC sytem | |
| QTRAP 6500 | SCIEX | Mass spectrometer | |
| Water, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | W54 | LC MS/MS solvent |
| Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm | Waters | 186003564 | LC MSMS column |
References
- Fu, Q., et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Lehmann, S., et al. Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold? Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Yates, J. R. 3rd Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).
- Nilsson, T., et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).
- Van Eyk, J. E., Sobhani, K.
- Hoofnagle, A. N., et al. Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays. Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).
- Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series. Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).
