Summary
Los modelos in vitro de angiogénesis coronaria se pueden utilizar para el descubrimiento de los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria. Cultivos explantados in vitro de tejidos sinusales venosos y endocardio muestran un crecimiento robusto en respuesta al VEGF-A y muestran un patrón similar de expresión COUP-TFII como in vivo.
Abstract
Aquí, describimos un ensayo de cultivo in vitro para estudiar la angiogénesis coronaria. Los vasos coronarios alimentan el músculo cardíaco y son de importancia clínica. Los defectos en estos vasos representan riesgos graves para la salud, como en la aterosclerosis, que puede provocar infartos de miocardio e insuficiencias cardíacas en los pacientes. En consecuencia, la enfermedad de las arterias coronarias es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. A pesar de su importancia clínica, se ha avanzado relativamente poco en cómo regenerar las arterias coronarias dañadas. Sin embargo, se han realizado progresos recientes en la comprensión del origen celular y las vías de diferenciación del desarrollo de los vasos coronarios. El advenimiento de herramientas y tecnologías que permiten a los investigadores etiquetar fluorescentemente las células progenitoras, seguir su destino y visualizar progenies in vivo han sido fundamentales para entender el desarrollo de los vasos coronarios. Los estudios in vivo son valiosos, pero tienen limitaciones en términos de velocidad, accesibilidad y flexibilidad en el diseño experimental. Alternativamente, los modelos in vitro precisos de la angiogénesis coronaria pueden eludir estas limitaciones y permitir a los investigadores interrogar cuestiones biológicas importantes con rapidez y flexibilidad. La falta de sistemas modelo in vitro adecuados puede haber obstaculizado el progreso en la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares del crecimiento de los vasos coronarios. Aquí, describimos un sistema de cultivo in vitro para cultivar vasos coronarios a partir del sinusuvenosus (SV) y el endocardio (Endo), los dos tejidos progenitores de los que surgen muchos de los vasos coronarios. También confirmamos que las culturas recapitulan con precisión algunos de los mecanismos in vivo conocidos. Por ejemplo, mostramos que los brotes angiogénicos en cultivo a partir de SV downregulate EXPRESIÓN COUP-TFII similar a lo que se observa in vivo. Además, demostramos que el VEGF-A, un conocido factor angiogénico in vivo, estimula de forma robusta la angiogénesis de las culturas SV y Endo. Colectivamente, hemos ideado un modelo de cultivo in vitro preciso para estudiar la angiogénesis coronaria.
Introduction
Los vasos sanguíneos del corazón se denominan comúnmente vasos coronarios. Estos vasos se componen de arterias, venas y capilares. Durante el desarrollo, los capilares altamente ramificados se establecen primero, que luego se remodelan en arterias coronarias y venas1,2,3,4,5. Estos capilares iniciales se construyen a partir de células progenitoras endoteliales que se encuentran en los tejidos proepicardium, sinus venosus (SV) y endocardio (Endo)1,6,7,8. SV es el órgano de entrada del corazón embrionario y Endo es el revestimiento interno del lumen del corazón. Las células progenitoras endoteliales que se encuentran en el SV y Endo construyen la mayoría de la vasculatura coronaria, mientras que el propicaredium contribuye a una porción relativamente pequeña de ella2. El proceso por el cual la red capilar de los vasos coronarios crece en el corazón a partir de sus células precursoras preexistentes se llama angiogénesis coronaria. La enfermedad de las arterias coronarias es una de las principales causas de muerte en todo el mundo y, sin embargo, falta un tratamiento eficaz para esta enfermedad. Comprender los mecanismos celulares y moleculares detallados de la angiogénesis coronaria puede ser útil para diseñar terapias novedosas y eficaces para reparar y regenerar las arterias coronarias dañadas.
Recientemente, un aumento en nuestra comprensión de cómo se desarrollan los vasos coronarios se ha logrado en parte a través del desarrollo de nuevas herramientas y tecnologías. En particular, el etiquetado del linaje in vivo y las tecnologías avanzadas de imagen han sido muy útiles para descubrir las vías de origen celular y diferenciación de los vasos coronarios9,10,11,12. A pesar de las ventajas de estas herramientas in vivo, existen limitaciones en términos de velocidad, flexibilidad y accesibilidad. Por lo tanto, los sólidos sistemas de modelos in vitro pueden complementar los sistemas in vivo para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria de una manera de alto rendimiento.
Aquí, describimos un modelo in vitro de angiogénesis coronaria. Hemos desarrollado un sistema de cultivo explanta in vitro para cultivar vasos coronarios a partir de dos tejidos progenitores, SV y Endo. Con este modelo, mostramos que los cultivos explantadores de tejido in vitro crecen brotes de vasos coronarios cuando son estimulados por medio de crecimiento. Además, los cultivos explantadores crecen rápidamente en comparación con el control cuando son estimulados por el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), una proteína angiogénica muy potente. Además, encontramos que los brotes angiogénicos del cultivo SV sufren desdiferencia venosa (pérdida de la expresión COUP-TFII), un mecanismo similar a la angiogénesis SV in vivo1. Estos datos sugieren que el sistema de cultivo explanta in vitro restablece fielmente los eventos angiogénicos que se producen in vivo. Colectivamente, los modelos in vitro de angiogénesis que se describen aquí son ideales para sondear los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria de una manera accesible y de alto rendimiento.
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Protocol
El uso de todos los animales en este protocolo siguió las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ball (IACUC).
1. Establecimiento de criadores de ratón y detección de tapones vaginales para embarazos cronometrados
- Establecer una jaula de cría de ratones con ratones machos y hembras de tipo salvaje. Asegúrese de que la edad de los ratones reproductores es entre 6-8 semanas. Preparar un par (1 macho y 1 hembra) o como un trío (1 macho y 2 hembras) para la cría.
- Compruebe si hay un tapón vaginal a la mañana siguiente. Utilice una sonda de metal en ángulo para detectar un enchufe profundo insertándolo en la abertura vaginal. Designar la mañana de un tapón vaginal positivo como día embrionario 0.5 (e0.5).
NOTA: Un enchufe vaginal puede ser superficial (que es fácilmente visible, ver Figura 1) o profundo (que no es fácilmente visible). La presencia de un enchufe profundo bloqueará la inserción completa de la sonda, mientras que la ausencia de un enchufe permitirá la inserción completa sin resistencia. - Mantener el embarazo cronometrado hasta que los embriones alcancen e11.5 en el que serán cosechados. Para confirmar el embarazo antes de cosechar embriones, registre el peso de los ratones hembra entre e7.5 y e11.5.
NOTA: El aumento diario del peso de la madre indicará un embarazo exitoso, mientras que ningún cambio en el peso indicará un embarazo fallido.
2. Cosecha de embriones de ratones embarazadas
NOTA: Antes de empezar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: una cámara de eutanasia CO2, 70% etanol, toallas de papel, fórceps regulares, fórceps finos, tijeras, 1 solución salina estéril con fosfato (PBS), platos estériles de 10 cm Petri, recipiente con hielo, cuchara perforada, estereomicroscopio de disección.
- Coloque un ratón embarazada e11.5 en una cámara de eutanasia de CO2 limpia para sacrificarlo. Cierre la tapa de la cámara para evitar que el ratón escape.
- Después de fijar el ratón en la cámara de eutanasia, encienda CO2. Asegúrese de regular el caudal de CO2 por recomendaciones de la IACUC (es decir, 10-30% de desplazamiento por minuto). Después de que el ratón esté completamente eutanasiado, realice la luxación cervical para asegurar la muerte.
- Rocíe el ratón con 70% de etanol. Levante la piel sobre el vientre usando fórceps, haga una pequeña incisión usando un par de tijeras y extienda la incisión lateralmente. Agrandar la incisión anteriormente hasta el diafragma y exponer el cuerno uterino que contiene los embriones(Figura 2).
- Extraiga la cadena de embriones (cuerno uterino + embriones) agarrando el útero y cortando libremente. Coloque la cadena de embriones en hielo frío estéril 1x PBS.
- Diseccionar los embriones individuales del cuerno del útero despegando el músculo uterino, el saco de yema y el amnión uno por uno(Figura 3A-F)bajo un estereomicroscopio. Transfiera los embriones limpios usando una cuchara perforada a una placa Petri que contenga 1 pbS estéril en hielo. Asegúrese de mantener los embriones fríos.
3. Aislar corazones de e11.5 Embriones
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: fórceps regulares, fórceps finos, 1x PBS estéril, plato Petri estéril de 10 cm, plato Petri estéril de 6 cm, recipiente con hielo, cuchara perforada, estereomicroscopio de disección.
- Configure un nuevo plato Petri con hielo estéril 1x PBS bajo un estereomicroscopio. Transfiera un embrión del paso 2.5 al plato de Petri para diseccionar el corazón.
- Retire la cabeza del embrión con fórceps. Primero, apriete la cabeza entre los fórceps con una mano y luego retire la cabeza raspando con la otra mano usando fórceps cerrados(Figura 4A-C).
- Después de extraer la cabeza, oriente el embrión con su lado ventral hacia arriba sosteniendo el embrión con fórceps en su vientre con una mano(Figura 4D).
- Con la otra mano, abra la pared torácica del embrión haciendo primero una pequeña incisión en el pecho ligeramente por encima del diafragma usando fórceps finos. Luego, agrandar la incisión con mucho cuidado insertando fórceps cerrados y rompiendo la pared torácica abriendo los fórceps. Asegúrese de no empujar demasiado profundo, lo que puede dañar el corazón. Con la ayuda de los fórceps, mantenga la pared torácica abierta para exponer el corazón y los pulmones en la cavidad torácica(Figura 4E).
- Con fórceps finos, mueva suavemente el corazón antes (90o) y exponga la aorta/vena dorsal. Extraiga el corazón/pulmones antes capturando la aorta/vena dorsal en la base del corazón(Figura 4F-H).
NOTA: Sea suave mientras saca el corazón/pulmones para evitar el desgarro del SV, que se encuentra en el lado dorsal del corazón. - Enjuague el corazón/pulmones con 1 pbS frío para eliminar las células sanguíneas.
- Repita los pasos 3.1-3.6 para extraer el corazón/pulmones de los embriones restantes. Asegúrese de mantener el corazón/pulmones aislados en hielo.
4. Isolating SVs and Ventricles from e11.5 Embryonic Mouse Hearts
- Coloque la placa Petri con corazón/pulmones del paso 3.7 bajo un estereomicroscopio para aislar los SVs y ventrículos enteros. Retire los lóbulos adheridos de los pulmones uno por uno de su raíz usando fórceps finos.
- Orientar el corazón en su lado dorsal y eliminar las arerias y el tejido adyacente que rodea el SV anteriormente sin romper el SV. Retire las arículas izquierda y derecha del corazón sosteniendo en su base y raspando usando fórceps finos(Figura 5B). Retire el tejido adyacente que rodea el SV utilizando una técnica similar(Figura 5C).
NOTA: Tenga en cuenta que la aurícula derecha está unida al SV, así que tenga cuidado de retirar sólo la aurícula. - Para aislar el SV, primero oriente el corazón con su lado dorsal hacia arriba (porque el SV está en el lado dorsal) y mantenga el corazón quieto en esta posición sosteniendo suavemente el corazón en sus ventrículos con fórceps.
NOTA: El SV es un órgano de entrada de un corazón embrionario que se encuentra entre las mismas en el lado dorsal del corazón. - Retire el SV despegándolo cuidadosamente del corazón donde está unido o sosteniendo el SV en la base de su accesorio con fórceps finos y raspando con fórceps cerrados(Figura 5D,E).
- Transfiera el SV aislado a una nueva placa Petri de 6 cm con p.pbs estéril de hielo 1x en hielo utilizando una pipeta de transferencia estéril y etiquete la placa Petri como SV.
- Para aislar los ventrículos enteros, retire el tracto de salida (aorta y tronco pulmonar) del corazón después de extraer el SV(Figura 5F, G).
- Transfiera los ventrículos enteros a una nueva placa Petri de 6 cm que contenga 1 pbS estéril en hielo utilizando una pipeta de transferencia estéril y etiquete la placa Petri como ventrículos. Mantenga el SV aislado y los ventrículos en hielo.
- Repita los pasos 4.1-4.7 para aislar SVs y ventrículos de los corazones restantes.
5. Configuración de placas de cultivo de tejido con inserciones y recubrimiento de matriz extracelular
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: solución de matriz extracelular comercial (ECM; por ejemplo, Matrigel), plaquitas de tereftalato de polietileno (PET) de 8,0 m, 24 placas de pozo, 37 oC, incubadora de CO2 al 5%.
- Deje que la solución de ECM se desconda sobre hielo. Mantenga la solución de ECM sobre hielo para evitar la solidificación.
- Colocar las plaquitas de cultivo de membrana PET (tamaño de los poros a 8,0 m, área de filtración a 0,3 cm2, diámetro del filtro a 6,5 mm) en los pocillos del cultivo no tisular tratado 24 placas de pozo. Etiquete las placas como SV o ventrículos para el SV o los ensayos de angiogénesis endocardial, respectivamente.
NOTA: Configure las plaquitas en placas separadas para el SV y los ventrículos al realizar ambos cultivos simultáneamente. Asegúrese de configurar suficientes pozos para todas las muestras y controles experimentales. - Después de descongelar la solución de ECM, diluir inmediatamente ECM 1:2 en medio basal preenfriado (es decir, medio basal EBM-2, ver Tabla de materiales)a un volumen suficiente (100 l/insertar x número de plaquitas).
NOTA: Por ejemplo, si hay seis plaquitas, el volumen total será de 100 s x 6 x 600 l. Añadir 200 l de ECM en 400 ml de medio basal. - Recubrir las plaquitas con 100 l de ECM recién diluido agregándolo directamente en la parte superior de la membrana. Incubar la placa a 37 oC durante al menos 30 minutos para permitir que el ECM se solidifique.
NOTA: Esto debe realizarse bajo una campana de cultivo de tejido de flujo laminar para evitar la contaminación.
6. SVs y cultivos ventrículos enteros
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: 70% etanol, pipeta de transferencia, estereomicroscopio, fórceps, capucha de cultivo de tejido de flujo laminar, kit de suplemento celular endotelial microvascular(Tabla de materiales),medio basal, 1x PBS estéril). La Figura 6 muestra el flujo de trabajo del cultivo SV y del ventrículo.
- Descongelar el contenido del kit de suplemento sobre hielo. Preparar el medio completo añadiendo todo el contenido del kit de suplemento en 500 ml de medio basal bajo una capucha de cultivo de tejido de flujo laminar certificado. Mezclar bien el medio y distribuirlo en alícuotas de 50 ml.
- Esterilice la base del estereomicroscopio y el área de trabajo circundante con 70% de etanol.
- Obtenga las placas de cultivo de tejidos del paso 5.4. Con la ayuda de una pipeta de transferencia, transfiera cuidadosamente los explantes del paso 4.7 en la parte superior de la membrana de la plaquita. Bajo un estereomicroscopio y con la ayuda de fórceps limpios, coloque los explantes en el centro de las plaquitas para asegurarse de que no están atascados en la esquina de las plaquitas o unidos a las paredes laterales.
- Después de colocar los explantes y centrarlos en las plaquitas, retire cuidadosamente cualquier PBS adicional de las plaquitas y cierre las tapas de las placas.
- Bajo una capucha de cultivo de tejido de flujo laminar, agregue 100 s de la media completa precalentada en la parte superior de las plaquitas y 200 l en los pozos para cultivar los explantes en la interfaz aire-líquido de tal manera que la superficie basal de la plaquita esté en contacto con el medio , pero la superficie superior está expuesta al aire.
NOTA: Asegúrese de ajustar el volumen para obtener una interfaz aire-líquido si utiliza inserciones de diferentes tamaños / placas de pozo. - Añadir 300 s l de PBS en los pocillos no utilizados de las 24 placas de pozo y cubrir con la tapa. Incubar la placa en una incubadora de CO2 de 37oC, 5%, y cultivar los cultivos durante 5 días.
- En los días siguientes, observe rutinariamente los cultivos bajo un microscopio de luz invertida para evaluar el estado de los cultivos explantados. Asegúrese de que los explantes exhiben palizas contrácteas y que todos los explantes estén unidos a la parte inferior de la membrana incrustada con ECM. Tome nota de cualquier explantes flotantes.
NOTA: La contracción periódica de los explantes indica que están vivos. Los explantes flotantes deben omitirse del análisis. - Después de evaluar el estado de la cultura, vuelva a colocar la placa de cultivo en la incubadora y continúe creciendo la cultura durante un máximo de 5 días.
7. Tratamiento de cultivos con VEGF-A (Control Positivo)
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: capucha de cultivo de tejido de flujo laminar, 1x PBS, medio basal + 1% suero bovino fetal (FBS), medio basal + VEGF-A, pipetas y puntas de pipeta.
- Preparar el medio basal + 1% FBS y el medio basal + VEGF-A.
- Para preparar el medio basal + 1% FBS, primero determine el número de pozos de control necesarios. Por ejemplo, si hay tres pozos de control, entonces 300 l/bien x 3 x 900 l es el volumen total necesario. Añadir 9 l de FBS en 891 l de medio basal para hacer el medio basal + 1% FBS.
- Para preparar el medio basal + VEGF-A, primero determine el número total de pozos que necesitan el medio VEGF-A. Si hay tres pozos, entonces 300 l/bien x 3 x 900 l es el volumen total y 50 ng/well x 3 a 150 ng VEGF-A. Añadir 150 ng de VEGF-A en 900 l de medio basal para hacer el medio basal + VEGF-A.
NOTA: Ensamble esta solución a un volumen mayor que el calculado para asegurar un número suficiente de alícuotas más pequeñas para cada experimento.
- En el día 2, retire el soporte de ambas cámaras (las inserciones y los pozos). Lave los cultivos con 300 s de 1pbS añadiendo 100 s a las plaquitas y 200 l en los pozos. Gire firmemente las placas unas cuantas veces y retire la PBS.
- Añadir 300 s de medio basal + 1% FBS (100 l en la plaquita y 200 l en los pozos) para matar de hambre los cultivos durante 24 h.
- En el día 3, después de la inanición, añadir 300 éL de medio basal + 1% FBS (100 ol en el inserto y 200 l en los pozos) en los pozos de control y medio basal + VEGF-A (50 ng/bien) en los pozos de tratamiento, respectivamente.
- Después del tratamiento, seguir creciendo los cultivos en la incubadora.
8. Fijación e inmunomancha
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: 4% paraformaldehído (PFA), 1x PBS, anticuerpos primarios y secundarios, un agitador, un tensioactivo no iónico al 0,5% en PBS (PBT).
- En el sexto día de cultivo, retire los cultivos de medio y lavado con 1x PBS a temperatura ambiente (RT).
- Corrija los cultivos añadiendo 200 sl de solución de PFA al 4% en los pozos y 100 l en las plaquitas. Arreglar cultivos en 4 oC durante 20 minutos mientras se balancea.
- Después de 20 minutos de fijación, retire el PFA de los cultivos en una campana de humo y lave los cultivos con 1x PBS añadiendo 200 l en los pozos y 100 l en las plaquitas.
- Repetir lavados 3x, 10 min cada uno, mientras se balancea. A continuación, proceda a realizar inmunomanchas.
NOTA: Todos los pasos de lavado se realizan en una mesa de trabajo en RT.
- Diluir los anticuerpos primarios (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) en solución de bloqueo (5% suero de burro, 0.5% PBT). Añadir 300 l de solución de anticuerpos primarios (200 ml en los pozos inferiores y 100 l en las plaquitas). Incubar cultivos en anticuerpos primarios durante la noche a 4oC mientras se balancea.
NOTA: Anti-VE-Cadherin se utiliza para etiquetar la membrana celular endotelial y anti-ERG 1/2/3 se utiliza para etiquetar el núcleo celular endotelial con el fin de visualizar los brotes angiogénicos de células endoteliales. - Al día siguiente, lavar y mecer las placas de cultivo 10 veces en 0.5% PBT, cambiando PBT cada 10 min.
- Diluir los anticuerpos secundarios (donkey anti-rat Alexa Fluor 488 y burro anticonejo Alexa Fluor 555) en solución de bloqueo. Añadir 300 s de los anticuerpos secundarios como en el paso 8.2 e incubar los cultivos durante la noche a 4 oC mientras se balancea. Al día siguiente, lavar los anticuerpos secundarios 10 veces en PBT, cambiando PBT cada 10 min.
NOTA: Lave un mínimo de 10 veces, pero más lavados son mejores. Una vez completados los lavados, los cultivos se pueden almacenar con 1 PBS hasta que se montan en diapositivas.
9. Montaje de cultivos en diapositivas, imágenes y análisis
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: fórceps finos, portaobjetos, medio de montaje con 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), cubreobjetos y microscopio confocal. Después de la tinción secundaria de anticuerpos, monte los cultivos en diapositivas para obtener imágenes siguiendo los siguientes pasos.
- Pelar la membrana cuidadosamente de la plaquita utilizando fórceps finos y transferirla a las diapositivas colocando el lado de la membrana hacia abajo y colocando los cultivos explantados hacia arriba. Coloque las muestras de réplica en las mismas diapositivas y etiquete las diapositivas como control o VEGF-A. Agregue unas gotas de medio de montaje con DAPI directamente sobre la membrana y cubra las diapositivas con resbalones de cubierta.
NOTA: Asegúrese de evitar las burbujas de aire mientras coloca los labios de las cubiertas. - Cierre los bordes de las diapositivas con esmalte de uñas transparente y deje secar.
NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar en -20 oC para un almacenamiento a largo plazo. - Diapositivas de imagen utilizando un microscopio confocal.
- Realizar análisis para medir la longitud del crecimiento angiogénico. Cuantifique la longitud del crecimiento angiogénico midiendo la distancia de las células endoteliales (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) extendidas desde el límite interior de las células ERG 1/2/3+ en los cultivos ventrículos y desde el centro de los explantes SV en los cultivos SV.
- Para realizar la cuantificación con FIJI/ImageJ, primero descargue el software FIJI.
- Abrir archivos de imagen en FIJI: ir a Archivo ? Abiertos ? Carpeta ? Nombre de archivo ? Abrir.
- Ir a Analizar ?? Ajuste de Medidas (Set Measurements) Seleccione Perímetro.
- Seleccione la herramienta Línea recta en la ventana principal.
- Dibuje una línea a lo largo de la longitud de un brote como se sugiere en el paso 9.4.
- Ir a Analizar ?? Medir.
NOTA: Las medidas de longitud se muestran en la nueva ventana. - Realice la cuantificación en imágenes que representen al menos tres campos de visión seleccionados aleatoriamente. Promedio de las mediciones de la longitud del brote e informar de ellas como media de desviación estándar.
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Representative Results
Una de las características más llamativas de la angiogénesis SV in vivo es que sigue una vía específica e implica eventos de desdiferencia celular y rediferenciación que ocurren en momentos estereotipados y posiciones1. A medida que las células SV iniciales crecen sobre el ventrículo cardíaco, dejan de producir marcadores venosos como COUP-TFII(Figura 7). Posteriormente, los brotes coronarios toman dos caminos de migración, ya sea sobre la superficie del corazón o en las profundidades del miocardio. Los vasos superficiales eventualmente se convierten en venas mientras que los vasos invasores se convierten en arterias y capilares1,6,7. Esta distinción se conserva a medida que el corazón crece y la vasculatura coronaria se expande.
Para facilitar el descubrimiento de los fundamentos moleculares del desarrollo coronario, hemos ideado un modelo in vitro de brotación SV que se puede utilizar para experimentos de pérdida de función y ganancia de función. El tejido SV de los corazones embrionarios del ratón se disecciona, se coloca en la parte superior de la ECM diluida (que está disponible comercialmente, ver Tabla de Materiales)y se mantiene en la interfaz aire-líquido en el medio de crecimiento de células endoteliales. El miocardio SV continúa latiendo a lo largo del período de cultivo. Después de 2 días en cultivo, las células epicardiales que recubren el tejido salen del explantar y migran hacia la matriz. Después de 5 días, las células endoteliales SV brotan y migran sobre el tejido epicardial(Figura 8A,puntas de flecha negras). Colectivamente, este proceso recapitula aspectos angiogénicos del desarrollo coronario.
Los brotes SV cultivados también se someten a una desdiferencia venosa. Al igual que en el corazón embrionario, la expresión COUP-TFII se reduce a medida que los vasos migran lejos del SV(Figura 8B,en comparación con la Figura 7). Los vasos de control como las arterias y venas umbilicales o del saco de yema pueden producir vasos que brotan. Sin embargo, son menos en número y más cortos en longitud y no cambian su identidad arterial o venosa (no se muestra). Por lo tanto, la reprogramación venosa es específica de la brotación de SV y no es una característica general de la angiogénesis o una respuesta a los componentes de ECM. Estos datos también indican que los tipos de células contenidos dentro de la propia SV son necesarios y suficientes para inducir la desdiferenciación.
Es bien sabido que el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) es un potente inductor de angiogénesis7,13,14,15,16,17,18. Estudios anteriores han demostrado que el miocardio VEGF-A estimula la angiogénesis endocardial para crecer los vasos coronarios7. Además, se ha demostrado que las células endoteliales coronarias expresan el receptor VEGF-A, y los vasos coronarios derivados del SV en el miocardio podrían crecer en respuesta a VEGF-A in vivo2. Para demostrar que nuestro modelo in vitro de angiogénesis coronaria responde fielmente a los cultivos VEGF-A, estimulamos las culturas SV y Endo con VEGF-A. Como era de esperar, nuestros resultados mostraron que tanto SV como Endo son altamente sensibles a VEGF-A. Los cultivos estimulados con VEGF-A muestran un mayor crecimiento de los brotes angiogénicos tanto en densidad como en longitud(Figura 9A,C). Los cultivos SV estimulados por VEGF-A muestran un aumento de casi 3 veces en la longitud del brote en comparación con el control(Figura 9B). Estos resultados sugieren que los brotes endoteliales de SV y Endo responden a señales similares que se conocen in vivo.
En conjunto, nuestros datos sugieren que estos cultivos explantados in vitro comparten eventos celulares y moleculares similares que ocurren durante el desarrollo coronario in vivo, incluyendo la desdiferencia venosa y un crecimiento robusto en respuesta a la estimulación VEGF-A. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que estos modelos de cultivo explanta son útiles para estudiar la angiogénesis coronaria in vitro.
Figura 1: Identificación del tapón vaginal. (A) Un tapón vaginal (punto blanco). (B) Vista ampliada de la región en caja, incluido el tapón vaginal (indicado por la flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Acceso a la cuerda embrionaria en el útero de un ratón embarazada. Un ratón embarazada eutanasiado se coloca con su superficie ventral hacia arriba y se rocía con 70% de etanol a la piel húmeda para la disección. La piel se levanta en la región pélvica usando fórceps y se hace una pequeña incisión. La incisión se extiende lateralmente. Se realiza una incisión adicional anteriormente hasta el diafragma. En el útero, una cadena de embriones es visible (indicado por puntas de flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Disección y extirpación de embriones del útero. (A) Imagen que muestra el útero que contiene una cadena de embriones. La membrana en el lado dorsal del embrión (frente al lado donde se encuentra la placenta) se pela. (B) El embrión en el saco de yema se hace visible después de pelar la membrana del útero. (C,D) El embrión unido a la placenta con el cordón umbilical es visible después de despegar el saco de yema. Amnion se despega si aún está presente. (E) Imagen que muestra un embrión unido a la placenta por el cordón umbilical. (F) Imagen que muestra la separación del embrión de la placenta tirando del cordón umbilical (Umb. Cord) usando fórceps. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Eliminación del corazón/pulmones arrancando de embriones. (A,B) La cabeza se extrae del embrión capturando en el cuello y raspando. (C) Imagen que muestra la extracción de la cabeza del cuerpo. (D) El posicionamiento correcto del embrión para la disección cardíaca. El embrión se coloca con el lado ventral hacia arriba para tener fácil acceso a la cavidad torácica para la extracción del corazón. Una vez que el embrión se coloca como se muestra en D, la cavidad torácica se abre con fórceps. (E) Imagen que muestra la cavidad torácica abierta con el corazón expuesto en su lado ventral. (F) Para eliminar el corazón sin dañar el SV, el corazón se voltea antes, y la aorta dorsal se hace visible. (G) Imagen que muestra la posición en la base del corazón/pulmones donde la aorta/vena dorsal se captura con fórceps y el corazón/pulmones se extrae antes. (H) La imagen muestra el desplumado del corazón/pulmones e11.5 extraído del embrión. V. corazón - corazón ventral; d. corazón - corazón dorsal; d. aorta - aorta dorsal; LA - Aurícula izquierda; RA - aurícula derecha; LV - ventrículo izquierdo; RV - ventrículo derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Isola de SV y ventrículos de corazones embrionarios. (A) Imagen que muestra la vista dorsal del corazón/pulmones aislado arrancado arrancado del embrión e11.5. Se indica la ubicación del SV en el corazón. (B) Imagen del corazón después de que se hayan quitado los cogollos pulmonares. (C) Se extraen las atrias y los tejidos adyacentes que rodean el SV, revelando la aorta. La ubicación del SV está etiquetada. (D) Imagen que muestra la eliminación del SV. Usando fórceps, el SV se agarra a su base y se raspa del corazón. (E) SV extraído del corazón se muestra junto con el tejido restante del corazón. La aorta y el tronco pulmonar (PT), llamados colectivamente el tracto de salida (OFT), se hacen visibles en el corazón después de que se extirpa el SV. El SV se utilizará para el cultivo in vitro, como se describe en la Figura 6 (panel izquierdo). (F) La posición de la OFT que se va a diseccionar está marcada por una línea blanca discontinua. (G) Aorta/PT (tracto de salida) se elimina de los ventrículos por disección en la posición que se muestra en el panel F. Los ventrículos restantes sin la OFT se utilizan para cultivos ventrículos como se muestra en la Figura 6 (panel derecho). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Esquema que muestra el flujo de trabajo de SV y el cultivo del ventrículo. Izquierda: Procedimiento para la cultura SV. En primer lugar, el SV se retira de los corazones e11.5 y se coloca en una plaquita de cultivo. El inserto contiene membrana porosa en la parte inferior (poro de 8 m) y está recubierto con ECM con factor de crecimiento reducido. Los insertos se colocan en los pocillos de una placa de 24 pocillos. El medio se añade tanto en la cámara inferior como en la superior sin cubrir la explantación. La cultura se cultiva durante 5 días. Después de 5 días, la membrana se retira de la plaquita y se monta en las diapositivas para la toma de imágenes y el análisis. Derecha: Procedimiento para el cultivo del ventrículo. Los ventrículos sin SV, las aurículas y la OFT se retiran de los corazones e11.5 y se cultivan como se describió anteriormente para el SV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: La expresión COUP-TFII se pierde en los brotes SV in vivo. (A) Vista dorsal de corazones e11.5. Imagen confocal de marcador endotelial (rojo) que etiqueta el sinusuvenosus (SV), brotes coronarios (cs, línea punteada) y endocardio (endo) que recubre el lumen del corazón. (B) El fabricante venoso COUP-TFII (verde), un factor de transcripción de venas (trx), expresado en el SV se pierde progresivamente a medida que los brotes salen del SV y crecen sobre el ventrículo. Derecha: Aumento más alto del brote coronario que se muestra en la región en caja del panel A. Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Modelos in vitro de identidad venosa y reprogramación. (A) Imagen de Brightfield del tejido SV cultivado. Los brotes vasculares (cabezas de flecha) crecen a partir de la explanta original (línea de puntos negro) sobre el sustrato de ECM. (B) Inmunofluorescencia de cultivos de SV etiquetados con anticuerpos que marcan la superficie celular endotelial (VE-Cadherin), núcleos de células endoteliales (ERG 1/2/3) y núcleos venas y epicardiales (COUP-TFII). Los núcleos son positivos tanto para ERG 1/2/3 como para COUP-TFII en el SV, pero el ERG 1/2/3 solo en los brotes que migran sobre el ECM. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: SV y endocardio responden a VEGF-A in vitro. (A) Imagen confocal del control de 5 días y del cultivo explant Estratega CONGF-A. Las células endoteliales se inmunomanchan con VE-cadherina (verde), núcleos de células endoteliales teñidas con anticuerpos ERG 1/2/3 (rojo) y núcleos celulares con DAPI (azul). (B) El crecimiento angiogénico de células endoteliales se cuantifica midiendo la longitud de la extensión del brote (la distancia migrada por las células endoteliales ERG 1/2/3+ desde el explantel, indicada por líneas sólidas blancas en los paneles inferiores de (A). (C) Imagen confocal de una cultura de 5 días de un control y ventrículos tratados con VEGF-A. Las células endoteliales se inmunomanchan con VE-cadherina (verde) y los núcleos de células endoteliales se tiñen con anticuerpos ERG 1/2/3 (azul). Los puntos son medidas individuales y las barras de error sonmedias: SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Algunos de los pasos más críticos para el crecimiento con éxito de los vasos coronarios de los tejidos progenitores SV y Endo son: 1) Identificar y aislar correctamente el tejido SV para el cultivo de SV; 2) el uso de ventrículos de embriones entre las edades de e11-11,5 para un cultivo preciso de Endo; 3) mantener condiciones estériles durante todo el período de disección y mantener los tejidos fríos en todo momento; y 4) mantener los explantes unidos a la membrana recubierta de ECM para evitar que el tejido flote en el medio.
En primer lugar, el aislamiento del tejido SV puede ser difícil. Es importante darse cuenta de que el SV se encuentra en el lado dorsal del corazón entre las arículas izquierda y derecha escondidas dentro de los lóbulos pulmonares. Por lo tanto, es difícil separar y aislar. En su lugar, primero se debe extraer todo el desplumado del corazón/pulmones. El SV se aísla del desplumado retirando cuidadosamente los lóbulos pulmonares y limpiando los tejidos adyacentes con la ayuda de fórceps finos. Además, se debe tener mucho cuidado al limpiar los tejidos adyacentes para no perder el SV.
En segundo lugar, para una angiogénesis endocardial precisa, es importante cultivar ventrículos a partir de embriones no mayores de e11.5. En e12.5 y embriones mayores, los coronarios del SV crecen en una proporción significativa de los ventrículos. Por lo tanto, los vasos coronarios que crecen a partir de ventrículos más antiguos pueden estar compuestos tanto por los vasos coronarios derivados de SV como de Endo1,2,10,19,20. Por esta razón, para determinar con precisión el crecimiento del vaso coronario a partir del Endo, es fundamental para el cultivo de ventrículos (menos SV y tracto de salida) de e11.5 embriones20. Además, el SV es relativamente más grande y es más fácil de aislar en e11.5.
En tercer lugar, debido a que el protocolo implica una cantidad sustancial de trabajo fuera de la campana de cultivo de tejido, es fundamental mantener un ambiente de trabajo estéril. Es importante esterilizar las herramientas de disección (fórceps, tijeras, etc.) y las placas de cultivo de tejidos y evitar el contacto con áreas no estériles en todo momento. Es importante pulverizar el área de trabajo y el alcance de la disección con 70% de etanol. Para evitar la contaminación, es importante realizar el procedimiento de disección rápidamente y minimizar el trabajo fuera de la campana de cultivo de tejido.
En cuarto lugar, para obtener cultivos explantadores saludables, es importante que los explantes permanezcan unidos a la base de la membrana en todo momento. Explantes flotantes en el medio deben evitarse para cultivar con éxito los cultivos explantados. Para evitar flotar, es fundamental mantener una interfaz aire-líquido donde la superficie basal de la plaquita está en contacto con el medio, pero la superficie superior está expuesta al aire. Dicha interfaz se obtiene cuando la explanta está suficientemente cubierta por el medio, pero no está completamente sumergida. Es importante controlar el volumen del medio diariamente, ya que el volumen se puede perder por evaporación. Para evitar esto, la placa de cultivo se puede humidificar añadiendo PBS en los pozos no utilizados de las placas de cultivo.
Cultivos explantar similares de SV y Endo se describen en otros lugares20. En estos métodos, los explantes se cultivaban directamente en los pozos de placas de cultivo de tejidos, lo que limita las imágenes confocales de alta resolución. Las imágenes capturadas en este entorno son relativamente pobres en calidad en comparación con el método propuesto aquí, limitando los análisis microscópicos detallados. Para evitar esto, utilizamos inserciones de cultivo desde las que las membranas que contienen el cultivo se pueden pelar y montar en las diapositivas de vidrio para la toma de imágenes. Esto permite imágenes confocales de alta resolución donde se pueden ver detalles celulares como patrones de expresión y morfología. Además, el cultivo directamente en placas requiere un protocolo de tinción separado para DAPI u otra tinción de marcadores pannucleares. Este protocolo no requiere pasos de tinción separados porque las diapositivas se pueden montar con un medio de montaje que contenga DAPI. Además, el montaje en diapositivas permite un almacenamiento a largo plazo sin desvanecimientos fluorescentes, mientras que los cultivos almacenados en pozos con medio líquido darán como resultado un descoloramiento rápido y no son susceptibles de almacenamiento e imágenes a largo plazo.
Los modelos de cultivo in vitro descritos aquí son ideales para interrogar los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria de una manera accesible y de alto rendimiento. Este sistema in vitro se puede utilizar para detectar posibles fármacos o dianas moleculares para evaluar su efecto sobre la angiogénesis coronaria. Además, este sistema también se puede utilizar para estudiar la ganancia de función y la pérdida de función de varios genes para su función autónoma en la angiogénesis coronaria. Observamos que los brotes coronarios de SV siguieron la migración epicardial en nuestros cultivos in vitro, lo que sugiere una interacción importante entre las células endoteliales coronarias y las células epicardiales. Es bien sabido que el epicardium es una rica fuente de factores de crecimiento para la angiogénesis coronaria del SV. Por ejemplo, se ha demostrado previamente que los factores de crecimiento derivados del epicardial, como el VEGF-C y el ELABELA, regulan la angiogénesis coronaria derivada del SV2,19. Podemos utilizar este sistema de cultivo SV para investigar más a fondo la interacción entre el epicardio y las células endoteliales coronarias e identificar nuevas vías moleculares derivadas del epicardial de la angiogénesis coronaria. Además, nuestros datos in vivo sugieren que la hipoxia miocárdica puede estar involucrada en la angiogénesis endocardial19. Nuestro sistema de cultivo in vitro ofrece un excelente modelo para estudiar el papel de la hipoxia en la angiogénesis endocardial incubando los cultivos en condiciones hipoxicas o normoxicas. Estos son experimentos difíciles de llevar a cabo in vivo porque requiere que un ratón embarazada se coloque en una cámara hipoxica controlada. Desde nuestra propia experiencia, es muy difícil obtener resultados consistentes y confiables de experimentos in vivo. En resumen, nuestro modelo in vitro de angiogénesis coronaria proporciona un sistema confiable para interrogar una amplia gama de preguntas relacionadas con la biología celular y molecular de la angiogénesis coronaria.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Sharma por proporcionar un entorno de investigación de apoyo. Nos gusta dar las gracias especiales a Diane (Dee) R. Hoffman, que mantiene y cuida de nuestra colonia de ratones. También nos gustaría dar las gracias a los doctores Philip J. Smaldino y Carolyn Vann por revisar a fondo el manuscrito y proporcionar comentarios útiles. Este trabajo fue apoyado por fondos de Ball State University Provost Office y Department of Biology a B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fondos a B.S, y NIH (RO1-HL128503) y The New York Stem Cell Foundation fondos a K.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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