Article de méthode

Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

DOI :

10.3791/60616

⸱

8 mars 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem pour identifier et quantifier les lipides cellulaires principaux dans saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite pour une évaluation quantitative des classes lipidiques majeures dans une cellule de levure est polyvalente, robuste et sensible.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les lipides sont des molécules amphipathiques structurellement diverses qui sont insolubles dans l’eau. Les lipides sont des facteurs essentiels à l’organisation et à la fonction des membranes biologiques, du stockage et de la production d’énergie, de la signalisation cellulaire, du transport vésiculaire des protéines, de la biogenèse d’organelle et de la mort cellulaire réglementée. Parce que la levure naissante Saccharomyces cerevisiae est un eucaryote unicellulaire favorable à des analyses moléculaires approfondies, son utilisation comme un organisme modèle a aidé à découvrir des mécanismes reliant le métabolisme des lipides et le transport intracellulaire à des processus biologiques complexes dans les cellules eucaryote. La disponibilité d’une méthode d’analyse polyvalente pour l’évaluation quantitative robuste, sensible et précise des grandes classes de lipides au sein d’une cellule de levure est cruciale pour obtenir des connaissances approfondies sur ces mécanismes. Ici, nous présentons un protocole pour utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des lipides cellulaires principaux de S. cerevisiae. La méthode LC-MS/MS décrite est polyvalente et robuste. Il permet l’identification et la quantification de nombreuses espèces (y compris différentes formes isobariques ou isomériques) dans chacune des 10 classes de lipides. Cette méthode est sensible et permet l’identification et la quantitation de certaines espèces lipidiques à des concentrations aussi basses que 0,2 pmol/L. La méthode a été appliquée avec succès à l’évaluation des lipidomes des cellules entières de levure et de leurs organites purifiés. L’utilisation d’additifs alternatifs de phase mobile pour la spectrométrie de masse d’ionisation électrospray dans cette méthode peut augmenter l’efficacité de l’ionisation pour certaines espèces lipidiques et peut donc être utilisée pour améliorer leur identification et leur quantitation.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un ensemble de preuves indique que les lipides, l’une des principales classes de biomolécules, jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus vitaux au sein d’une cellule eucaryote. Ces processus comprennent l’assemblage de bilayers lipidiques qui constituent la membrane plasmatique et les membranes entourant les organites cellulaires, le transport de petites molécules à travers les membranes cellulaires, la réponse aux changements de l’environnement extracellulaire et la transduction intracellulaire du signal, la production et le stockage de l’énergie, l’importation et l’exportation de protéines confinées à différents organites, le trafic vésicular des protéines dans le système endomémbrane et la sécrétion de protéines, et plusieurs modes de la cellule de mort réglementée1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

La levure en herbe S. cerevisiae, un organisme eucaryote unicellulaire, a été utilisé avec succès pour découvrir certains des mécanismes sous-jacents aux rôles essentiels des lipides dans ces processus cellulaires vitaux4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae est un organisme modèle précieux pour découvrir ces mécanismes parce qu’il est favorable à la biochimie complète, génétique, biologique cellulaire, biologique chimique, biologique du système biologique, et microfluidique dissection analyses21,22,23,24,25. D’autres progrès dans la compréhension des mécanismes par lesquels le métabolisme lipidique et le transport intracellulaire contribuent à ces processus cellulaires vitaux nécessite des technologies sensibles de spectrométrie de masse pour la caractérisation quantitative du lipidome cellulaire, la compréhension de la complexité moléculaire lipidome, et l’intégration de lipidomiques quantitatifs dans une plate-forme multidisciplinaire de biologie des systèmes1,2,3,26, 27,28,29,30.

Les méthodes actuelles pour la lipidomique quantitative de masse assistée par spectrométrie des cellules et des cellules de levure d’autres organismes eucaryotes ne sont pas suffisamment polyvalentes, robustes ou sensibles. En outre, ces méthodes actuellement utilisées sont incapables de différencier diverses espèces de lipides isobariques ou isomériques les unes des autres. Ici, nous décrivons une méthode polyvalente, robuste et sensible qui permet l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des lipides cellulaires majeurs de S. cerevisiae.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation de supports stériles pour la culture de la levure

  1. Préparer 90 ml d’un milieu VP complet qui contient 1% (w/v) extrait de levure et 2% (w/v) bactopeptone.
  2. Préparer 90 ml d’un milieu synthétique minimal de la BNNB contenant 0,67 % (w/v) base d’azote de levure sans acides aminés, 20 mg/L L-histidine, 30 mg/L L-leucine,30 mg/L L-lysine et 20 mg/L uracil.
  3. Répartir 90 ml du support total YP également en deux flacons Erlenmeyer de 250 ml (soit 45 ml chacun).
  4. Répartir 90 ml du milieu synthétique minimal YNB en deux flacons Erlenmeyer de 250 ml (soit 45 ml chacun).
  5. Autoclavez les flacons avec les médias YP et YNB à 15 psi/121 oC pendant 45 minutes avant utilisation.

2. Souche de levure

  1. Utilisez la souche de type sauvage BY4742(MATmd his3 '1 leu2 '0 lys2 '0 ura3 '0).

3. Levure de culture dans le milieu complet de YP avec le glucose

  1. Autoclave une solution de stock de 20% (w/v) de glucose à 15 psi/121 oC pendant 45 minutes avant utilisation.
  2. Ajoutez 5 ml de la solution stérile de 20 % (w/v) de glucose à chacun des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu stérile de YP pour une concentration finale de 2 % de glucose (w/v).
  3. Utilisez une boucle microbiologique pour inoculer les cellules de la souche de type sauvage BY4742 dans chacun des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu YP avec du glucose.
  4. Culture les cellules pendant la nuit à 30 oC avec secousses de rotation à 200 tr/min.
  5. Prenez un aliquot de la culture de levure. Utilisez un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules de levure par ml de culture.

4. Transférer la levure et les cultiver dans le milieu synthétique minimal de la BNS avec du glucose

  1. Ajoutez 5 ml de la solution stérile de 20 % (w/v) de glucose à chacun des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu stérile de YNB à une concentration finale de 2 % de glucose (w/v).
  2. Utilisez une pipette stérile pour transférer un volume de la culture de levure de nuit qui contient le nombre total de 5,0 x 107 cellules dans chacune des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu YNB avec du glucose.
  3. Culture les cellules pour au moins 24 h (ou plus, si l’expérience l’exige) à 30 oC avec secousses de rotation à 200 tr/min.

5. Préparation des réactifs, des laboratoires et de l’équipement pour l’extraction des lipides

  1. Préparer ce qui suit: 1) de haute qualité (-gt;99.9%) chloroforme; 2) de haute qualité (99,9%) méthanol; 3) 28 % (v/v) solution d’hydroxyde d’ammonium dans l’eau nano-pure; 4) perles de verre (lavées à l’acide, 425-600 m); 5) un vortex avec adaptateur approprié; 6) 15 mL tubes à centrifugeuse en verre à grande vitesse avec bouchons doublés de polytetrafluoroethylène; 7) 17:1 et 2:1 mélanges de chloroforme et de méthanol; 8) un mélange chloroforme/méthanol (2:1) avec 0,1% d’hydroxyde d’ammonium (v/v); 9) solution ABC (155 mM d’ammonium bicarbonate, pH à 8,0); 10) un mélange de normes lipidiques internes préparées dans un mélange de chloroforme et de méthanol tel qu’indiqué dans le tableau 1; et 11) flacons d’échantillon de verre de 2 ml avec des bouchons doublés de polytetrafluoroethylène pour l’extraction des lipides cellulaires.

6. Préparation des réactifs, des laboratoires et de l’équipement pour LC

  1. Préparer ce qui suit : 1) acetonitrile/2-propanol/nano-pure water (65:35:5) mélange; 2) un vortex avec adaptateur approprié; 3) un sonicateur à ultrasons; 4) flacons de verre avec inserts pour une plaque de puits; 5) un système LC équipé d’une pompe binaire, d’un degasser et d’un autosampler; 6) une colonne en phase inverse C18 (2,1 mm; 75 mm; taille de pores 130 euros; gamme de pH de 1-11) couplée à un système de pré-colonne; 7) mélange A : acétonitrile/eau (60:40); et 8) mélange B: isopropanol/acetonitrile (90:10).

7. Extraction lipidique des cellules de levure

  1. Prenez un aliquot de la culture de levure. Utilisez un hémocytomètre ou mesurez600 OD pour déterminer le nombre total de cellules de levure par ml de culture.
  2. Prenez un volume de culture de levure qui contient un nombre total de 5.0 x 107 cellules (3.3 unités OD600). Placez ce volume de culture dans un tube de microcentrifuge préchilled de 1,5 mL.
  3. Récoltez les cellules par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
  4. Ajouter 1,5 ml d’eau nano-pure glacée et laver les cellules par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
  5. Ajouter 1,5 ml de solution ABC glacée et laver les cellules par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min à 4 oC. Jetez le supernatant. La pastille cellulaire peut être stockée à -80 oC avant l’extraction des lipides.
  6. Pour commencer l’extraction des lipides, décongeler la boulette de cellules sur la glace.
  7. Réutilisez la pastille cellulaire dans 200 l’eau nano-pure glacée. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse en verre de haute résistance de 15 mL avec un bouchon doublé de polytetrafluoroethylène. Ajouter ce qui suit à ce tube : 1) 25 l de mélange de normes lipidiques internes préparées dans le mélange chloroforme/méthanol (2:1) ; 2) 100 l de 425-600 perles de verre lavées à l’acide; et 3) 600 l de mélange chloroforme/méthanol (17:1).
  8. Vortex le tube à grande vitesse pendant 5 minutes à température ambiante (RT) pour perturber les cellules.
  9. Vortex le tube à basse vitesse pendant 1 h à RT pour faciliter l’extraction des lipides.
  10. Incuber l’échantillon pendant 15 min sur la glace afin de favoriser les précipitations protéiques et la séparation des phases aqueuses et organiques les unes des autres.
  11. Centrifuger le tube dans une centrifugeuse clinique à 3.000 x g pendant 5 min à RT. Cette étape de centrifugation permet de séparer la phase aqueuse supérieure de la phase organique inférieure, qui contient toutes les classes de lipides.
  12. Utilisez une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure (400 ll) à un autre tube de centrifugeuse en verre de 15 mL avec un bouchon doublé de polytetrafluoroethylène. Ne perturbez pas les perles de verre ou la phase aqueuse supérieure pendant un tel transfert. Maintenir la phase organique inférieure sous l’écoulement du gaz azoté.
  13. Ajouter 300 L de mélange chloroforme-méthanol (2:1) à la phase aqueuse supérieure restante pour permettre l’extraction de sphingolipids et PA, PS, PI et CL. Vortex le tube vigoureusement pendant 5 min à RT.
  14. Centrifuger le tube dans une centrifugeuse clinique à 3.000 x g pendant 5 min à RT.
  15. Utilisez une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure (200 ll) formée après centrifugation à la phase organique recueillie à l’étape 7.13.
  16. Utilisez le flux de gaz azoté pour évaporer le solvant dans les phases organiques combinées. Fermez les tubes contenant le film lipidique sous l’écoulement du gaz azoté. Conservez ces tubes à -80 oC.

8. Séparation des lipides extraits par LC

  1. Ajouter 500 L d’acétyl/2-propanol/nano-pur water (65:35:5) mélange à un tube contenant le film lipidique obtenu à l’étape 7.16. Vortex le tube 3x pour 10 s à RT.
  2. Soumettez le contenu du tube à la sonication par ultrasons pendant 15 min. Vortex le tube 3x pour 10 s à RT.
  3. Prenez 100 L d’un échantillon du tube et ajoutez-le à une fiole de verre avec un insert utilisé pour une plaque de puits. Éliminez les bulles d’air dans l’insert avant de le arpenter dans le puits.
  4. Utilisez un système LC pour séparer différentes espèces lipidiques sur une colonne CSH en phase inverse C18 couplée à un système pré-colonne (voir Tableau des matériaux). Pendant la séparation, maintenez la colonne à 55 oC et à un débit de 0,3 ml/min. Conserver l’échantillon dans la plaque de puits à RT.
  5. Utilisez les phases mobiles qui se composent du mélange A (acetonitrile/eau [60:40 (v/v)]) et du mélange B (isopropanol/acetonitrile [90:10 (v/v)]). Pour un mode positif de détection des ions parentés créés à l’aide de la source d’ions d’ionisation électrospray (ESI), le mode ESI(MD), les phases mobiles A et B contiennent un format d’ammonium à la concentration finale de 10 mM. Pour un mode négatif de détection des ions parentaux, le mode ESI (-), les phases mobiles A et B contiennent de l’acétate d’ammonium à la concentration finale de 10 mM.
  6. Utilisez un volume d’échantillon de 10 L pour l’injection dans le mode ESI et ESI (-).
  7. Séparer différentes espèces lipidiques par LC à l’aide du gradient LC suivant : 0-1 min 10% (phase B); 1-4 min 60% (phase B); 4-10 min 68% (phase B); 10-21 97% (phase B); 21-24 min 97% (phase B); 24-33 min 10% (phase B).
  8. Exécuter les blancs d’extraction comme premier échantillon, entre tous les quatre échantillons, et comme dernier échantillon. Soustrayez l’arrière-plan pour normaliser les données.
  9. Un chromatogramme total représentatif d’ions provenant de données LC/MS sur les lipides extraits des cellules de la souche de type sauvage BY4742 est indiqué dans la figure 1.

9. Analyse spectrométrique de masse des lipides séparés par LC

  1. Utilisez un spectromètre de masse équipé d’une source d’ion ionaire HESI (électrospray) pour analyser les lipides qui ont été séparés par LC. Utilisez les paramètres fournis dans le tableau 2.
  2. Utilisez l’analyseur de transformation Fourier pour détecter les ions parent (MS1) à une résolution de 60 000 et dans la plage de masse de 150-2 000 Da.
  3. Utilisez les paramètres fournis dans le tableau 3 pour détecter les ions secondaires (MS2).

10. Identification et quantitation de différentes classes et espèces de lipides par le traitement des données brutes de LC-MS/MS

  1. Consultez le Tableau des matériaux pour les logiciels pour effectuer l’identification et la quantitation de différents lipides à partir de fichiers bruts LC-MS/MS. Ce logiciel utilise la plus grande base de données lipidique, contenant plus de 1,5 million de précurseurs d’ions lipidiques (MS1) et leurs ions fragmentés prévus (MS2). Le logiciel utilise également des pics MS1 pour la quantitation des lipides et MS2 pour l’identification des lipides. Un chromatogramme représentatif de deux formes de phosphatidylserine isomerique (34:0) qui ont la même valeur m/z, mais des temps de rétention différents, ainsi que leurs spectres MS1 et MS2, sont indiqués dans la figure 2, figure 3, et la figure 4, respectivement.
  2. Rechercher gratuitement des acides gras LC-MS contenant des données MS1 et des données MS2 dépendantes des données (non stéérisées), cardiolipin (CL), phytoceramide (PHC), phytosphingosine (PHS), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserine (PS), et triacylglycerol (TAG) classes lipidiques en utilisant une tolérance m/z de 5 ppm pour les ions précurseurs et 10 ppm pour les ions de produit. D’autres paramètres de recherche sont indiqués dans le tableau 4. Suivez les instructions fournies dans le manuel d’utilisation du logiciel. Les identités des normes lipidiques internes et des espèces lipidiques avec la composition inhabituelle d’acide gras doivent être vérifiées manuellement.
  3. Pour identifier et quantifier différentes classes et espèces de lipides à l’aide d’alternatives open-source librement disponibles pour le logiciel lipidique de recherche, utilisez l’analyseur de données lipidiques (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml), MZmine 2 (http://mzmine.github.io/), ou XCMS (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)logiciel pour traiter les données brutes de LC-MS/MS.

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Résultats

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Notre méthode pour une évaluation quantitative des lipides cellulaires principaux dans une cellule de levure avec l’aide de LC-MS/MS était polyvalente et robuste. Il nous a permis d’identifier et de quantifier 10 différentes classes de lipides dans les cellules de la Cérévisiae de S. cultivées dans le milieu minimal synthétique de YNB contenant initialement 2% de glucose. Ces classes de lipides comprennent les acides gras gratuits (non stérilisés) (FFA), CL, phytoceramide (PHC), ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les précautions suivantes sont importantes pour la mise en œuvre réussie du protocole décrit ici :

1. Le chloroforme et le méthanol sont toxiques. Ils extraient efficacement diverses substances des surfaces, y compris la plasticware de laboratoire et votre peau. Par conséquent, manipuler ces solvants organiques avec prudence en évitant l’utilisation de plastiques dans les étapes qui impliquent le contact avec le chloroforme et / ou le méthanol, en utilisant des pipettes en verre borosilicate p...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants aux membres actuels et anciens du laboratoire Titorenko pour les discussions. Nous remercions le Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry et le Centre for Structural and Functional Genomics (tous deux de l’Université Concordia) pour leurs services exceptionnels. Cette étude a été appuyée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (NSERC) du Canada (RGPIN 2014-04482) et du Fonds de la chaire de l’Université Concordia (CC0113). K.M. a reçu l’appui du Prix du mérite de l’Université Concordia.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
15 mL Tubes à centrifuger en verre haute vitesse avec bouchons doublés de téflonPYREX05-550
2 mL Flacons d’échantillons en verre avec bouchons doublés de téflonFisher Scientific60180A-SV9-1P
2-PropanolFisher ScientificA461-500
AcétonitrileFisher ScientificA9554
Agilent série 1100 Système LCAgilent TechnologiesG1312A
Agilent1100 Plaque de puitsAgilent TechnologiesG1367A
Acétate d’ammoniumFisher ScientificA11450
Bicarbonate d’ammoniumSigma9830
Formiate d’ammoniumFisher ScientificA11550
Hydroxyde d’ammoniumFisher ScientificA470-250
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
CardiolipinAvanti Polar Lipids750332
Centra CL2 centrifugeuse cliniqueThermo Scientific004260F
CéramideAvanti Lipides polaires860517
ChloroformeFisher ScientificC297-4
CSH C18 VanGuardEaux186006944Système de pré-colonne
Acide gras libre (19:0)Matreya1028
Perles de verre (lavées à l’acide, 425-600 &mu ; M)Sigma-AldrichG8772
GlucoseFisher ScientificD16-10
HémacytomètreFisher Scientific267110
L-histidineSigmaH8125
Logiciel de recherche lipidique (V4.1)Fisher ScientificV4.1Logiciel d’analyse LC-MS/MS
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MéthanolFisher ScientificA4564
PhosphatidylcholineAvanti Lipides polaires850340
PhosphatidyléthanolamineAvanti Lipides polaires850704
PhosphatidylglycérolAvanti Lipides polaires
PhosphatidylinositolAvanti Polar LipidsLM1502
PhosphatidylsérineAvanti Polar Lipids840028
Colonne en phase inverse CSH C18Waters186006102
SphingosineAvanti Polar Lipids860669
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
TricylglycérolLarodan, MalmöTAG Mixte FA
Sonicateur à ultrasonsFisher Scientific15337416
UracilSigmaU0750
VortexFisher Scientific2215365
Extrait de levureFisher ScientificBP1422-2
Base azotée de levure sans acides aminésFisher ScientificDF0919-15-3
Souche de levure BY4742DharmaconYSC1049
840446

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Analyse du lipidomeextraction de lipidesculture cellulaire de levurecolonne C18 en phase inverseionisation par lectrosprayadditifs de phase mobiledissociation induite par collision

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