Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60005
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,3, 1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), 3Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University
* These authors contributed equally

Summary

Endret nuklease aktivitet har vært forbundet med ulike menneskelige forhold, underliggende dens potensial som en biomarkør. Den modulære og lett å implementere screening metodikk som presenteres i dette papiret gjør det mulig å velge bestemte nukleinsyre syre sonder for å utnytte nuklease aktivitet som en biomarkør av sykdom.

Abstract

Nukleaser er en klasse av enzymer som bryter ned nukleinsyre syrer ved katalyserende hydrolyse av phosphodiester obligasjoner som knytter ribose sukker. Nukleaser viser en rekke vitale fysiologiske roller i prokaryote og eukaryote organismer, alt fra å opprettholde Genova stabilitet til å gi beskyttelse mot patogener. Endrede nuklease aktivitet har vært forbundet med flere patologiske tilstander, inkludert bakterielle infeksjoner og kreft. For dette formål har nuklease aktivitet vist stort potensiale til å utnyttes som en spesifikk biomarkør. Imidlertid er en robust og reproduserbar screening metode basert på denne aktiviteten svært ønskelig.

Heri introduserer vi en metode som muliggjør screening for nuklease aktivitet ved hjelp av nukleinsyre syre sonder som underlag, med omfanget av differensiering mellom patologiske og sunne forhold. Denne metoden gir mulighet for å designe nye sonde biblioteker, med økende spesifisitet, i en gjentakende måte. Dermed flere runder med screening er nødvendig for å avgrense sonder ' design med forbedrede funksjoner, utnytter tilgjengeligheten av kjemisk modifiserte nukleinsyre syrer. Det betydelige potensialet i den foreslåtte teknologien ligger i sin fleksibilitet, høy reproduserbarhet og allsidighet for screening av nuklease aktivitet forbundet med sykdomstilstander. Det er forventet at denne teknologien vil tillate utvikling av lovende diagnostiske verktøy med et stort potensial i klinikken.

Introduction

Nukleaser er en klasse av enzymer som er i stand til å spalte de phosphodiester obligasjoner som danner ryggraden struktur av nukleinsyre syre molekyler. Det store mangfoldet av nukleaser gjør deres klassifisering ganske vanskelig. Det er imidlertid noen vanlige kriterier som brukes for å beskrive nukleaser, slik som substrat preferanse (deoksyribonukleinsyre syre (DNA) eller ribonukleinsyre acid (RNA)), kløft sted (endonucleases eller exonucleases), eller metall ion avhengighet, blant andre1. Nukleaser er svært bevarte katalysatorer som har grunnleggende roller i både, prokaryote og eukaryote organismer og har blitt brukt, og fortsetter å bli brukt, som Gen redigeringsverktøy2. De er også grunnleggende aktører i DNA vedlikehold og replikering, bidrar til å holde Genova stabilitet og delta i bevis-lesing prosesser3. I bakterier, for eksempel, nukleaser har blitt identifisert som viktige virulens faktorer, i stand til å fremme bakteriell overlevelse ved å redusere effekten av vertens immunsystem4,5,6,7 ,8. I pattedyr, har nukleaser blitt foreslått å være innblandet i apoptose9, mitokondrie kognitiv og vedlikehold10 og formidling av antibakterielle og antivirale medfødte immunresponser11. Ikke overraskende, nuklease aktivitet endringer, om forbedring eller mangel på, har vært innblandet i et bredt spekter av menneskelige sykdommer. Disse sykdommene spenner fra et bredt utvalg av kreft12,13 til hjerte-hypertrofi10 eller autoimmune sykdommer14. Derfor har nukleaser blitt interessante kandidater som biomarkører for en heterogen gruppe menneskelige forhold. Faktisk har nukleaser allerede vist sitt potensial som vellykkede diagnostiske verktøy for påvisning av infeksjoner forårsaket av bestemte bakterielle midler, slik som Staphylococcus aureus eller Escherichia coli15, 16. i mange krefttyper, uttrykk for stafylokokk nuklease domene-inneholdende protein 1 (SND1) ribonuklease er et tegn på dårlig prognose17. I bukspyttkjertelkreft pasienter, forhøyede ribonuklease I (RNase I) serum nivåer har blitt rapportert18 og foreslått å være assosiert med kreftcelle fenotyper19. I iskemisk hjerte forhold, som hjerteinfarkt eller ustabil angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serum nivåer har vist å være en gyldig diagnostisk markør20,21.

Det har vært hypotetisk gjennomsnitt at den globale blåkopi av nuklease aktivitet kan være forskjellig i sunne og sykdomstilstander. Faktisk har nylige rapporter brukt forskjeller i nuklease aktivitet for å skille mellom sunn og kreft fenotyper22 eller for å identifisere patogene bakterielle infeksjoner i en art-spesifikk måte15,23. Disse funnene har åpnet en ny vei for bruk av nukleaser som biomarkører av sykdom. Derfor finnes det en nødvendighet for utvikling av en omfattende screening metode i stand til å systematisk identifisere sykdom knyttet forskjeller i nuklease aktivitet, som kan være av avgjørende betydning i utviklingen av nye diagnostiske verktøy.

Heri, introduserer vi og beskriver en ny in vitro screening tilnærming (figur 1) for å identifisere sensitive og spesifikke sonder som kan diskriminerende mellom nuklease aktivitet i sunn og usunn, eller aktivitet som er spesifikke for en type celle eller bakterier. Dra nytte av den modulære av nukleinsyre syrer, designet vi en første bibliotek av slukket fluorescerende oligonukleotid sonder som består av et omfattende sett av ulike sekvenser og kjemikalier, både er viktige parametre for biblioteket design. Disse oligonukleotid sonder er flankert av en fluoroforen (fluorescein amidite, FAM) og en tørste (tidevann tørste 2, TQ2) ved henholdsvis 5 ' og 3 ' ender (tabell 1). Ved å bruke denne fluorescerende resonans energi overføring (bånd) basert fluorometric analysen for å måle Kinetics av enzymatisk degradering, var vi i stand til å identifisere kandidat sonder med potensial til å diskriminere differensial mønstre av nuklease aktivitet assosiert med sunne eller sykdomstilstander. Vi utformet en gjentakende prosess, der nye biblioteker opprettes basert på de beste kandidat sonder, som gjør det mulig å identifisere stadig mer spesifikke kandidat sonder i påfølgende screening-trinn. Videre tar denne tilnærmingen nytte av katalysatoren natur nukleaser å øke følsomheten. Dette oppnås ved å dra nytte av activatable natur reporter sonder og evnen til nukleaser å kontinuerlig behandle substrat molekyler, begge representerer viktige fordeler fremfor alternative antistoff eller små molekyl-baserte screening metoder.

Denne tilnærmingen tilbyr en svært modulær, fleksibel og enkel å implementere screening verktøy for identifisering av spesifikke nukleinsyre syre sonder i stand til å diskriminerende mellom sunne og sykdomstilstander, og en utmerket plattform for utvikling av nye diagnostiske verktøy som kan tilpasses for fremtidige kliniske anvendelser. Som sådan, denne tilnærmingen ble brukt til å identifisere nuklease aktivitet avledet fra Salmonella tyfimurium (heretter referert til som Salmonella) for den spesifikke identifisering av denne bakterien. Inne det fulgte protokollen, vi rapportere opp på en metoden å skjermen for bakteriell nuklease aktivitet benytter kinetisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. oligonukleotid bibliotek design og forberedelse

  1. Bibliotek design
    1. Basert på følgende kriterier utformer et bibliotek av slukket fluorescerende oligonukleotid sonder mellom 8 og 12-mer lang for å unngå sekundær struktur dannelse, med lik lengde for alle sonder.
      1. Ta med minst én DNA og én RNA tilfeldig sekvens som inneholder en kombinasjon av adenine (A), Guanin (G), cytosin (C) og thymine (T)/uracil (U) (DNA og RNA-sonder i tabell 1).
        Merk: DNA-og RNA-sekvensene beskrevet i tabell 1 har vært nyttige som utgangs underlag for klassifisering av ukjent type nuklease aktivitet, enten DNase eller RNase. Disse to sekvensene er anbefalt som utgangspunkt for screening, som de har vist en bred evne til å oppdage nuklease aktivitet profiler i bakterier og vevsprøver. Hvis nuklease aktivitet ikke observeres med disse DNA-og RNA-sekvensene, kreves det ekstra oligonukleotider utforming.
      2. Inkluder polynucleotide sekvenser bestående av en enkelt type nukleotid å bestemme sekvensen avhengighet for en gitt nuklease aktivitet (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C og RNA-Poly G i tabell 1).
      3. Bruke samme sekvens av nukleotid rester som den første DNA og RNA sekvenser, inkluderer sekvenser som inneholder nukleosid analogs harboring kjemiske modifikasjoner på 2 '-posisjon av ribose sukker, for eksempel 2 '-fluoro og 2 '-O-metyl, som et strengt skritt for å øke selektivitet av nukleaser.
        1. Inkluder fullt modifiserte sekvenser bestående utelukkende av 2 '-fluoro nukleosid analogs eller 2 '-O-metyl nukleosid analogs (alle 2 '-F og alle 2 '-OMe, tabell 1)
        2. Inkluder chimeric sekvenser bestående av uendret naturlig puriner og 2-fluoro pyrimidin nukleosid analogs (RNA Pyr-2'F, tabell 1).
        3. Inkluder chimeric sekvenser bestående av uendret naturlig puriner og 2 '-O-methyl pyrimidin nukleosid analogs (RNA Pyr-2'OMe, tabell 1).
        4. Inkluder chimeric sekvenser bestående av uendret naturlig pyrimidines og 2-fluoro purine nukleosid analogs (RNA pur-2'F, tabell 1).
        5. Inkluder chimeric sekvenser bestående av uendret naturlig pyrimidines og 2 '-O-methyl purine nukleosid analogs (RNA pur-2'OMe, tabell 1).
  2. Klargjøring og lagring av oligonukleotid sonde
    Merk: Oligonukleotider er syntetisert ved phosphoramidite metoden. Etter syntese blir oligonukleotider renset ved hjelp av høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) og massen måles ved masse massespektrometri.
    1. Spinn ned lyofilisert oligonukleotid sonder ved hjelp av en sentrifuge og fortynne dem i Tris-EDTA (TE) buffer for å hindre nuklease degradering. Bestem fortynnings volumet i henhold til avkastningen fra hver sonde for å gjengi en lagerløsning med en konsentrasjon på 500 pmol/μL.
    2. Oppbevar lyofilisert oligonukleotider ved 4 ° c eller romtemperatur på kort sikt. For langtidsoppbevaring (måneder til år), Oppbevar lyofilisert oligonukleotider ved-20 ° c. Ved blanding av lyofilisert oligonukleotider i TE, Oppbevar lager løsningene ved-20 ° c eller, fortrinnsvis, ved-80 ° c.

2. bakteriell kultur

  1. Ta en porøs glass perle fra kryogene hetteglass under sterile forhold.
  2. Å isolere enkelte bakterielle kolonier (Salmonella og E. coli), bruk kvadrant metoden24 av striper/rullende perlen direkte på en Petri PARABOLEN inneholder Tryptic Soy agar (TSA) medium supplert med defibrinated sauer Blod.
  3. Ruge kulturen ved 37 ° c i 24 timer.

3. supernatanten forberedelse

  1. Overfør en enkelt koloni fra solide medier til 50 mL Tryptic Soy buljong (TSB) og ruge ved 37 ° c i 24 timer ved 200 rpm.
  2. Fortynne kulturen (1:500) i TSB (sub-kultur) og ruge ved 37 ° c i 24 timer ved 200 RPM i en risting inkubator.
    Merk: det forventes at etter 24 h av inkubasjons bakteriekulturer er i stasjonær fase nådde verdier høyere enn 109 CFU/ml.
  3. Etter inkubasjonsperioden, overføre kulturer til avkortet sterile rør og sentrifuger på 4 500 x g i 30 min.
  4. Samle supernatanten og bruk den umiddelbart. Alternativt kan du oppbevare supernatanter ved 4 ° c eller-20 ° c.

4. nuklease aktivitet analysen

  1. Utarbeidelse av arbeidsløsninger
    1. Forbered en 20 μL arbeids løsning for hver sonde i 1,5 mL nuklease frie mikrosentrifugen rør ved fortynning (1:10 ratio) lager løsningen (500 pmol/μL) for en endelig arbeids konsentrasjon på 50 pmol/μL. For dette formålet, bland 18 μL av fosfat buffer Saline (PBS) som inneholder MgCl2 og CaCl2 med 2 μL av sonde Stock-løsning.
      Merk: Vær oppmerksom på at i arbeids løsningen, oligonukleotider er mer sårbare for nuklease degradering, derfor anbefales det å forberede arbeidsløsninger like før du setter opp reaksjonen.
    2. Unngå direkte lys kontakt under tilberedning og holde i mørket (innpakket i folie), når du arbeider med fluorophores.
  2. Reaksjon satt opp
    1. Før varme opp fluorometer (f.eks. Cytation 1) til 37 ° c.
    2. Forbered et sett (ett rør/sonde) på 1,5 mL nuklease gratis mikrosentrifugen rør for hver prøve (TSB, E. coli og Salmonella) og etiketten tilsvarende.
    3. Forsiktig legge 96 μL av TSB steril kultur Media, Salmonella Supernatanten eller E. coli supernatanten (fra trinn 3,4.). Deretter legger du til 4 μL/tube av sonde arbeids løsning tilsvarende. Utfør dette trinnet ved romtemperatur.
      Merk: 10 sonder ble brukt til første runde av screening og 6 sonder for andre runde.
    4. Bland godt ved å pipettering opp og ned for å oppnå en homogen løsning. Unngå å innføre luftbobler i prøvene mens du blander.
    5. Load 95 μL av hver løsning (sonde + supernatanten eller kultur Media) i en egen brønn av en svart bunn, ikke-behandlet 96 brønn plate. Minimer dannelsen av bobler i brønnene ved lasting ved å dispensere forsiktig med spissen nær veggen av brønnen.
    6. Dekkplaten med lokket. Inspiser lokket visuelt og se etter Penne markeringer eller Oppsamling av støvpartikler som kan innføre måle artefakter. Sett lokket på nytt hvis det er tilfelle.
  3. Måling satt opp
    1. Åpne programvaren for oppkjøpet (Gen5 3,05) ved å klikke på ikonet for programvare snarveien (figur S1A).
    2. Velg Les nå fra Oppgavebehandling vinduet og velg ny... for å opprette kinetisk måle protokoll (figur S1B).
    3. Klikk på innstilt temperatur i dialogvinduet med tittelen prosedyre og velg 37 ° c. Bekreft og lagre innstillingene ved å trykke på OK (figur S1C).
    4. Falle i staver opp på starte Kinetics inne dialogen vindu med tittelen fremgangsmåte. Så inne det popmusikk-opp dialogue vindu, tittelen Kinetic steg, velge 2 h inne kjøretid input bokse med og 2 min inne intervallet input bokse med. Bekreft og lagre innstillingene ved å trykke på OK (figur S1D).
    5. Falle i staver opp på lese inne dialogen vindu med tittelen fremgangsmåte. Så i popup-dialogboksen, med tittelen Les metode, velg fluorescens intensitet som en gjenkjennings metode, Endpoint/Kinetic som en lese type og filtre som optikk type. Bekreft og lagre innstillingene ved å trykke på OK (figur S1E).
    6. Inne det popmusikk-opp dialogue vindu med tittelen lese steg (Kinetic), velge grønn fra filteret sette. Bekreft og lagre innstillingene ved å trykke på OK (figur S2A).
    7. Inne dialogen vindu med tittelen fremgangsmåte, velge Bruk lokk og falle i staver opp på godkjenne å sikre det det skapt protokollen er lovlig. Dette bekreftes av et popup dialogvindu (figur S2B).
    8. Velg protokoll i menylinjen og velg prosedyre (figur S2C).
    9. I dialogboksen som heter prosedyre, definerer du brønnene som skal måles (figur S2D).
    10. Skriv inn navnet på eksperimentet i boksen for filnavn inn data (figur S2E).
    11. Legg platen med lokket inn i plate leseren. Sørg for at platen er i riktig retning.
    12. Start oppkjøpet ved å klikke på Les ny knapp i verktøylinjen (figur S2F).
  4. Data analyse
    1. Klikk på en av de målte brønnene i dialogvinduet med tittelen plate 1 (figur S3A).
    2. Klikk på Velg brønner og ta med alle de målte brønnene i dialogvinduet for valg av brønn . Bekreft og lagre innstillingene ved å trykke på OK. (Figur S3B).
    3. Velg data i dialogvinduet med tittelen plate 1 for å visualisere resultatene i tabell tabellen (figur S3C).
    4. Eksporter dataene til et regneark ved å velge hurtigeksport på hurtigmenyen (figur S3C).
    5. I oppslags arket merker du datakolonnene tilsvarende for hver prøve og sonde.
    6. Generere kinetisk grafer, ved hjelp av linje med markører stil, ved å plotte relative fluorescens enheter (RFU) versus tid (x-akse: tidslinje for reaksjonen og y-aksen: RFUs).
      Merk: beskrivelsen av generering av en graf gjelder når du bruker regnearkprogrammer (for eksempel Excel). Imidlertid kan alle andre programmer brukes til å generere grafer fra rådata innhentet, ved å plotte RFU versus tid.
    7. Beregn frekvensen av enzymatisk reaksjon for hvert målt intervall i henhold til følgende formel25 Equation 1 : rate =, hvor Hvis er RFU på maksimalt intervalltid punkt og II er RFU på minimal intervalltid punkt, og TF og ti er henholdsvis maksimal og minimal intervalltid poeng.
    8. Velg hastigheten med den høyeste verdien (RMax) for hver kurve. Hvis det er mer enn én RMax per prøve, velger du den som forekommer ved det tidligste målings tidspunktet.
    9. Beregn forholdet mellom RMax og gjennomsnittsverdien av tidsintervallet som rMax forekommer: rate koeffisient =Equation 2
    10. Beregn fold forskjellen (FD) mellom hastigheten koeffisient av Salmonella og E. coli for hver sonde.
    11. Vurder en fold forskjell verdi høyere enn 3 som signifikant.
    12. Vurder de betydelige sonder med de høyeste fold forskjell verdier (FD) som kandidat sonder og som grunnlag for biblioteket design i neste screening runde.

5. screening runder ' utvalgskriterier (figur 1)

  1. Første runde av screening
    1. Utfør den nuklease aktivitet analysen (som beskrevet i avsnitt 4) ved hjelp av DNA, RNA og polynucleotide sonder.
    2. Evaluer preferansen for DNA-kjemi eller RNA-kjemi ved å sammenligne antall og ytelse (FD-verdi) av DNA-og RNA kandidat sonder.
    3. Velg type nukleinsyre yre kjemi som gjengir det største antall kandidat sonder, som illustrert i figur 1.
  2. Andre runde av screening
    1. Utfør nuklease aktivitet analysen (som beskrevet i avsnitt 4) ved hjelp av fullt modifiserte sonder og chimeric sonder utformet basert på nukleinsyre yre substrat valgt i første screening runde.
    2. Vurdere preferanse mot sekvenser som inneholder 2 '-fluoro og 2 '-O-methyl nukleosid analogs ved å sammenligne resultatene som oppnås for 2 '-fluoro og 2 '-O-metyl modifisert kandidat sonder.
    3. Velg type nukleosid analog modifisering som gjengir det største antallet kandidat sonder, som illustrert i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser arbeidsflyten av denne metodikken, som er delt inn i to screening runder. I den første runden av screening, brukte vi 5 DNA-sonder (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C og DNA Poly G) og også 5 RNA-sonder (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C og RNA Poly G). Rådata i denne screening runde kan bli funnet i supplerende tabell 1. I den andre runden, kjemisk modifiserte sonder ble syntetisert ved å erstatte RNA sekvensen med kjemisk modifisert nucleosides (alle 2 '-fluoro og alle 2 '-OMethyl) eller ved kombinasjonen av RNA og puriner eller pyrimidines kjemisk modifisert (RNA Pyr-2'F, RNA Pyr-2'OMe, RNA pur-2'F og RNA pur-2'OMe). Rådata i denne screening runde kan bli funnet i supplerende tabell 2. Du finner en detaljert beskrivelse av sekvensene i tabell 1. Resultatene Hentet fra den første screening runde er vist i figur 2, der Salmonella kultur supernatanter rapportere en klar preferanse for RNA-sonder over DNA-sonder. I kontrast, E. coli og kultur Media kontroller viser svært begrenset evne til å svekke RNA sonder. I tillegg har vi beregnet fold forskjellen (FD) mellom rate koeffisienter av Salmonella og E. coli (supplerende tabell 3 og supplerende tabell 4) for å identifisere de beste resultater. Beregningene ble utført som beskrevet i protokollen delen.

Disse resultatene tyder på tilstedeværelsen av en RNase type aktivitet avledet fra Salmonella. Basert på identifisering av RNA som foretrukket nukleinsyre yre type for Salmonella nukleaser, har vi designet et nytt bibliotek med kjemisk modifisert nukleotider som skal brukes i den andre runden av screening sikte på å øke spesifisitet av Sonder. Figur 3 viser kinetisk profilene til sonder som inneholder kjemisk modifiserte nukleotider. Interessant nok viser RNA Pyr-2'OMe og RNA pur-2'OMe den beste resultater for kinetisk adferd sammenlignet med henholdsvis RNA Pyr-2'F og RNA pur-2'F.

Disse resultatene tyder på at Salmonella har en viktig RNase aktivitet som kan brukes for å velge sonder i stand til å spesifikt anerkjenne denne bakterien. Videre observerte vi at 2 '-OMe kjemisk modifisert nucleosides er mer egnet for den type RNAses skilles ut av Salmonella. Med dette i bakhodet tilbyr protokollen beskrevet i dette bidraget muligheten til å utforske bruken av nuklease aktivitet som en biomarkør.

Figure 1
Figur 1: bakterier kulturer og arbeidsflyt av screening prosessen. Utarbeidelse av bakteriekulturer og supernatanter (venstre). Beskrivelse av arbeidsflyten for de to screening-rundene. Første screening: innstillingen for DNA eller RNA evalueres ved hjelp av 10 sonder. Andre screening: basert på nukleinsyre yre preferanse, blir ytterligere sonder som inneholder kjemisk modifiserte nukleotider, evaluert for å identifisere de best ytende underlag for en gitt nuklease aktivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: første Kinetic screening runde. Kinetic profiler av Salmonella, E. coli og kultur Media (TSB) ved hjelp av DNA og RNA sonder. Nuklease aktivitet representeres av relative fluorescens enheter (RFU). Grafene er representative for minst 3 individuelt utførte eksperimenter. De ulike utvalgene er merket som angitt i diagrammets legende. Fold forskjell (FD) verdier ble beregnet ved hjelp av rate koeffisienter av Salmonella og E. coli for hver sonde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: andre Kinetic screening runde. Kinetic profiler av Salmonella, E. coli og kultur Media (TSB) ved hjelp av kjemisk modifiserte sonder. Nuklease aktivitet representeres av relative fluorescens enheter (RFU). Grafene er representative for minst 3 individuelt utførte eksperimenter. De ulike utvalgene er merket som angitt i diagrammets legende. Fold forskjell (FD) verdier ble beregnet ved hjelp av rate koeffisienter av Salmonella og E. coli for hver sonde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: nukleinsyre yre sonde sekvenser. Liste over alle nukleinsyre syre sonder som brukes i denne studien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: måling satt opp. Knappeklikk og dialogvinduer som beskriver trinnvis prosessen som er utført i anskaffelses programvaren for å definere de forskjellige målings parametrene. (A) desktop ikon. (B) oppgave bestyrer dialogue vindu. (C) prosedyre og temperatur sett opp dialogvinduer. (D) prosedyre og Kinetic Step dialogvinduer. (E) prosedyre og lesemetode dialogvinduer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: måling satt opp. Knappeklikk og dialogvinduer som beskriver trinnvis prosessen som er utført i anskaffelses programvaren for å definere de forskjellige målings parametrene. (A) prosedyre og Les trinn (Kinetic) dialog Vinduer. (B) prosedyre dialogvindu (C) "protokoll" menylinje. (D) Vel valg dialogvindu. (E) inn data boks for filnavn. (F) Kjør nytt ikon brukes til å starte oppkjøpet i programvaren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur 3: data analyse. Knappeklikk og dialogvinduer som beskriver trinnvis prosessen som er utført i anskaffelses programvaren for å eksportere hentede data til et regneark for videre analyse. (A) plate Matrix dialogvindu. (B) plate og vel utvalg dialogvinduer. (C) plate dialogvindu og rask eksport kontekstmeny. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 4
Supplerende figur 4: tredje screening runde (sekvens preferanse optimalisering). Beskrivelse av de ulike trinnene som er involvert i en ekstra screening-runde som tar sikte på å vurdere sekvens variasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 5
Supplerende figur 5: fjerde screening runde (spesifisitet evaluering runde). Beskrivelse av de ulike trinnene involvert i en ekstra screening runde rettet mot økende spesifisitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 6
Supplerende figur 6: femte screening runde (reaksjon parameter optimalisering). Beskrivelse av de ulike trinnene som er involvert i en ekstra screening runde som tar sikte på å redusere ikke-målet kryss reaktivitet ved modulerende nuklease aktivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Table 1
Supplerende tabell 1: rådata fra den første screening runde. For hver sonde (merket i rødt, på toppen), oppkjøpet tid og rå fluorescens verdiene ble rapportert for TSB, E. coli og Salmonella, sammen med beregnet rate verdi for hvert intervall. Beregningene ble utført som beskrevet i metodene delen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplementary Table 2
Tilleggs tabell 2: rådata fra andre screening runde. For hver sonde (merket i rødt, på toppen), oppkjøpet tid og rå fluorescens verdiene ble rapportert for TSB, E. coli og Salmonella, sammen med beregnet rate verdi for hvert intervall. Beregningene ble utført som beskrevet i metodene delen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplementary Table 3
Supplerende tabell 3: data analyse for første screening runde. For hver sonde (merket i rødt, på toppen), ble følgende verdier innhentet for TSB, E. coli og Salmonella: maksimal hastighet verdier, minimal og maksimal intervalltid poeng, rate koeffisient, fold forskjellen verdier mellom Salmonella og e. coli over TSB og fold forskjellen verdier mellom Salmonella og E. coli (uthevet i gult). Beregningene ble utført som beskrevet i metode delen, og beregningsformlene og trinnene for trinn-beregninger vises i regnearket. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplementary Table 4
Supplerende tabell 4: data analyse for andre screening runde. For hver sonde (merket i rødt, på toppen), ble følgende verdier innhentet for TSB, E. coli og Salmonella: maksimal hastighet verdier, minimal og maksimal intervalltid poeng, rate koeffisient, fold forskjellen verdier mellom Salmonella og e. coli over TSB og fold forskjellen verdier mellom Salmonella og E. coli (uthevet i gult). Beregningene ble utført som beskrevet i metode delen, og beregningsformlene og trinnene for trinn-beregninger vises i regnearket. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endringer av nuklease aktivitet har vært forbundet med en rekke sykdoms fenotyper, inkludert ulike typer kreft og bakterielle infeksjoner. Disse endringene er foreslått å være den utløsende Agent for en tilstand14, mens i andre tilfeller er de konsekvensen av en ugunstig fysiologisk hendelse20 eller sykdomsfremkallende agent16,26. Ikke overraskende, forsøk på å bruke nukleaser og nuklease aktivitet som en diagnostisk biomarkør har blitt beskrevet15,22,23,26, med betydelig løfte. Følgelig, etablering av en robust og reproduserbar screening tilnærming for systematisk evaluering av nuklease aktivitet i sykdom og for identifisering av spesifikke og sensitive reporter synes relevant. For å møte denne nødvendigheten, har vi utviklet en robust, modulær og enkel å implementere screening plattform basert på en fluorescens analysen, som tillater oppdagelsen av romanen sykdom biomarkører og identifisering av følsomme og spesifikke nukleinsyre syre sonder i parallell, ved hjelp av katalysator av nukleaser.

Kraftig screening verktøy som små molekyl høy gjennomstrømming screening (HTS)27, systematisk utvikling av ligander av eksponentiell BERIKELSE (SELEX)28 eller phage display29 har vært tidligere rapportert, som tillater identifisering av høy affinitet anerkjennelse molekyler (f. eks små molekyler, aptamers eller bindende-peptider). Til sammenligning, screening tilnærmingen som presenteres her tillater valg av sonder som kan identifisere kjente og ukjente nuklease aktivitet. Videre er denne tilnærmingen kompatibel med in vitro, ex vivo og in vivo screening modeller. Videre gir den reaktive natur nukleaser en åpenbar fordel i forhold til de nevnte tilnærmingene, ved at sonde-nuklease samhandling ikke er en statisk, men en dynamisk prosess. Dette betyr at nukleaser aktivitet blir en iboende signal forsterkning modul for reporteren sonder siden flere reporter sonder kan samhandle med en enkelt nuklease.

Som i alle andre screening metoden, er generering og forvaltning av den opprinnelige biblioteket avgjørende. Arten av nukleinsyre acid sonder gir stor fleksibilitet i design og etablering av et bibliotek og tillater innføring av varierende grad av kompleksitet avhengig av screening programmet. Biblioteket kompleksitet kan innføres på ulike nivåer, inkludert sekvens motiver, nukleotid kjemi, fosfat ryggraden kjemi, og oligonukleotid lengde. Modulerende kompleksiteten i biblioteket gjør det mulig å identifisere sonder, ikke bare for deres evne til å identifisere nuklease aktivitet forbundet med sykdom, men også for egenskaper som er kompatible med påfølgende in vivo applikasjoner. Videre, en nukleinsyre acid base biblioteket tilbyr flere fordeler over sitt antistoff eller peptid kolleger. På den ene siden er antistoff produksjon godt kjent for å være tungvint, som krever dyr eller komplekse eukaryote kultur systemer, noe som øker kostnadene og innføre batch variasjon30,31. Dessuten, den høye molekylvekt og immunogenisitet begrense deres anvendelse28,32. På den annen side, krever generering av biologiske peptid bibliotekene vanligvis enten viral eller bakteriell uttrykks systemer29,30, øke kompleksiteten i screening prosessen. Kjemisk peptid bibliotekene unngå dette problemet, på bekostning av å bruke convoluted perle-baserte systemer eller flere runder av dyre peptid syntese33. Alle disse problemene er omgås ved hjelp av en nukleinsyre acid bibliotek. Når den første biblioteket er etablert, screening metodene er raske og grei. Metoden som er beskrevet her, fungerer som en plattform for ytterligere screening runder, for eksempel, sekvens optimalisering (supplerende figur 4), spesifisitet evaluering (supplerende figur 5) eller optimalisering av modulatory elementer av nuklease aktivitet, slik som metall kofaktorer (typisk divalent) og chelater, som er svært nyttige for å øke spesifisitet av de valgte sonder (supplerende figur 6).

Den kinetisk fluorometric analysen som brukes i denne studien kan optimaliseres for både bakterielle og cellulære kulturer, med screening som utføres i brukervennlige mikrotiterbrønnene plater. Når det gjelder cellulære analyser, er denne protokollen kompatibel med både, suspensjon og monolag kulturer, som, etter optimalisering, kan brukes i henhold til nødvendigheter av in vitro-modellen som blir studert. Vi har identifisert flere kritiske trinn som krever optimalisering før screening. Disse inkluderer celle nummer eller bakteriell tetthet skal analyseres, sonde konsentrasjon, fluorometer detektor få innstillinger eller gjennomføringen av innebygde bakgrunnen korreksjon metoder. En begrensning av denne teknologien er behovet for en endret nuklease aktivitet knyttet til patologisk tilstand av interesse. Uten denne funksjonen er screening tilnærmingen for valg av kandidat sonder ikke gjennomførbart. En annen begrensning er selv-slukke evne til guanines når de er i umiddelbar nærhet til fluoroforen. Denne karakteristiske må vurderes ved utforming av biblioteket.

Enzymatisk natur reaksjonen måles gjør det nødvendig å vurdere plate lasting ganger. Minimering av innlastingstiden vil redusere bakgrunns forskjellene mellom ulike eksperimentelle forhold. Det finnes flere alternativer for å løse dette problemet, for eksempel redusere enzymatisk reaksjonen under lasting ved hjelp av iskald reagenser, eller ved hjelp av automatiserte lasting systemer, selv om sistnevnte øker kostnadene betraktelig, men også gjennomstrømningen. Videre, kinetisk målinger er en stor forbedring i forhold til statiske målinger, noe som gir et komplett og mer realistisk bilde av dynamikken i nukleaser ' katalysator.

Oppsummert, vår protokoll tilbyr en allsidig, robust og reproduserbar screening metode for identifisering av følsomme og spesifikke nukleinsyre acid sonder for påvisning av nuklease aktivitet knyttet til sykdommen, som overvinner store hekk av alternative screening metoder. Vi forventer at denne screening teknologien vil tillate utvikling av romanen diagnostiske verktøy i en rekke forhold, med lett translatability til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Luiza I. Hernandez (Linköping universitet) for henne nøye revisjon av manuskriptet og verdifulle råd. Dette arbeidet ble støttet av The Knut og Alice Wallenberg Foundation og det svenske Statens strategiske forskningsområde i materialvitenskap på Avansert Funksjonsmateriale ved Linköping universitet (fakultet Grant SFO-mat-LiU no. 2009-00971).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black bottom, non-treated 96 well plate Fisher Scientific 10000631
Cytation1 BioTek CYT1FAV
Eppendorf tubes Thermofisher 11926955
Escherichia coli ATCC 25922
Microbank cryogenic storage vial containing beads Pro-Lab Diagnostics 22-286-155
Nucleic acid probes Biomers.net #
Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 Gibco™ 14040117
Salmonella enterica subs. Enterica ATCC 14028
Tris-EDTA Fisher Scientific 10647633
Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood Thermo Fisher Scientific 10362223
Tryptic Soy Broth Sigma Aldrich 22092

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
  2. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
  3. Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
  4. Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
  5. Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
  6. Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
  7. Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, Pt 1 184-190 (2010).
  8. Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
  9. Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
  10. McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
  11. Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
  12. Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
  13. Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
  14. Keyel, P. A. Dnases in health and disease. Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).
  15. Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
  16. Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
  17. Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
  18. Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
  19. Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
  20. Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
  21. Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
  22. Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
  23. Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
  24. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
  25. Worthington Biochemical Corporation. Manual of Clinical Enzyme Measurements. , Worthington Diagnostics. (1972).
  26. Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
  27. Bibette, J. Gaining confidence in high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).
  28. Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
  29. Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
  30. Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
  31. Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
  32. Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
  33. Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).

Tags

Biokjemi screening metode nukleaser biomarkører nukleinsyre syrer sonder nuklease aktivitet diagnostisk verktøy substrat
Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Balian, A., Garcia Gonzalez, J.,… More

Balian, A., Garcia Gonzalez, J., Bastida, N., Akhtar, K. T. K., Borsa, B. A., Hernandez, F. J. Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes. J. Vis. Exp. (153), e60005, doi:10.3791/60005 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter