Système de micro-injectrode pour l'infusion combinée de drogue et l'électrophysiologie

L'électrophysiologie et les méthodes d'injection de médicaments sont largement utilisées en neurosciences pour étudier l'activité et le comportement neuronaux, in vivo, chez les rongeurs et les primates. Au cours des trois dernières décennies, les améliorations des premiers modèles d'injection ont permis une technique plus précise et moins invasive, et l'enregistrement simultané et l'injection de drogues à des sites cérébraux spécifiques^1,2^,3. Pour les primates en particulier, la capacité de délivrer avec précision de petits volumes avec des dommages minimes aux tissus est essentielle si la technique doit être utilisée pour l'étude des fonctions cognitives avancées qui nécessitent des animaux hautement qualifiés. Les progrès récents incluent des mesures électrophysiologiques et chimiques chroniques en combinaison avec la stimulation utilisant des sondes implantées⁴, et l'enregistrement combiné et l'administration de médicaments microfluidiques a récemment été mis à l'essai chez les rongeurs⁵. Le système d'injection décrit ici permet l'enregistrement électrophysiologique, la stimulation, et l'administration précise de médicaments, et il a déjà été mis en œuvre avec succès dans plusieurs laboratoires de primates^6,7,8.

La disponibilité croissante de capteurs délicats et spécialisés, tels que les nanocapteurs^9,10 avec des applications de neurosciences, exige une méthode fiable pour obtenir la sonde à travers la dura mater sans endommager les dispositifs nanométriques fragiles ou des pointes de microélectrode.

Nous avons conçu un système de micro-injectrode qui surmonte les défis techniques de combiner ces méthodes en utilisant des composants facilement disponibles et peu coûteux, et facilite deux fonctions principales: (i) La capacité de placer une sonde expérimentale fragile, comme un microélectrode ou nanocapteur, à travers le dura mater et le tissu neural, protégé de tout dommage. Cette fonctionnalité permet de placer la sonde expérimentale à des endroits ciblés, livré en utilisant la canule comme un guide à travers le tissu neural. (ii) La capacité d'utiliser un microélectrode pour effectuer des expériences combinant des enregistrements d'électrophysiologie et de stimulation électrique avec l'injection de médicaments.

Notre système utilise un tube guide pour pénétrer dans la dura, avec une canule qui fonctionne à la fois pour la livraison de médicaments (lors de l'utilisation du système pour la microinfusion) et fournit une protection supplémentaire pour la microélectrode ou nanocapteur (à la fois lors du passage à travers la dura et tissu neural). Ce système peut être facilement construit avec des composants largement disponibles dans le commerce, qui sont peu coûteux et faciles à trouver. Nous minimisons les dommages de pénétration en utilisant une canule de petit diamètre (oD de diamètre externe - 235 m, ID de diamètre intérieur - 108 m).

Nous présentons ici des instructions étape par étape pour la construction et la configuration micro-injectrode du système microfluidique. Nous expliquons les étapes nécessaires à l'utilisation du microinjectrode, indépendamment ou couplé au système microfluidique pour l'injection de drogues. Une approche similaire peut être appliquée avec n'importe quelle sonde expérimentale fragile, comme un nanocapteur^9,10. La sonde peut être chargée à l'avant ou à l'arrière dans la canule (selon la conception), et sera protégée contre les dommages lors de la pénétration du tissu dura et neuronal. Nous fournissons des exemples de données d'une expérience in vivo avec des primates non humains, dans laquelle nous avons utilisé un microélectrode de tungstène pour effectuer la stimulation électrique, et ensuite injecté du muscimol dans le champ oculaire frontal (FEF) tandis que l'animal a effectué une mémoire guidée saccade (MGS) tâche.

Les procédures expérimentales ont suivi le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et la Society for Neuroscience Guidelines and Policies. Les protocoles pour les procédures expérimentales et comportementales ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Utah.

1. Construction du Microinjectrode pour la stimulation et l'enregistrement (Figure 1a)

1. Mesurer la longueur de la canule et de la sonde (dans cet exemple un nanocapteur). La sonde doit être plus longue que la canule par la longueur qu'elle doit dépasser de la pointe de la canule (selon la conception de la sonde) plus environ 2 cm.
2. Sous un grossisseur ou un microscope (grossissement de 10x), chargez la sonde dans la canule; si possible, un rechargement est préférable pour protéger la pointe de la sonde.
   REMARQUE: Cette étape, effectuée manuellement, est difficile. Il est recommandé de pratiquer avec un microélectrode sous une loupe avant d'essayer avec une sonde expérimentale réelle.
3. Passer la canule (contenant la sonde) à travers la ferrule supérieure, la jonction En et la ferrule inférieure.
   1. Si la sonde n'est qu'un seul fil sans pièces jointes, rechargez-la dans le canule et insérez l'assemblage dans la jonction En T à partir de la ferrule inférieure. Le haut de la canule (côté plat) doit être placé au milieu de la jonction T, dans le fond, mais pas la ferrule supérieure. La sonde expérimentale ou le biocapteur doit dépasser au-dessus du haut de la ferrule supérieure.
      REMARQUE: Des ferrules sur mesure peuvent également être faites en perçant un trou dans les bouchons de ferrule à l'aide de micro-morceaux de forage, la taille du trou étant basée sur le diamètre nécessaire pour serrer la canule à la jonction T.
4. Utilisez la clé ferrule pour resserrer les ferrules sur le dessus et le bas de la jonction En. Ne pas trop serrer. Un petit morceau de tuyauterie peut être ajouté pour renforcer le support d'électrode dans la ferrule supérieure.
5. Épingles en or de soudure à chacun des terminaux de sonde (signal, sol, etc.), selon les spécifications de la sonde.
6. Ajuster la position relative de la sonde et de la canule. Mesurez la distance que la sonde dépasse de la canule sous grossissement, et ajustez manuellement à partir de l'extrémité supérieure (la sonde peut glisser librement dans les ferrules).
7. Ajouter de la colle époxy entre les broches d'or et la ferrule supérieure pour attacher la sonde à la ferrule.
8. Dévisser la ferrule supérieure pour rétracter la sonde à l'intérieur de la canule. Confirmer visuellement que la sonde est entièrement dans la canule sous grossissement.
9. Fixez l'injectrode au microdrive.

2. Construction du Microinjectrode pour l'infusion de drogues (Figure 1b)

1. Fixez le « non-beveled » ou l'extrémité plate de la canule au fond de la jonction de T à l'aide d'une ferrule. Utilisez la clé de ferrule pour resserrer la ferrule.
2. Fixez un petit morceau de tube capillaire (1,5 cm) au sommet de la jonction T en le passant à travers la ferrule standard. Resserrer avec une clé de ferrule.
3. Chargez le microélectrode à travers le tube capillaire, la jonction En, la canule et les ferrules correspondantes.
4. Assurez-vous que l'extrémité arrière de l'électrode dépasse de moins de 1 cm de l'arrière du tube capillaire, et que la pointe de l'électrode dépasse de la canule à la distance désirée du côté inférieur. La position de l'électrode peut être ajustée manuellement à partir du haut de gamme.
5. Souder une broche d'or au terminal de microélectrode.
6. Ajouter de la colle époxy entre la goupille d'or et la ferrule supérieure pour attacher le microélectrode à la ferrule.
7. Dévisser la ferrule supérieure pour rétracter la sonde à l'intérieur de la canule. Confirmez visuellement que le microélectrode est entièrement rétracté dans la canule.

3. Construction du circuit microfluidique (Figure 2)

1. Placer une planche à pain sur une surface stable. Placez les deux vannes à trois voies parallèles aux côtés les plus longs de la planche à pain, à environ 6 po l'un de l'autre avec un port (celui qui est toujours ouvert) face à face. Utilisez des vis pour fixer les vannes à la planche à pain.
2. Placez une règle à côté des vannes (pour mesurer et suivre le mouvement des fluides à l'intérieur du tube capillaire).
3. Chargez un mélange d'huile de viscosité faible de 1:1 et de colorant alimentaire (marqueur) dans la seringue étanche et placez-le dans la pompe Marker. Coupez un morceau de tubes capillaires et utilisez des ferrules standard et des connecteurs À verrouillage Luer pour connecter la seringue à l'un des ports de la soupape d'entrée. C'est la "ligne de repère".
4. Coupez un court morceau de tube capillaire pour la « ligne de règle ». Utilisez des ferrules standard pour serrer aux ports de face des vannes.
5. Couper deux tubes capillaires plus longs pour relier la soupape de sortie au microinjectrode et pour connecter la pompe Drug à la soupape d'entrée (utiliser des ferrules standard).
   REMARQUE: La longueur de ces deux lignes dépend de la configuration expérimentale, l'une doit être assez longue pour atteindre de l'appareil de perfusion à l'animal, et l'autre de la pompe de drogue à la valve d'entrée. Utilisez une pierre de clivage pour couper le tube capillaire.

4. Montage du Microinjectrode au Microdrive (Figure 3)

1. Assurez-vous que la sonde microélectrode/expérimentale est rétractée dans la canule avant le montage.
   REMARQUE: Le tube guide doit être en position en micropropulsion.
2. Fixez un adaptateur sur mesure au microinjectrode.
3. Chargez le microinjectrode à travers le tube guide et fixez-le à l'adaptateur à l'aide de vis.
4. Mesurer la position microdrive (profondeur) à laquelle le microinjectrode dépasse du tube guide, puis rétracter 1 cm pour se préparer à l'insertion.
5. Pour les expériences de microinfusion, connectez la « ligne cérébrale » à l'ouverture inutilisée de la jonction T du microinjectrode. Utilisez une ferrule standard et serrez avec la clé de ferrule.

5. Flushing et préparation du système microfluidique

1. Placez le microdrive avec le microinjectrode sur un bécher.
2. Chargez la chlorhexidine (p. ex. nolvasan; dissous à 20 g/L) dans la seringue étanche à gaz de 1 ml et placez-la dans la pompe à médicaments. Tournez la direction d'écoulement des valves de telle sorte que le fluide va de la pompe de drogue par la valve à la ligne de valve et dehors la « ligne de cerveau ».
3. Rincer le circuit avec de la chlorhexidine à l'aide d'un faible débit (50-200 l/min) pendant un minimum de 10 min. Répétez les étapes de 5,2 à 5,3 avec la saline stérile, puis l'air.
   REMARQUE: Il est important de vérifier s'il y a des fuites à ce stade. Appliquez délicatement des lingettes sans papier à la jonction pour aider à révéler les fuites de liquide à travers les ferrules.
4. Chargez le médicament dans la seringue étanche à gaz de 500 l,l, comprimez l'air et placez-le dans la pompe à médicaments. Flux à 50 oL/min jusqu'à ce que quelques gouttes s'écoulent du microinjectrode.
5. Faire tremper le tube guide dans la chlorhexidine (dissous à 20 g/L) pendant 15 min.
6. Tournez la direction de la soupape de sortie vers la « ligne de chasse ». Avancez la pompe Marker jusqu'à ce qu'un bord clair de couleur et d'huile soit observé sur la ligne de règle. Assurez-vous qu'il ya toujours de l'huile entre le médicament et la couleur afin de ne pas mélanger les deux matériaux solubles dans l'eau et de perdre le bord pointu entre eux. Marquez la position de départ de cette ligne d'huile/de teinture (avec un morceau de ruban adhésif ou un marqueur).
7. Tournez la direction de la valve de sortie vers la ligne du cerveau.

6. Enregistrement d'exécution ou expérience d'infusion

REMARQUE: Les étapes de manipulation des animaux varient selon le laboratoire et l'expérience. Les étapes suivantes doivent être effectuées après la mise en place chirurgicale nécessaire et la préparation a été effectuée pour exposer la dura. Après l'expérience, toutes les étapes post-procédures nécessaires doivent être effectuées conformément aux protocoles approuvés par l'institution.

1. Fixez le microdrive à la chambre d'enregistrement. Abaissez le tube guide pour pénétrer dans la dura.
   REMARQUE: Le tube guide ne doit pas pénétrer plus loin que le dura afin d'éviter d'endommager le cortex.
2. Abaissez le microinjectrode à environ 2 mm au-dessus du site pour l'enregistrement/injection dans le cerveau.
3. Resserrer la ferrule supérieure (microélectrode/biocapteur saillante) et connecter les broches d'or au système d'enregistrement. Continuez à faire avancer le micro-injectrode vers le site cible.
   REMARQUE: N'oubliez pas d'inclure la distance que le microélectrode s'étend au-delà de la canule dans les calculs.
4. Pour les expériences de perfusion, utilisez la pompe manuelle de microseringue pour déplacer la colonne d'huile de 1 cm toutes les 3 min (60 nL/min). Une fois que le volume désiré a été infusé, basculez la vanne de sortie vers la ligne de rinçage.
   REMARQUE: Le volume infusé variera en fonction des espèces modèles et de la zone du cerveau ciblée. Des débits plus rapides peuvent endommager les tissus neuronaux.
5. Lorsque les expériences sont terminées, rétractez le microinjectrode dans le tube guide (laissez la sonde en saillie). Ensuite, retirez le microdrive pour le rinçage. Rincer le système microfluidique tel que décrit dans les étapes 5.1-5.5. pour se préparer à la réutilisation.
   REMARQUE: D'après notre expérience, le microinjectrode durera plusieurs fois si l'on prend soin d'eux. La qualité d'enregistrement électrophysiologique diminue plus rapidement que la capacité d'injection.

Nous avons effectué l'injection d'un agoniste GABAa (muscimol) pour l'inactivation réversible du champ oculaire frontal (FEF), tandis que l'animal a effectué une tâche de saccade guidée par mémoire11. Dans cette tâche, l'animal fixe et une cible visuelle périphérique est présentée. L'animal maintient la fixation tout en se souvenant de l'emplacement cible, et une fois que le point de fixation disparaît, exécute un mouvement oculaire saccadique à l'endroit rappelé pour recevoir une récompense. Le microinjectrode a été construit selon les instructions de la figure 1b. Le volume d'infusion pour l'expérience d'exemple était de 850 nL. La performance comportementale sur la tâche de saccade guidée par la mémoire (MGS) à divers endroits et heures par rapport à l'infusion de muscimol est montrée dans la figure 4. Les déficits de performance les plus importants ont été observés à 2 à 3 h après l'infusion.

Figure 1 : Fabrication progressive de microinjectrode. (a) Configuration pour une utilisation indépendante du système microfluidique. La canule et la sonde sont mesurées afin de confirmer que la pointe de la sonde peut être saillante à la longueur désirée (p. ex., 150 m). La sonde est chargée à l'avant dans la canule. La canule est passée par la jonction En et attachée sur le côté inférieur, avec l'extrémité plate au milieu de la jonction En; l'extrémité arrière de la sonde continue à travers la ferrule supérieure. Le microinjectrode est finalisé en souchant des goupilles d'or sur chacun des terminaux de sonde et en ajoutant de la colle entre eux et la ferrule supérieure pour la stabilité. La connexion au système d'acquisition dépend de la conception de la sonde. Dans cet exemple, notre sonde est un nanocapteur avec trois pistes. (b) Configuration pour utilisation avec système microfluidique. Pour coupler le microinjectrode au système microfluidique, un morceau de tube capillaire est utilisé pour le côté supérieur de la jonction T. La sonde peut être chargée à l'avant ou à l'arrière. La ligne microfluidique est ensuite branchée à la troisième ouverture de jonction En. Dans cet exemple, nous avons utilisé une microélectrode. Voir l'image zoomée de la pointe d'une canule dans laquelle le microélectrode a été saillant en resserrant la ferrule supérieure. Consultez la Table des Matériaux pour une liste des articles utilisés dans la construction. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Système microfluidique. La configuration à deux soupapes permet de contrôler la direction du débit vers le microinjectrode ou vers la ligne de rinçage pour le dépannage. Le circuit repose sur deux vannes à 3 ports reliées à l'aide de tubes capillaires et de ferrules standard. Des seringues étanches sont utilisées pour transporter et injecter le médicament par perfusion et le marqueur. Une pompe à seringues programmable permet le rinçage automatique du système et le chargement du médicament. Une pompe manuelle de microseringue permet l'injection et la visualisation commandées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Montage de micro-injectrode à un micropropulsion hydraulique avec et sans capacité d'injection. Étape 4.1 : Un adaptateur sur mesure permet l'attachement du microinjectrode au microdrive. Une seule vis fixe l'adaptateur au microdrive; deux vis fixent le microinjectrode à l'adaptateur. La ferrule supérieure doit être dévissée au moins 2 virages afin de protéger la pointe de la microélectrode/sonde expérimentale lors du chargement du microinjectrode dans le tube guide du microdrive. Étape 4.3 : Insérez le microinjectrode dans le tube de guidage à partir du haut. Étape 4.4 : Si vous effectuez une microinfusion, branchez la ligne de drogue à la troisième ouverture de jonction En à l'aide d'une ferrule en plastique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Tâche guidée de saccade guidée de mémoire pendant l'infusion de muscimol dans FEF. (a) Le microinjectrode a été placé dans l'hémisphère droit, zone FEF. (b) Performance comportementale au cours d'une tâche MGS dans laquelle huit cibles sont placées périphériquement. Nous avons couru 4 blocs de la tâche MGS, avant et à trois reprises après l'injection. L'intrigue polaire montre la performance (excentricité) à chacun de ces moments (couleur), pour différents endroits par rapport au point de fixation (angle sur l'intrigue polaire). La performance a nettement diminué dans l'hémifield visuel gauche 2 h après injection (trace bleue, moitié gauche de l'intrigue polaire). (c) Traces de saccade pour 8 emplacements de mémoire périphériques avant (à gauche) et après injection de muscimol dans le FEF (droite, 1 et 3 h après l'infusion). La précision de saccade dans l'hémifield visuel gauche (moitié gauche des parcelles polaires) a diminué après injection de muscimol. Échelle en degrés d'angle visuel (dva). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Aucun.