Summary
A presença de células-tronco cancerosas tem sido associada com recidiva ou desfechos ruins após a radioterapia. Este manuscrito descreve os métodos para estudar a radiosensibilidade de células-tronco cancerosas em linhagens celulares de câncer de pulmão.
Abstract
A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) tem sido associada à recidiva ou a desfechos ruins após a radioterapia. Estudar CSCs radioresistant pode fornecer indícios a superar o radioresistance. O canal de cálcio tensão-fechado α2δ1 o isoforma 5 da subunidade foi relatado como um marcador para CSCs radioresistant em linhas de pilha do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC). Usando o canal de cálcio α2δ1 subunidade como um exemplo de um marcador do CSC, os métodos para estudar a radiosensibilidade de CSCs em linhas de pilha de NSCLC são apresentados. Os CSCs são classificados com marcadores putativos por citometria de fluxo, e a capacidade de autorenovação das células classificadas é avaliada pelo ensaio de formação da esfera. O ensaio de formação de colônias, que determina quantas células perdem a capacidade de gerar descendentes formando a colônia após uma certa dose de radiação, é então realizada para avaliar a radiosensibilidade das células classificadas. Este manuscrito fornece os passos iniciais para o estudo da radiosensibilidade das CSCs, que estabelece a base para uma maior compreensão dos mecanismos subjacentes.
Introduction
A radioterapia desempenha um papel importante no tratamento do câncer. No entanto, a existência de células-tronco de câncer radioresistente (CSCS) pode levar a recidiva ou a desfechos ruins após a radioterapia1,2. As CSCs são caracterizadas por sua capacidade de autorenovação e capacidade de gerar células cancerosas heterogéneas3. Blindado com uma capacidade de reparo de dano de DNA mais eficiente ou níveis mais altos de sistemas de eliminação de radicais livres ou outros mecanismos, CSCS são relativamente resistentes à radioterapia4,5,6,7 , 8. identificar os marcadores CSC e explorar seus mecanismos facilitará o desenvolvimento de fármacos que superarão a radiorresistência sem aumentar o dano tecidual normal.
O canal de cálcio tensão-fechado α2δ1 o isoforma 5 da subunidade foi relatado como um marcador para CSCs radioresistant em linhas de pilha de NSCLC9. α2δ1 foi originalmente identificado como um marcador CSC para carcinoma hepatocelular (HCC)10. Usando a imunização subtrativas com um par de linhas de pilha de HCC derivadas dos tumores preliminares e periódicos no mesmo paciente, um anticorpo nomeado 1b50-1 foi identificado para alvejar pilhas periódicas do HCC especificamente. as pilhas 1b50-1-positive mostraram a eficiência elevada da formação da esfera in vitro e o tumorigenicidade elevado in vivo. Seu antígeno foi identificado por espectrometria de massas, como canal de cálcio α2δ1 subunidade isoforma 5. α2δ1 expressa especificamente em CSCs e é indetectável em a maioria de tecidos normais, fazendo lhe um candidato potencial para alvejar CSCs10. α2δ1 pode igualmente servir como um marcador do CSC para linhas de pilha de NSCLC, e foi mostrado para transmitir radioresistance às pilhas de NSCLC parcialmente realçando a eficiência do reparo dos danos do ADN em resposta à radiação9.
Estudar CSCs radioresistant pode fornecer indícios a superar o radioresistance. Usando α2δ1 no NSCLC como um exemplo, os métodos principais para estudar a radiosensibilidade de CSCs são apresentados. Geralmente, CSCS são isolados com um marcador de superfície putativo, e as características da pilha de haste e a radiosensibilidade das populações positivas e negativas da pilha são comparadas. A formação da esfera em um meio soro-livre suplementado com os fatores de crescimento que apoiam a Self-renovação é um ensaio útil para avaliar o células das pilhas in vitro. Células com alta capacidade de formação de esfera são susceptíveis de apresentar tumorigenicidade elevada quando injetadas em camundongos imunodeficientes10,11,12. O ensaio de formação de colônias é então usado para avaliar a radiosensibilidade das células, o que determina quantos perderam a capacidade de gerar descendentes formando a colônia após uma dose de radiação13.
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Protocol
Nota: as etapas são executadas a temperatura indicada. Para as etapas em que a temperatura não é mencionada, execute a temperatura ambiente (18 – 25 ° c). O meio de cultura celular deve ser armazenado a 4 ° c, e outros reagentes devem ser armazenados de acordo com as guias do fabricante. O meio deve ser pré-aquecido a 37 ° c antes de ser adicionado às células.
1. classificação de células
- Conjugação de anticorpos
Nota: Considerando o tempo mais curto da incubação, o anticorpo direto-etiquetado é preferido para a classificação da pilha. Se não houver nenhum anticorpo comercial com rótulo direto disponível, use reagentes conjugantes de fluoresceina para conjugar o anticorpo a um corante fluorescente de acordo com o guia do fabricante (consulte a tabela de materiais). Porque as pilhas serão cultivadas após a classificação, todas as etapas devem ser executadas em um armário de segurança biológico ou em um banco limpo laminar. Para evitar a contaminação, recomenda-se a adição de antibióticos (penicilina e estreptomicina) ao meio de cultura após a triagem.- Adicione 1 μL de reagente modificador para cada 10 μL de anticorpo a ser rotulado. Misture suavemente.
- Adicione a mistura de anticorpo e modificador diretamente sobre a fluoresceina liofilizada. Pipet suavemente. Deixe o frasco para injetáveis de pé durante 3 h ou durante a noite à temperatura ambiente (RT) no escuro.
- Adicionar 1 μL de reagente de quencher para cada 10 μL de anticorpo. O conjugado pode ser usado após 30 min. O conjugado de fluoresceina pode ser armazenado a 4 ° c por até 18 meses.
- Antes da triagem, recomenda-se a titulação de anticorpos conjugados. Prepare as células que expressam (por exemplo, H1299 ou A549 para α2δ1) e não expressam (por exemplo, H1975) o marcador. Aliquot as células e incubar-as com anticorpos em diferentes concentrações (por exemplo, 15 μg/mL, 7,5 μg/mL, 1,5 μg/mL e 0,75 μg/mL, respetivamente).
- Realize análises citométricas de fluxo (com histograma ou gráfico de pontos) e escolha a concentração na qual células positivas de H1299 ou A549 podem ser separadas do controle isotipo e as células H1975 têm sinais pouco específicos.
- Rotulagem celular
- Cultura A549 células em RPMI 1640 meio suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) em 10 cm pratos a 37 ° c e 5% CO2 em uma incubadora de cultura celular. As células Digest como segue para a classificação quando atingem 80% – 90% confluência (cerca de 5 – 10 x 106 células por prato).
- Remova o meio de cultura. Lave as células com 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) brevemente. Adicione 3 mL de 0, 5% de tripsina a cada prato. Retire a tripsina e deixe a tripsina residuária para digerir as células a 37 ° c durante 1 – 3 min. Verifique o descolamento das células com frequência para evitar a digestão excessiva.
Nota: algumas linhas de célula podem ser relativamente difíceis de digerir, tais como linhas de célula NSCLC H520 e PC9. Em tal situação, 3 mL de tripsina pode ser deixada no prato, em vez de digestão com tripsina residual. Além disso, o tempo de digestão pode ser estendido. - Quando as células ficam soltas e começam a separar-se dos pratos, adicione 3 mL de RPMI 1640 meio suplementado com 10% FBS e pipeta a suspensão celular em um tubo de 50 mL.
- Centrifugador a 300 x g a 4 ° c durante 5 min. descarte o sobrenadante. Adicionar 10 mL de PBS para Ressuspender as células. Transferir 0,5 mL (ou pelo menos 5 x 105 células) de suspensão celular para um novo tubo como um controle isotipo. As células restantes são para classificação.
- Centrifugue os tubos de controlo e experimentais a 300 x g a 4 ° c durante 5 min. descarte o sobrenadante.
- Prepare a solução de trabalho para a coloração diluindo o controle fluorescente do isotipo corante-conjugado ou o anticorpo em PBS à concentração óptima titulada como mencionado acima.
Nota: neste experimento, o FITC-conjugated 1B50-1 (o anticorpo de α2δ1) foi diluído em 7,5 μg/mL. O volume de solução de trabalho depende da quantidade da célula. - Ressuscitem as células de controle e experimentais com cada solução de trabalho em cerca de 2 – 5 x 107 células/ml e misture suavemente. Incubar as amostras em RT por 30 – 40 min no escuro.
- Lave as células adicionando 10 mL de PBS a amostras, misture suavemente e centrifugue a 300 x g a 4 ° c durante 5 min. descarte o sobrenadante. Reressuscitem as células com 10 mL de PBS.
- Coloque filtros de células de 40 μm em novos tubos de 50 mL para controle e células experimentais, respectivamente. Aplique a suspensão da pilha no filtro e colete o fluxo-através de.
Nota: esta etapa remove os grupos de células que podem bloquear o capilar do classificador de células. - Centrifugue o fluxo através de 300 x g a 4 ° c durante 5 min. descarte o sobrenadante. Ressuspender as células com 0,2 – 1,0 mL de PBS e depois transferi-los para um tubo de 5 mL para citometria de fluxo.
- Triagem celular por citometria de fluxo
- Prepare dois tubos de 5 mL para recolher as populações de células positivas e negativas. Adicione 1 mL de meio RPMI 1640 em cada tubo. Coloque os tubos na plataforma de coleta do classificador de células.
- Analise as células de controle e as células experimentais respectivamente com o gráfico de pontos. Porta as células ao vivo com os parâmetros de dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC). Porta a população positiva e negativa de células ao vivo de acordo com a intensidade FL-1.
- Coletar as células α2δ1-positivas e α2δ1-células negativas. Registre o número de células obtidas.
- Para confirmar que as populações colhidas da pilha têm o nível diferente da expressão α2δ1, uma reacção em cadeia quantitativa do polymerase (QPCR) pode ser executada.
- Extraia o RNA de pilhas positivas e negativas com o reagente do tiocianato do guanidina e transcrição reversa o RNA no cDNA de acordo com o guia do fabricante. Realize QPCR com reagente verde SYBR. As sequências de primers são as seguintes: α2δ1-F, CAGTTGAGATGGAGGATGATG; α2δ1-R, TTGTATGAGCAGTCGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; e GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.
2. ensaio de formação de esfera
Nota: o ensaio de formação de esfera é aplicado para determinar a capacidade de autorenovação das células. Células com capacidade de autorenovação poderiam formar esferas neste meio semi-sólido sem soro suplementado com fatores de crescimento. Todas as etapas devem ser executadas em um armário de segurança biológico ou em um banco limpo laminar. Para evitar a contaminação, recomenda-se a adição de antibióticos (penicilina e estreptomicina) ao meio de cultura após a triagem.
- Preparação média
- Prepare o meio DMEM/F-12 2x reconstituindo um pacote de 1 L de pó DMEM/F-12 em 475 mL de água destilada. Adicionar 2,438 g de NaHCO3. Ajuste o pH para 7,0 – 7,2 Adicionando lentamente 1 N NaOH ou 1 N HCl com agitação. Adicionar água destilada a um volume final de 500 mL. Esterilizar o meio filtrando através de um filtro de 0,2 μm.
- Prepare uma solução de metilcelulose a 2% adicionando 2 g de metilcelulose em 100 mL de água destilada. Autoclave a solução. O metilcelulose pode mostrar um algodão-como o estado após autoclaving. Misture-o invertendo a garrafa para cima e para baixo suavemente por algumas vezes e deixá-lo para o resfriamento natural. Ele vai se tornar um semi-sólido transparente durante a noite.
- Para obter 20 mL de meio de autorenovação, adicione 10 mL de meio 2x DMEM/F-12 a um tubo de 50 mL. Adicionar 400 μL de B27 ao meio. Adicionar fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF) a uma concentração final de 25 ng/mL. Adicione o fator de crescimento básico humano recombinante do fibroblasto (bFGF) a uma concentração final de 25 ng/mL. Adicione 2% de metilcelulose para atingir um volume final de 20 mL.
- Misture o meio por vórtice para que o meio de autorenovação seja obtido.
- Semeadura de células
- Transfira as células colhidas para o meio de autorenovação para alcançar 2000 células/mL e misture-as com um breve vórtice. Adicionar 100 μL de suspensão de células a cada poço de um acessório ultrarrápido 96 placa de poço. Não use os poços na borda da placa, porque o meio é mais provável evate nestes poços. Adicionar água esterilizada a estes poços.
- Cultura a 37 ° c com 5% de CO2 em incubadora de cultura celular por 10 – 14 dias. Adicionar 50 μL de meio de autorenovação no dia 5 – 7.
- Contagem e cálculo da esfera
- 10 – 14 dias após a semeadura, contar o número de esferas com mais de 50 células (aproximadamente) ou com um diâmetro superior a 100 μm um microscópio (lente objetiva 4x, ocular 10x).
Nota: a partir da parte superior esquerda do poço, conte as esferas ao mover a tabela objetiva horizontalmente para a direita com o joystick do microscópio. Em seguida, mova a tabela objetiva para a linha do meio do campo visual e conte as esferas da direita para a esquerda. Em seguida, mova para a linha inferior e conte da esquerda para a direita. Um poço da placa do poço 96 pode ser contado dentro de três fileiras. - Calcule a eficiência da formação da esfera como o número de esferas divididas pelo número de células semeadas. Compare a eficiência da formação da esfera entre as populações de células positivas e negativas.
- 10 – 14 dias após a semeadura, contar o número de esferas com mais de 50 células (aproximadamente) ou com um diâmetro superior a 100 μm um microscópio (lente objetiva 4x, ocular 10x).
3. ensaio de formação de colónias
Nota: o ensaio de formação de colônias é aplicado para determinar a radiosensibilidade das células. A radiação pode ser entregada por um acelerador linear usado para a radioterapia. O sistema da irradiação da pilha para o uso do laboratório pode igualmente ser usado se o equipamento está disponível. As etapas 3,1, 3.2.3, e 3.2.6 devem ser executadas em um armário de segurança biológico ou em um banco limpo laminar. Para evitar a contaminação, recomenda-se a adição de antibióticos (penicilina e estreptomicina) ao meio de cultura após a triagem.
- Semeadura de células
- Prepare uma placa de 6 poços para cada dose de radiação, incluindo o grupo 0 GY. Adicione 1,5 mL de meio a cada poço de 6 placas de poço. O meio de cultura para o ensaio de formação de colônias é o meio convencional RPMI 1640 suplementado com 10% FBS (nomeado como "completado 1640").
- Diluir as células colhidas com o meio 1640 completo para 1000 células/mL.
- Adicione a suspensão celular aos poços. Agitar as placas horizontalmente para fazer as células distribuírem uniformemente nos poços. Registre o volume adicionado em cada grupo de dose.
Nota: geralmente, sementes 200 células por poço para 0 GY, 200 células para 2 GY, 400 células para 4 GY, 800 células para 6 GY, e 1600 células para 8 GY, respectivamente. É melhor ajustar os números de célula em células não classificadas em pré-experimentos. - Cultura em 37 ° c com 5% CO2 na incubadora da cultura de pilha.
- Radiação
- Depois que as pilhas se acoplaram à parte inferior dos poços (geralmente um dia após a semeadura, e um tempo mais longo não é recomendado que considera a proliferação de pilha), continue a executar a radiação da pilha.
- Calcule o número de unidades monitoras (MU) para cada dose a uma profundidade de 1 cm em um campo de radiação de 20 cm x 20 cm.
Nota: número de MU = dose (cGy)/fator de saída para o campo de radiação/dose de profundidade percentual (PDD) para a profundidade. Por exemplo, o fator de saída para um campo de 20 cm x 20 cm é 1, 66, PDD para 1,0 cm é 0,987, e o número de MU para 8 GY (800 cGy) é 760 (800/1.066/0.987 = 760,35). Se várias placas precisam ser irradiadas para cada dose, um campo maior também pode ser usado, e os números de MU precisam ser recalculados de acordo com o tamanho do campo. Fator de saída e PDD diferem em diferentes aceleradores. Refira os físicos da radiação para estes parâmetros. - Adicionar 1640 completado a cada poço para chegar a 1 cm para a altura do meio.
Nota: a área de crescimento celular de 6 placas de poço pode ser encontrada no guia do fabricante. Por exemplo, se a área de crescimento é 9,5 cm2 para cada poço de 6 placa bem, e 1,5 ml de médio e 0,4 ml de suspensão celular foi adicionado no dia anterior, em seguida, adicione 7,6 ml médio para o poço. A altura é necessária para a acumulação da dose. Não é recomendada uma altura média inferior A 0,8 cm.
Nota: Mantenha as placas cobertas durante a radiação. Quando as placas são transferidas entre a sala da cultura da pilha e a sala da terapia de radiação, enrole as placas com folha de alumínio ou põr as em uma caixa limpa para evitar a contaminação. Segure as placas planas para evitar derramando meio para fora. - Defina um campo de radiação de 20 cm x 20 cm. Coloc um bolus tecido-equivalente da espessura de 1,0 cm no sofá do tratamento, e coloc a placa de 6 poços no bolus para mantê-los no contato. Certifique-se de que toda a placa está dentro do campo de radiação. Ajuste a distância da pele da fonte como 100 cm. Alinhe o nível de superfície médio ao nível do laser ajustando a altura do sofá do tratamento.
Nota: as placas com a mesma dose de radiação podem ser irradiadas ao mesmo tempo. Para este caso, um campo de radiação maior é necessário, e o número de MU deve ser recalculado de acordo com o fator de saída correspondente. Certifique-se que todas as placas estão dentro do campo de radiação. - Entregue cada dose atribuída a cada placa em sequência.
Atenção: o acelerador linear só pode ser operado por técnicos qualificados. Afaste-se da radiação. - Leve as placas de volta para a sala de cultura celular. Mude o meio com 2 mL de meio completo para cada poço. Cultura em 37 ° c com 5% CO2 na incubadora da cultura de pilha. Mude o meio a cada 3 – 5 dias.
- Mancha
- 7 – 10 dias após a radiação, quando muitas colônias se formam e antes de crescer muito grande e se fundem, em seguida, realizar a coloração e contando como segue. Retire o meio e lave brevemente com PBS. Adicione 1 mL de formaldeído a 4% a cada poço para fixar as células.
Cuidado: o formaldeído é volátil. Use o formaldehyde em uma capa das emanações. - Após 10 min de fixação, retire o formaldeído e lave com 2 mL de água destilada cada um bem duas vezes.
- Adicionar 1 mL de 1% de cristal violeta mancha solução para cada poço. Mancha por 10 min. Retire a solução de coloração violeta cristalina e lave com água destilada 3 vezes. Retire a água e seque as placas.
- 7 – 10 dias após a radiação, quando muitas colônias se formam e antes de crescer muito grande e se fundem, em seguida, realizar a coloração e contando como segue. Retire o meio e lave brevemente com PBS. Adicione 1 mL de formaldeído a 4% a cada poço para fixar as células.
- Contagem e cálculo de colônias
- Conte o número de colônias com mais de 50 células. Não inclua pequenas colônias com menos de 50 células. Verifique as colônias um microscópio para obter uma impressão de uma colônia constituída por 50 células e marcá-la na parte inferior da placa com uma caneta marcador.
Nota: fotografar os poços e usar o software ImageJ facilitará o processo de contagem. - Calcule a eficiência da formação da colônia como o número de colônias divididas pelo número de células semeadas. Calcule a fração de sobrevida como a eficiência da formação de colônias em uma certa dose de irradiação dividida pela eficiência da formação de colônias em 0 GY.
- Usando a dose como o eixo x e a fração de sobrevivência como o eixo y, uma curva de sobrevivência pode ser obtida. Compare as curvas de sobrevida entre as populações de células positivas e negativas.
- Conte o número de colônias com mais de 50 células. Não inclua pequenas colônias com menos de 50 células. Verifique as colônias um microscópio para obter uma impressão de uma colônia constituída por 50 células e marcá-la na parte inferior da placa com uma caneta marcador.
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Representative Results
α2δ1-alta e α2δ1-baixa A549 células foram classificadas (Figura 1a). Alguns marcadores podem mostrar populações distintas e são fáceis de portão. No entanto, alguns marcadores apenas mostram padrões de expressão alta e baixa, em vez de populações distintas positivas e negativas. Nessa situação, um controle de isotipo é muito importante para gating. A expressão de α2δ1 em células classificadas é validada pelo qPCR. A expressão de CACNA2D1, o gene que codifica α2δ1, é maior em células classificadas α2δ1-altas em comparação com α2δ1-células baixas (Figura 1b).
A morfologia típica das esferas é mostrada na Figura 2a. A eficiência da formação da esfera é calculada em α2δ1-alto e α2δ1-células baixas (Figura 2b). α2δ1-as células altas apresentaram maior eficiência na formação da esfera, sugerindo maior capacidade de autorenovação. Imagens típicas de colônias de células são mostradas na Figura 3a. Uma colônia com cerca de 50 células pode ser examinada um microscópio e marcada como referência. Uma fração de sobrevida em cada dose pode ser calculada, e as curvas de sobrevida são apresentadas na Figura 3B. α2δ1-células altas são relativamente resistentes à radiação em comparação com α2δ1-células baixas.
O teste tde Student não pareado de dois lados foi realizado para avaliar a significância entre os grupos. Um valor de p < 0, 5 foi considerado estatisticamente significante. Os dados são representados com a média e o desvio padrão (DP). Dados representativos de pelo menos três experimentos biologicamente independentes com resultados semelhantes são apresentados.
Figura 1: classificação α2δ1-alta e α2δ1-células baixas em A549. (A) análise citométrica de fluxo representativo da expressão de α2δ1. As células são bloqueadas com base no controle isotipo. (B) confirmação da expressão de α2δ1 em populações altas e baixas por qPCR. As barras de erro indicam SD. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ensaio de formação de esfera das células α2δ1-alta e α2δ1-baixa A549. (A) morfologia representativa das esferas formadas pelas células α2δ1-altas e α2δ1-Low classificadas (bar = 200 μm). (B) eficiência de formação de esfera de α2δ1-alta e α2δ1-células baixas. As barras de erro indicam SD (* * * p < 0, 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ensaio de formação de colônias de células α2δ1-alta e α2δ1-baixa A549. (A) imagens representativas das colônias formadas pela α2δ1-alta e α2δ1-células baixas classificadas. (B) curvas de sobrevida de α2δ1-alta e α2δ1-células baixas. Os números de células semeadas foram 200 células por poço para 0 GY, 400 células por poço para 4 GY, e 800 células para 8 GY. As barras de erro indicam SD (* * p < 0, 5, * * * p < 0, 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve métodos para estudar a radiosensibilidade de CSCs em linhas de células cancerosas in vitro. Neste estudo, a expressão de α2δ1 é contínua em linhagens de células NSCLC. Portanto, a gating é baseada em um controle isotipo. Antes da triagem, a expressão de α2δ1 deve ser examinada em várias linhas celulares por citometria de fluxo e validada por QPCR ou Western Blot. Recomenda-se a reanálise da expressão α2δ1 das células α2δ1-High e α2δ1-Low classificadas por citometria de fluxo, observando a fluorescência um microscópio fluorescente, ou por QPCR (após a triagem).
O ensaio de formação de esfera é uma forma simples de avaliar a capacidade de autorenovação, que pode ser usada para caracterizar preliminarmente as CSCs putativas. Este método tem sido utilizado para a cultura de neuroesferas ou mamoferas para caracterizar células-tronco em glioma ou células cancerosas de mama, e a fórmula é modificada para a cultura de outros tipos de câncer4,6,10. O EGF e o bFGF podem apoiar a autorenovação das células estaminais no meio livre de soro; no entanto, os fatores médios e de crescimento básicos podem diferir para a cultura de diferentes tipos de células. O meio semi-sólido é usado para imobilizar as células para que as esferas sejam formadas por proliferação celular, em vez de aglomeração em conjunto. A placa de fixação ultralow é utilizada no experimento para manter a morfologia da esfera. Além disso, à medida que as CSCS são enriquecidas após a cultura da esfera, quando as esferas são coletadas, digeridas e semeadas para a formação da esfera secundária, a eficiência da formação da esfera é susceptível de aumentar na subsequente propagação serial9,10. Um critério mais rigoroso para caracterizar CSCs é o ensaio de diluição limitante in vivo, no qual uma série de números de células positivas e negativas classificadas são injetadas por via subcutânea em camundongos imunodeficientes, então as frequências das células tumorigênicas em positivo e as populações de células negativas são calculadas10,14. Se um marcador putativo de células-tronco de câncer for identificado por ensaio de formação de esfera, recomenda-se uma caracterização adicional por ensaio de diluição limitante in vivo.
Neste estudo, a radiosensibilidade das CSCs é avaliada. O ensaio de formação de colônias é uma forma clássica de avaliar a radiosensibilidade. Semeando o mesmo número de células em poços paralelos em importantes. Ajuste o número da célula por mL para um intervalo adequado para garantir que o volume de suspensão celular adicionado a cada poço seja superior a 100 μL. Se o volume for muito pequeno, o erro provavelmente será aumentado. Para a radiação da pilha, o meio com uma altura de 1 cm é adicionado para a acumulação da dose, e um bolus tecido-equivalente é coloc a placa para o backscatter da dose. Os pesquisadores são recomendados para se referir aos físicos de radiação e técnicos para configurar o modelo de radiação celular e calcular a dose.
Este manuscrito fornece os passos iniciais para o estudo de radiosensibilidade das CSCs. Estudos de mecanismos adicionais podem envolver proteínas relacionadas ao reparo de danos no DNA, liberação de espécies reativas de oxigênio, parada de ciclo celular, etc.15. Esses experimentos precisam de uma grande quantidade de células; Portanto, muitos pratos de células são necessários para ser preparado. A superexpressão ou nocaute/knockdown de genes CSC também fornecem insights importantes sobre como os CSCs ganham radioresistência.
Estes métodos podem potencialmente ser aplicados para identificar CSCs em tecidos de cancro. Zhang et al. descreveram isolando células CD166-positivas de Lin-negativas das amostras cirúrgicas de NSCLC12. Os tecidos foram cortados com uma lâmina estéril e digeridos com um cocktail enzimático. As células coletadas passando por filtros de células foram rotuladas para triagem e, em seguida, caracterizadas por ensaio de formação de esfera e ensaio de diluição in vivo limitante. Para α2δ1 como um marcador do CSC, relatou-se para isolar o CSC em tecidos cirúrgicos hepatocelular da carcinoma e nos tecidos pacientes do xenograft do cancro do pulmão da pilha pequena10,16. Considerando um elevado número de células são necessários para a análise, é relativamente difícil isolar CSCs em biópsias ou células tumorais circulantes. Alternativamente, manchar as seções das biópsias pode potencialmente fornecer indícios para a existência de CSC nos tumores. No entanto, esta aplicação presuntiva precisa ser avaliada nos tecidos do paciente e dados clínicos.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81402535 e 81672969) e pelo projeto de pesquisa e desenvolvimento chave nacional (2016YFC0904703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
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