Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Analysen for Blood-Brain Barrier integritet i Drosophila melanogaster

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60233
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Loyola University Chicago

Summary

Blod-hjerne barriere integritet er avgjørende for nervesystemet funksjon. I Drosophila melanogasterdannes blod-hjerne-barrieren av gliacellene celler i løpet av sen embryogenesis. Denne protokollen beskriver metoder for å analysen for blod-hjerne barriere dannelse og vedlikehold i D. melanogaster embryo og tredje skikkelsen larver.

Abstract

Riktig nervesystemet utvikling omfatter dannelsen av blod-hjerne-barriere, diffusjon barriere som tett regulerer tilgang til nervesystemet og beskytter nevrale vev fra toksiner og patogener. Defekter i dannelsen av denne barrieren har blitt korrelert med nevropatier, og nedbryting av denne barrieren har blitt observert i mange nevrodegenerative sykdommer. Derfor er det avgjørende å identifisere gener som regulerer dannelse og vedlikehold av blod-hjerne barriere å identifisere potensielle terapeutiske mål. For å forstå den eksakte rollene disse genene spiller i neural utvikling, er det nødvendig å analysen effekten av endrede genuttrykk på integriteten av blod-hjerne barriere. Mange av molekylene som fungerer i etableringen av blod-hjerne-barrieren har blitt funnet å være bevart over eukaryote arter, inkludert frukten fly, Drosophila melanogaster. Frukt fluer har vist seg å være et utmerket modell system for å undersøke den molekylære mekanismer som regulerer nervesystemet utvikling og funksjon. Denne protokollen beskriver en trinnvis fremgangsmåte for å analysen for blod-hjerne barriere integritet under den embryonale og larvestadiet stadier av D. melanogaster utvikling.

Introduction

Under utvikling, celle-celle kommunikasjon og interaksjoner er avgjørende for etablering av vev og organ struktur og funksjon. I noen tilfeller, disse celle-celle interaksjoner forsegle organer fra omgivelsene for å sikre riktig organfunksjon. Dette er tilfelle for nervesystemet, som er isolert av blod-hjerne barriere (BBB). Dysfunksjon av BBB hos mennesker har vært knyttet til nevrologiske lidelser, inkludert epilepsi, og sammenbrudd av barrieren har blitt observert i nevrodegenerative sykdommer, inkludert multippel sklerose og amyotrofisk lateral sklerose1. I pattedyr, BBB er dannet av stramme veikryss mellom endothelial celler2,3. Andre dyr, inkludert frukten fly, Drosophila melanogaster, har en BBB sammensatt av gliacellene celler. Disse gliacellene cellene danner en selektivt gjennomtrengelig barriere for å kontrollere bevegelse av næringsstoffer, avfallsprodukter, toksiner, og store molekyler inn og ut av nervesystemet4. Dette gjør det mulig for vedlikehold av elektrokjemiske gradient nødvendig å brann handling potensialer, slik at for mobilitet og koordinering4. I D. melanogaster, glia beskytte nervesystemet fra kalium-rik, blod-lignende hemolymph5.

I det sentrale nervesystemet (CNS) og perifere nervesystemet (PNS) av D. melanogaster, to ytre gliacellene lag, subperineurial glia og perineurial glia, samt et ytre nettverk av ekstracellulære matrise, den nevrale lamella, danner hemolymph-hjerne og hemolymph-nerve barriere6, referert til som BBB gjennom denne artikkelen. Under utvikling subperineurial glia bli polyploid og forstørre å omgi nervesystemet5,6,7,8,9,10,11 . Den subperineurial glia form septate veikryss, som gir den viktigste diffusjon barriere mellom hemolymph og nervesystemet5,6,12. Disse knutepunktene er Molecularly lik den septate-lignende veikryss funnet på paranodes av myelinating glia i virveldyr, og de utfører samme funksjon som stramme veikryss i BBB av pattedyr13,14, 15 priser og , 16 flere , 17. perineurial glia dividere, vokse, og vikle rundt subperineurial glia å regulere spredningen av metabolitter og store molekyler6,10,18,19. BBB formasjon er fullført ved 18,5 h etter egglegging (AEL) ved 25 ° c5,8. Tidligere studier har identifisert gener som er kritiske regulatorer av BBB formasjon20,21,22. For bedre å forstå de eksakte rollene til disse genene, er det viktig å undersøke effekten av mutasjon av disse potensielle regulatorer på BBB integritet. Mens tidligere studier har skissert tilnærminger for assaying BBB integritet i embryo og larver, en omfattende protokoll for denne analysen har ennå ikke beskrevet5,7. Denne trinn-for-trinn protokollen beskriver metoder for assaying BBB integritet under D. melanogaster embryonale og tredje skikkelsen larvestadiet stadier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. samling av prøver

  1. Embryo samling
    1. I hvert oppsamlings bur for embryo bruker du minimum 50 jomfru hunner med 20 − 25 hanner for kolleksjoner. Ruge disse fluer i en flaske med cornmeal-agar mat (tabell av materialer) for 1 − 2 dager før begynnelsen av samlingene23.
      Merk: Flere fluer kan brukes, men kvinne-til-mann forholdet bør holdes på 2:1.
    2. Pre-Warm eple juice agar plater (tabell 1) ved 25 ° c over natten.
      Merk: Dette er nødvendig for riktig regi av embryo. Hvis platene tørker ut raskt, tilsett en bolle med vann til inkubator for å øke fuktigheten i kammeret.
    3. Bedøve fluer fra trinn 1.1.1 med CO2 og overføre fluer til en samling bur. Plasser en pre-varmet eple juice agar plate med en liten flekk av gjær lim på den åpne enden og sikker til buret med den røde ermet (tabell av materialer). For å fjerne eldre embryo, tillate fluer å legge embryo/egg på en eple juice agar plate for 1 h ved 25 ° c.
    4. Fjern oppsamlings RAM men fra inkubator. Inverter buret mesh side ned og trykk fluer ned til bunnen av buret. Erstatt eple juice agar med en ny pre-varmet eple juice agar plate med en liten flekk av gjær lim. Kast den første platen.
    5. Tillat fluer å legge embryo/egg på den nye eple juice agar plate for 1 h ved 25 ° c. Kast denne platen etter 1 h-kolleksjonen og Fortsett til neste trinn for å samle inn embryo til injeksjon.
    6. For å samle inn sent stadium 17 embryo (20 − 21 h AEL), la fluer i ønsket genotype fra trinn 1.1.1 − 1.1.5 å legge på en ny forvarmet eple juice agar plater med en liten flekk av gjær lim ved 25 ° c for 1 t. alders plate for 19 timer i en 25 ° c inkubator , så embryo vil være 20 − 21 h av alder på tidspunktet for bildebehandling.
      Merk: Dette trinnet kan gjentas etter ønske for flere runder med prøvetaking, injeksjon og bildebehandling.
    7. Samle embryo fra plater i en celle sil med 70 μm nylon mesh ved å legge fosfat-bufret saltvann (PBS) med 0,1% ioniske overflateaktivt middel (PBTx; Tabell 1) å dekke overflaten av platen og løsne embryo fra overflaten ved hjelp av en pensel.
    8. Dechorionate embryo samlet i cellen sil i en 50% blekemiddel løsning (tabell 1) i en 100 mm Petri parabolen i 5 min med sporadiske agitasjon ved romtemperatur. Skyll embryo 3x ved å virvlende celle sil i PBTx i en Petri parabol, ved hjelp av en fersk rett av PBTx hver gang.
    9. Hvis alle embryo er av riktig genotype, gå direkte til trinn 1.1.10. Hvis generering av embryo av riktig genotype krever et kors med heterozygot fluer, velger embryo av riktig genotype ved hjelp av tilstedeværelse eller fravær av fluorescensmerkete merket balanserer kromosomer. Bruk en stereomikroskopet med fluorescerende egenskaper for genotype valg.
      Merk: Balanserer kromosomer merket med deformert-gult fluorescerende protein; Kruppel-GAL4, UAS-grønn fluorescerende PROTEIN (GFP); og Twist-Gal4, UAS-GFP fungerer godt for genotype utvalg i slutten av embryogenesis (tabell 2)24,25,26.
    10. Bruk et glass pipette, overføre embryo i PBTx til en 2% agarose gel SKIVE (tabell 1). Fjern overflødig væske med filter papir. Juster ~ 6 − 8 embryo på 2% agarose gel skive med bakre høyre og rygg side vendt opp (figur 1B).
      Merk: Mikropyl, det lille hullet der spermatozoa inn i egget, ligger på den fremre enden av fosteret. Den bakre enden er mer avrundet. Luftrøret vises hvitt og ligger dorsalt i fosteret, noe som åpner for skillet mellom rygg og ventrale sider av fosteret (figur 1B).
    11. Forbered et lysbilde med ett stykke dobbeltsidig tape. Trykk godt på lysbildet på toppen av embryo for å overføre dem til dobbeltsidig tape.
    12. Desiccate embryo ved inkubasjons ved romtemperatur i ~ 25 min (ingen tørkemiddel brukes). Etter uttørking, dekk embryo med halocarbon olje.
      Merk: Uttørking perioder kan variere avhengig av temperatur, fuktighet og ventilasjon i rommet. Inkubasjonsperioden skal brukes til å sette opp apparatet for injeksjon og konfokalmikroskopi mikroskop for bildebehandling, som beskrevet i avsnitt 2 og 3 i denne protokollen.
  2. Larvestadiet-kolleksjonen
    1. Sett opp et kors med 5 − 10 jomfru kvinnelige fluer av ønsket genotype og halvparten så mange menn av ønsket genotype i et hetteglass med cornmeal-agar mat og ruge ved 25 ° c23.
    2. Etter 5 − 7 dager, avhengig av genotype, samle vandre tredje skikkelsen larver fra hetteglasset forsiktig med tang. Skyll Larvene i 1x PBS å fjerne mat stakk til larvene. Overfør larver til en eple juice agar plate for genotyperingteknologi som beskrevet i trinn 1.1.9 om nødvendig.
    3. Roll larver på et vev ved hjelp av en pensel for å tørke dem av. Overfør 6 − 8 larver til en sklie tilberedt med dobbeltsidig tape ved hjelp av tang.

2. utarbeidelse av nåler og prøve injeksjon

  1. Pull nåler på en micropipette avtrekker før initiering av denne protokollen. Sikre kapillærrør i nålen avtrekker og trekk i henhold til standard nål form og parametre for D. melanogaster injeksjoner (tabell 3)27. Oppbevar nåler i en Petri rett ved forankring i leire til bruk for injeksjon.
  2. Legg en nål med 5 μL 10 kDa-dextran som bøyes likt til sulforhodamine 101 yre klorid (tabell med materialer) ved hjelp av et pipette tips på 20 μL gel-lasting i løpet av 25-min uttørking periode for embryo (trinn 1.1.12), eller umiddelbart etter overføring av Larvene til raset (trinn 1.2.3).
  3. Legg nålen i en nål holder og plasser i en micromanipulator festet til en stål Base (tabell av materialer).
    Merk: Nålen bør være nesten parallell til mikroskopet scenen for embryo injeksjon og vinklet litt nedover for larvestadiet injeksjoner.
  4. Sett injeksjons apparatet (materialfortegnelsen) til 50 PSI, 5 − 10 MS med en rekkevidde på 10.
    Merk: Det kan være nødvendig å endre disse innstillingene for det bestemte injeksjons apparatet som brukes.
  5. Plasser lysbildet på scenen og pensle kanten av nålen mot kanten av dobbeltsidig tape på en 45 ° vinkel for å skape en vinklet, brutt spissen.
    Merk: For embryo er det bare nødvendig å bryte spissen nok til å muliggjøre flyt av de 10 kDa-dextran. En perfekt nål har en litt vinklet spiss og bare en liten dråpe fargestoff vil komme ut med hver injeksjon. For larver er det nødvendig å bryte spissen mer, men med et vinklet tips for å trenge inn i larvestadiet kropps vegg. En større dråpe av fargestoff vil komme ut.
  6. Pump fotpedalen til fargestoffet er på tuppen av nålen.
  7. Rett inn nålen slik at den er parallell med fosteret eller vinklet litt nedover mot Larven.
  8. Beveg nålen for å stikke hull på den bakre enden av prøven og injisere prøven ved å pumpe fotpedalen. Injiser ~ 2 nL av fargestoff inn i embryo, og ~ 220 nL av fargestoff i larver.
    Merk: Fosteret eller Larven skal oversvømme med fargestoff hvis injeksjonen er vellykket.
  9. Legg merke til injeksjons tidspunktet for inkubasjons formål. Ruge embryo i 10 min ved romtemperatur. Ruge larver i 30 minutter ved romtemperatur.
  10. Fortsett nedover lysbildet for å injisere flere eksemplarer, og noter deg injeksjons tidspunktet for hver prøve.
    Merk: Avhengig av hastigheten som påfølgende disseksjon og bildebehandlings trinn kan utføres med, kan 4 − 8 eksemplarer injiseres om gangen.

3. utarbeidelse av prøver for Imaging

  1. Bilde av embryo
    1. Etter injeksjon, Forbered embryo for bildebehandling. Påfør vaselin med en bomulls spiss applikator på høyre og venstre side av prøvene på lysbildet som en spacer for å hindre skade på embryo ved plassering av dekkglass.
    2. Bilde prøver ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop gjennom dybden på fosteret med en 20x objektiv. Beregn prosentandelen av totalt antall prøver med fargestoff observert i ventrale nerve ledningen (VNC) ved hjelp av følgende ligning:% av prøver med kompromittert BBB = antall prøver med fargestoff akkumulering i VNC/totalt antall prøver analyseres.
  2. Disseksjon og bilde av larver
    1. Forbered lysbilder for larvestadiet prøver forut for sin tid. Monter to coverslips linjeavstand ca 0,5 cm fra hverandre til raset med neglelakk.
      Merk: Coverslips fungerer som avstandsstykker for hjernen, så det er ikke skadet under monteringsprosessen.
    2. Etter 30 min inkubasjons, analysere Larvene i 1x PBS direkte på lysbildet som skal brukes i Imaging. Bruk først ett par tang for å fange Larven halvveis ned i larvestadiet kropp, og bruk enda et par tang til å skille de fremre og bakre halvdelene av Larven.
    3. Deretter bruker du ett par tang til å gripe den fremre regionen på munnen kroker, og bruke en andre par tang for å invertere kroppen veggen over tuppen av pinsett gripe munnen kroker. Hjernen og VNC vil bli utsatt.
    4. Skill hjernen og VNC fra kroppen veggen ved severing nervene, og fjerne kroppen veggen fra raset (figur 1C, D). Fjern imaginal plater hvis ønskelig.
    5. Dekk prøven med 10 μL av 80% glyserol og Plasser en dekkglass på toppen av prøven for bildebehandling.
    6. Bilde gjennom dybden av nervesystemet vev ved hjelp av en 20x objektiv. Beregn prosentandelen av totalt antall prøver med fargestoff observert i VNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metodene som er beskrevet her tillate for visualisering av integriteten til BBB hele CNS i D. melanogaster embryo og larver (figur 1). Ved ferdigstillelse av BBB formasjon i slutten av embryogenesis, den BBB funksjoner for å utelukke store molekyler fra hjernen og VNC5. Denne protokollen utnytter denne funksjonen til analysen BBB formasjon. Når vill-type (Oregon R) sent stadium 17 (20 − 21 h gammel) embryo ble injisert med 10 kDa dextran som ble bøyd til sulforhodamine 101 yre fluorescerende fargestoff, ble det store dextran molekylet ekskludert fra VNC, som forventet (figur 2A). For å demonstrere effekten av genetiske mutasjoner på BBB integritet, embryo med mutasjoner i rå genet ble utnyttet. Tidligere har rå genet blitt demonstrert for å regulere bakterie band tilbaketrekking under embryogenesis, og mer nylig har vist å fungere i glia å regulere morfologiske endringer i VNC under utvikling28. Heterozygot RAW1 mutant EMBRYO utstilt en intakt BBB, ligner på resultatene observert i vill-type kontroll embryo (figur 2B). I kontrast homozygote rå1 mutant embryo utstilt defekter i integriteten til BBB, med 10 KDA dextran fargestoff flom i VNC, indikerer at BBB ikke klarte å danne (figur 2C). Disse resultatene viser muligheten for denne teknikken til analysen BBB formasjon under embryonale stadier.

Tidligere studier har vist at en defekt i subperineurial glia polyploidization resulterer i en forstyrrelse av BBB som kan observeres i tredje skikkelsen larvestadiet stadier7,9. Således, defekter i BBB formasjon og/eller vedlikehold kan resultere i en kompromittert BBB under senere stadier av utvikling, noe som gjør det ønskelig å analysen integritet av barrieren i tredje skikkelsen larvestadiet scenen. Derfor er protokollen benyttet for assaying BBB integritet i embryonale stadier har også blitt optimalisert for bruk i larver. I Oregon R kontroll eksempler, 10 kDa dextran ikke klarer å trenge inn i BBB og er utelukket fra hjernen og VNC (figur 2D, E). Fargestoffet akkumuleres i utkanten av BBB.

Figure 1
Figur 1: nervesystemet i trinn 17 embryo og tredje skikkelsen Larven. (A) skjematisk av en ventrale syn på en etappe 17 embryonale sentralnervesystemet (CNS). Den CNS består av hjernen (Br) og ventrale nerve ledningen (VNC), som har dorsoventral kanaler (CH). Mikropyl (MP; pilspissen) i fremre ende kan brukes til å orientere fosteret. Bakre til høyre. (B) etappe 17 embryo orientert med rygg side opp og bakre til høyre, som anbefalt i trinn 1.1.10. Pilene peker til luftrøret. Pilspissen angir MP. Bakre til høyre. (C) skjematisk av nervesystemet i tredje skikkelsen Larven. Hjernen (Br) og VNC komponere CNS, mens nervene strekker seg fra VNC synapse på kroppen veggen muskler og er en del av PNS. Bakre til høyre. (D) dissekert tredje skikkelsen larvestadiet hjerne og VNC. Bakre til høyre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: analyse for blod-hjerne barriere (BBB) formasjon. (A-C) Sent stadium 17 embryo (20 − 21 h gammel) injisert posteriort med 10 kDa sulforhodamine 101 syre klorid dextran. Bakre. Scale bar = 20 μm. Prikker sett i kontroller er dorsoventral kanaler som spenner over ventrale nerve ledningen (VNC). (A) Oregon R-kontroll. Dye opptak i 6,25% av prøvene, n = 16. (B) rå1/+ søsken kontroll. Dye opptak i 6,67% av prøvene, n = 15. (C) homozygote RAW1/1 mutant. Dye opptak i 100% av prøvene, n = 22. (D) Oregon R Control tredje skikkelsen larvestadiet hjernen. Dye akkumuleres på BBB, men ikke trenge inn i CNS, n = 7. Scale bar = 50 μm. (E) Oregon R Control tredje SKIKKELSEN larvestadiet VNC. Dye akkumuleres på BBB, men ikke trenge inn i CNS, n = 11. Stiplet linje skisserer VNC. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: midttarm morfologi i slutten av embryoutvikling. Overførte lys bilder av scenen 13 − 17 embryo tillate visualisering av gut morfologi (mørkegrå regioner i bakre halvdel av fosteret). Midttarm morfologi kan brukes til å bestemme stadium av embryoutvikling, som er nyttig når avgjøre om embryo blir alderen hensiktsmessig for injeksjon. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Løsning Oppskrift
2% Agarose gel Tilsett 0,8 g agarose til 40 mL dobbel destillert H2O (ddH2O) i en Erlenmeyer kolbe og mikrobølgeovn for å oppløse agar. Hell i en gel avstøpning skuffen og la gelen til å stivne i 30 min ved romtemperatur.
Eple juice agar plater Mål 45 g av agar og 1,5 L av ddH2O i en 4 L kolbe. Autoklav for 40 − 45 min ved 121 ° c. Mål 50 g sukker og 0,5 L av Eple saft i en 1 L begeret og rør på lav varme (innstilling 3) for å oppløse sukker, ta vare ikke å brenne den. Etter autoklavering, tilsett forvarmet sukker og Eple saft til agar og vann. Rør på lav med varmen av for å la avkjøles før du kan røre den. Tilsett 15 mL 70% tegosept og rør for å spre. Hell i et 0,5-liters beger. Spray med etanol for å fjerne bobler eller flamme med en Bunsen brenner. Hell i 60 mm Petri retter. Tillat å sette i minst 24 h, eller til det er minimal kondens på lokkene på Petri retter og oppbevares ved 4 ° c.
50% blekemiddel Tilsett 15 mL ddH2O og 15 ml husholdningsblekemiddel i et konisk rør.
80% glyserol For 10 mL, tilsett 8 mL autoklaveres ddH2O og 2 ml glyserol til en 15 ml konisk rør. Ruge på en rocker til løsningen er homogen.
1x PBS For 1 L, fortynne 100 mL på 10x PBS i 900 mL av ddH2O.
10x PBS For 2 L, oppløse følgende i 1 600 mL ddH2O: 160 g av NaCl, 4 g KCl, 28,8 g av na2HPO4, og 4,8 g av KH2PO4. Juster pH til 7,5 med HCl.
PBTx (PBS + 0,1% ioniske overflateaktivt middel) For 1 L, Kombiner 100 mL på 10x PBS, 10 mL 10% ioniske overflateaktivt middel, og 890 mL av ddH2O.
70% Tegosept Bland 1 g av p-hydroksybenzosyre syre, metyl Ester for hver 10 mL 100% etanol. Oppbevares ved-20 ° c.
10% ioniske overflateaktivt middel For 50 mL, tilsett 45 mL autoklaveres ddH2O og 5 ml ioniske overflateaktivt middel til et konisk rør. Roter på vippebryteren til løsningen er homogen.
Gjær lim Bland tørr aktiv gjær med ddH2O i en 50 ml plast beger til glatt.

Tabell 1: reagenser og buffere som brukes i denne protokollen.

Genotype Lager
w [1118]; ln (2LR) GLA, WG [GLA-1]/CyO, P {w [+ mC] = GAL4-Twi. G} 2.2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH 2.2 Bloomington-#6662
w {*]; SNA [SCO]/CyO, P {w [+ mC] = DFD-EYFP} 2 Bloomington-#8578
w {*]; L [2] PIN [1]/CyO, P {w [+ mC] = GAL4-Kr. C} DC3, P {w [+ mC] = UAS = GFP. S65T} DC7 Bloomington-#5194
DF (1) JA27/FM7c, P {w [+ mC] = GAL4-Kr. C} DC1, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC5, sn [+] Bloomington-#5193
w [*]; ry [506] Dr [1]/TM6B, P {w [+ MC] = DFD-EYFP} 3, SB [1] TB [1] ca [1] Bloomington-#8704
y [1] w [*]; D [*] GL [3]/TM3, P {w [+ mC] = GAL4-Kr. C} DC2, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC10, SB [1] Bloomington-#5195
Oregon R Flere stammer tilgjengelig
RAW [1] cn [1] BW [1] SP [1]/CyO Bloomington-#2749
P {w [+ mW. HS] = GawB} Elav [C155] Bloomington-#458
w [1118]; P {w [+ m *] = GAL4} repo/TM3, SB [1] Bloomington-#7415
P {UAS-GFP} Flere stammer tilgjengelig

Tabell 2: fly stammer. Fly stammer diskutert gjennom denne protokollen. Bloomington Drosophila Stock Center Lagernummer er tilgjengelig der det er aktuelt.

Syklus Varme Trekke Hastighet Tid Press Rampen
1 590 115 15 250 600 X
2 575 130 60 250 600 X

Tabell 3: Micropipette avtrekker innstillinger. Micropipette avtrekker innstillinger som brukes til å generere sprøyter for injeksjon i denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen gir en omfattende beskrivelse av trinnene som trengs for å analysen for BBB integritet i slutten av embryonale og tredje skikkelsen larvestadiet stadier av D. melanogaster utvikling. Lignende tilnærminger har blitt beskrevet andre steder for å analysen integriteten til BBB under utvikling, samt i voksen etapper5,7,29,30. Men beskrivelser av prosedyrer i materialer og metoder seksjoner er ofte bred i naturen og mangler tilstrekkelig detalj for enkel implementering, nødvendiggjør betydelig feilsøking på vegne av forskeren. Denne protokollen gir en omfattende beskrivelse av trinnene som trengs for å analysen for BBB integritet under embryonale og larvestadiet stadier. I hvert trinn, er det kritiske skritt som skal følges for å sikre at den riktige fasen av utviklingen blir undersøkt og vev arkitektur er ikke forstyrret, noe som kan kompromittere BBB. For å oppnå suksess i disse tilnærmingene var det nødvendig å feilsøke flere trinn i protokollen for å gi nøyaktige resultater. Kritiske skritt i de embryonale og larvestadiet protokollene er beskrevet nedenfor.

Tidligere studier har rapportert etablering av BBB av 18,5 h AEL5. For å sikre nøyaktig utviklingsmessige timing, er det viktig å opprettholde prøvene ved en konstant temperatur under aldring. Ved innsamling av embryo, bør Apple juice agar platene bringes til 25 ° c før bruk for innsamling. Bruke Apple juice plater som ikke har vært pre-varmet resulterer i tregere utvikling og kan gi prøver som ennå ikke har etablert en BBB og vil derfor vise opphopning av 10 kDa dextran i nervesystemet. Derfor er det viktig å sørge for at man injiserer prøver som er eldre enn 18,5 h. i tillegg, når du utfører disse eksperimentene i embryo, er det nødvendig å vurdere muligheten for en utviklingsmessige forsinkelse, fordi en slik forsinkelse kan bare resultere i den senere etableringen av BBB. For å gjøre rede for mulige utviklingsmessige forsinkelser, ble prøvene analyseres ved 20 − 21 timer AEL, litt etter rapportert BBB-formasjon. Ved hjelp av morfologi av andre vev, spesielt utvikle midttarm, kan bistå i å etablere den riktige fasen av utviklingen av fosteret blir analyseres (Figur 3). Omvendt, uriktig eksperimentell timing kan resultere i prøver som allerede er aktive og har begynt klekking prosessen. For å redusere antall larver som allerede har startet klekking, er det viktig å utføre minst to 1 t samlinger for å fjerne eldre embryo fra kvinner før du samler Foster til injeksjon. Hvis analyse av BBB i første skikkelsen larver er ønsket, en kort inkubasjons av larver i 1x PBS i en 9-brønn på isen kan brukes til å redusere motilitet før injeksjon. Lysbilder kan også holdes på en isen Pack under injeksjon prosedyre for å redusere motilitet.

For å sikre kvalitet bilder og nøyaktige resultater når det gjelder etablering av BBB i fosteret, må flere trinn følges nøye gjennom hele prosedyren. Når lining opp embryo på agar skive, bør luftrøret være vendt opp, da dette er rygg side av fosteret (figur 1B). Når embryo overføres til lysbildet med dobbeltsidig tape, vil den ventrale siden av fosteret da bli vendt opp, slik at for optimal visualisering av nerve ledningen under konfokalmikroskopi Imaging senere i protokollen. Embryo må også festes godt til dobbeltsidig tape for å hemme bevegelse under injeksjon. Bruken av en flat 2% agarose pad gjør at forskeren å skyve lysbildet med dobbeltsidig tape fast på embryo under overføringsprosessen uten risiko for skade på embryo. Etter overføring til raset, er uttørking nødvendig for å hindre fosteret fra sprengning ved fargestoff injeksjon. Injeksjon av for mye fargestoff kan også føre til at fosteret å sprekke. Det er viktig å bare sette nålen inn i fosteret nok til å injisere fargestoff, men ikke så mye at nålen potensielt punktering nervesystemet, noe som vil gi et falskt positivt resultat. For stor av en punktering såret kan også resultere i hemolymph og fargestoff flom ut av fosteret, fører til et mislykket eksperiment. Med disse potensielle fallgruvene i tankene, er injeksjon mest vellykket med en nål som har en liten vinkel til spissen, slik at det er et lite punkt som å nøye punktering av embryo.

I tilfelle av assaying larver for BBB integritet, utfordringer kan oppstå på grunn av motilitet av prøven. Bruk av høy kvalitet dobbeltsidig tape er avgjørende, som det skal være effektiv i immobilizing larver for injeksjon. Hvis Larven blir unstuck, kan den rulles tilbake på tapen og skyves forsiktig ned for å resecure den. Ved transport av larver for injeksjon, er det nyttig å bære raset i en Petri parabolen i tilfelle Larvene blir unstuck. Trinnene etter injeksjon krever mest forsiktighet for å unngå avbrudd av BBB. For å minimere potensiell skade på prøven, er det enklest å analysere prøven direkte på lysbildene som skal brukes til bildebehandling. Hvis Larven er sterkt festet til tapen ved overføring av prøven for disseksjon, kan en dråpe 1x PBS legges til tapen for å løsne vedheft og for å muliggjøre overføring til raset for disseksjon. Etter disseksjon er det viktig å flate ut prøven tilstrekkelig for å unngå falske positive resultater, men ikke så mye at prøven integritet er kompromittert. Sandwiching Larven mellom dekkglass og raset ved hjelp av ekstra coverslips som avstandsstykker hindrer hjernen fra å bli skadet, men likevel immobilizes prøven for effektiv bildebehandling.

For å oppnå suksess med protokoller for både embryo og larver, er det avgjørende å sørge for at injeksjons apparatet og konfokalmikroskopi mikroskop er satt opp før prøve behandlingen begynner. Dette gjør det mulig for nøyaktig timing i Imaging av prøvene, som er nødvendig for eksempel sammenligning. Andre tilnærminger har benyttet mer avansert injeksjon satt ups, krever en invertert mikroskop satt opp for embryo injeksjon. Denne protokollen benytter en standard dissekere mikroskop og micromanipulator med en trykk regulator. I dette tilfellet var en sebrafisk injeksjon satt opp bare tilpasset for injeksjon av fly embryo og larver. Denne protokollen kan forenkles ytterligere for å bruke en micromanipulator med en sprøyte til injeksjon også. Mange av disse verktøyene er lett tilgjengelig i biologi avdelinger og kan også være tilgjengelig i klasserommet laboratorie innstillinger, noe som åpner for maksimal enkel protokoll gjennomføring.

Under bildebehandling prosedyren, kan det være nyttig å merke cellene i nervesystemet til lettere å identifisere ønsket område for Imaging. Nærmere bestemt kunne man bruke GAL4/UAS-systemet til å uttrykke GFP i enten neurons eller glia, ved hjelp av Elav-GAL4 eller repo-GAL4 stammer, henholdsvis (tabell 2)31,32,33. Slik merking vil gi en kontrast med sulforhodamine 101 syre klorid dextran å visualisere integriteten til nervesystemet.

Mens denne metoden er fokusert på assaying integriteten til BBB under utviklingen av D. melanogaster, kan denne tilnærmingen tilpasses for å undersøke integriteten til andre barrierer på tvers av en rekke organismer og vev. For eksempel har lignende protokoller blitt publisert for assaying av BBB i mus34. I tillegg permeabilitet av blod-Eye barriere og somatiske barriere rundt Bakteriecellene under spermatogenesis i D. melanogaster bruke en lignende tilnærming29,35. Protokollen kan også tilpasses for bruk i andre vev for å teste permeabilitet, inkludert i tarmen. Når du tilpasser denne protokollen for bruk i andre vev eller arter, vil det være nødvendig å vurdere størrelsen av molekyler som kan trenge gjennom barrieren, som det er mulig at 10 kDa dextran kan være liten nok til å trenge gjennom noen barrierer. Samlet gir denne protokollen en trinnvis fremgangsmåte for å analysen for BBB integritet under D. melanogaster utvikling som lett kan tilpasses for bruk i andre innstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. F. Bryan Pickett og Dr. Rodney Dale for bruk av utstyr til injeksjon. Dette arbeidet ble finansiert av forskningsmidler fra Loyola University Chicago til MD, D.T., og JJ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran ThermoFisher Scientific D1863 Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips Eppendorf 22351656
100% Ethanol (200 proof) Pharmco-Aaper 11000200
Active Dry Yeast Red Star
Agar Fisher Scientific BP1423
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Air Compressor DeWalt D55140
Apple Juice Mott's Natural Apple Juice
Bleach Household Bleach 1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Bottle Plugs Fisher Scientific AS-277
Cell Strainers BD Falcon 352350
Confocal Microscope Olympus FV1000 Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator Puritan 19-062614
Double-Sided Tape 1/2" Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip Roboz RS-5015
Fly Food Bottles Fisher Scientific AS-355
Fly Food Vials Fisher Scientific AS-515
Foot Pedal Treadlite II T-91-S
Gel Caster Bio-Rad 1704422
Gel Tray Bio-Rad 1704436
Glass Pipette VWR 14673-010
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Granulated sugar Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil Lab Scientific, Inc. FLY-7000
Light Source Schott Ace I
Manipulator Stand World Precision Instruments M10
Micromanipulator World Precision Instruments KITE-R
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Needle Holder World Precision Instruments MPH310
Nightsea Filter Sets Electron Microscopy Science SFA-LFS-CY For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head Electron Microscopy Science SFA-RB For visualization of GFP
Paintbrush Simply Simmons Chisel Blender #6
Pipetter Fisher Scientific 13-683C
Pneumatic Pump World Precision Instruments PV830 This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Small Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-100
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Steel Base Plate World Precision Instruments 5052
Stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000 Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source Baytronix Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) Genesee Scientific 20-258
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 Nonionic surfactant
Vial Plugs Fisher Scientific AS-273

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  2. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  3. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
  4. Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
  5. Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
  6. Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
  7. Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
  8. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
  9. Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
  10. von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
  11. Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
  12. Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
  13. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  14. Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
  15. Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
  16. Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
  17. Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
  18. von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
  19. Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
  20. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
  21. Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
  22. DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
  23. BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
  24. Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
  25. Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
  26. Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
  27. Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
  28. Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
  29. Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
  30. Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
  31. Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
  32. Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
  33. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  34. Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
  35. Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).

Tags

Utviklingsbiologi Drosophila melanogaster blod-hjerne barriere glia nervesystemet ventrale nerve ledningen embryo Larven
Analysen for Blood-Brain Barrier integritet i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J.… More

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233, doi:10.3791/60233 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter