Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Denne protokollen gir et kraftig alternativ for screening nuklease aktivitet som biomarkør av sykdom, med en lett-å-implementere metodikk selv for forskere som ikke er så spesialisert på nukleinsyre sonder. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å velge nukleinsyrepromer som kan identifisere både kjente og ukjente nukleaseaktiviteter, og dra nytte av sonden-nuklease dynamisk interaksjon. Andre fordeler med denne metodikken er dens fleksibilitet, høy reproduserbarhet og brukervennlighet.

Demonstrasjonen vil bli utført av Khadija, en Masters student, og Baris, en postdoc fra vårt laboratorium. Ved utdesign av et oligonukleotidbibliotek, inkluderer minst ett DNA og en RNA tilfeldig sekvens som inneholder en kombinasjon av adenin, guanin, cytosin og tiamin eller uracil. For å forberede oligonukleotidsondene, spinn ned de lyofiliserte oligonukleotidsondene og fortynne hver sonde i Tris-EDTA-bufferen ved en 500 picomolar per mikroliterkonsentrasjon for å forhindre kjerneforringelse.

For bakteriell kultur på solid medium, rull en enkelt porøs glassperle fra kryogen lagring direkte på en kulturrett som inneholder TSA supplert med beruset saublod for å streke ut individuelle bakterielle kolonier. Plasser deretter platen ved 37 grader Celsius i 24 timer. For bakteriell kultur i flytende medium, overfør en enkelt koloni fra en solid medium kultur til 50 milliliter TSB for inkubasjon ved 37 grader Celsius i 24 timer ved 200 rotasjoner per minutt.

Neste dag, fortynne kulturen på en en til 500 ratio i frisk TSB og inkubere bakteriene i ytterligere 24 timer ved 37 grader Celsius og 200 rotasjoner per minutt i en risting inkubator. For å sette opp en kjerneaktivitetsanalyse, først forvarm et fluorometer til 37 grader Celsius og legg forsiktig til 96 mikroliter sterilt TSB eller supernatant fra en Salmonella eller E.Coli flytende medium kultur til en 1,5 milliliter kjernefri mikrocentrifugerør per sonde. Tilsett fire mikroliter sondearbeidsløsning til hvert rør og bruk en pipette til å blande innholdet i hvert rør grundig til homogene løsninger oppnås, og vær forsiktig for å unngå bobler.

Deretter legger du forsiktig 95 mikroliter av hver løsning nær veggen av individuelle brønner av en svart bunn, ikke-behandlet 96 brønnplate, og tar vare på å unngå bobler. Når alle løsningene er lagt til, dekk platen og inspiser lokket visuelt for pennemarkeringer eller støv som kan introdusere måleartefakter. Hvis du vil konfigurere programvaren for måling av kjerneaktivitet, åpner du et passende oppkjøpsprogram.

Velg Les nå i Oppgavebehandling-vinduet, og velg Ny for å opprette den kinetiske måleprotokollen. Klikk Angi temperatur for å velge 37 grader Celsius og bekreft og lagre innstillingene ved å klikke OK. Klikk Start kinetikk. I popup-vinduet velger du to timer i inndataboksen Kjøretid og to minutter i inndataboksen for intervall før du klikker OK for å bekrefte og lagre innstillingene.

Klikk på Les. I popup-vinduet velger du Fluorescence-intensitet som deteksjonsmetode, endepunkt kinetisk som lesetype og filtre som optikktype. Klikk deretter OK. Velg Grønn fra filtersettet i popup-vinduet, og klikk på OK. Velg Bruk lokk i Prosedyre-vinduet, og klikk på Valider.

Et popup-vindu vises som bekrefter at den opprettede protokollen er gyldig. Velg Prosedyre under Protokoll-menyen. I Prosedyre-vinduet definerer du brønnene som skal måles, og skriver inn navnet på eksperimentet i inndataboksen Filnavn.

Legg deretter platen inn i plateleseren, og ta vare på at platen er i riktig retning og klikker på Les ny-knappen for å starte oppkjøpet. For dataanalyse åpner du dataene i riktig analyseprogramvare, og velger en av de målte brønnene i plate ett vindu. Klikk velg brønner og ta med alle de målte brønnene i vinduet Brønnvalg før du klikker OK. Velg deretter Data i ett platevindu for å visualisere de tabulerte resultatene, og klikk på QuickExport for å eksportere dataene til et regneark.

Merk datakolonnene slik det passer for hvert eksempel og hver sonde, i et regneark, og plott de relative fluorescensenhetene kontra tid for dataene for å generere kinetiske grafer. I dette representative eksperimentet, etter den første runden med screening, rapporterte Salmonella-kulturens supernatanter en klar preferanse for RNA-sonder over DNA-sondene. Basert på identifisering av RNA som foretrukket nukleinsyretype av Salmonella-nukleaser, er et nytt RNA-bibliotek designet for bruk i andre runde av screening.

I motsetning viste E.Coli i kulturmediumkontroller en svært begrenset evne til å forringe RNA-sonder. Etter en andre runde med screening ved hjelp av kjemisk modifiserte nukleotider med sikte på å øke spesifisiteten til RNA-sondene, kunne RNA pyrimidin 2’O-metyl identifiseres på grunnlag av deres kjemiske modifikasjoner som viser den beste kinetiske oppførselen sammenlignet med henholdsvis RNA pyrimidin 2’fluor og RNA purine 2’fluoro. Disse resultatene tyder på at Salmonella har en viktig RNAse aktivitet med differensial substrat kjemi preferanse som kan brukes til å velge sonder som er i stand til å spesifikt gjenkjenne denne bakterien.

Denne prosedyren gjør det mulig å velge sonder som er i stand til å identifisere kjerneaktiviteter forbundet med sykdomstilstander, som kreft eller bakteriell infeksjon, slik at utviklingen av nye kliniske diagnostiske verktøy.